本发明涉及基因工程
技术领域：
：，尤其涉及用于雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星标记组合及引物。
背景技术：
：：罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii，deman1879)是一种大型淡水虾，因其较广水质变化承受幅度、易养殖、肉质嫩滑、商业价值高等特点逐渐成为我国、东南亚乃至世界重要的水产养殖品种。当前，日益增长的罗氏沼虾产量仍难以满足逐渐上升的消费和市场需求，所以需进一步突破限制罗氏沼虾产量提高的因素以大大提高产额。由于雄虾较雌性生长快、成熟个头大、养殖产出量高[1]，因此，主要是在苗种培育和养殖中解决导致性别和个体差异的限制因素。人们对罗氏沼虾遗传多样性就行了研究，如不同群体遗传多样性分析。不同形态型雄虾的产生有以下原因：(1)遗传差异、变态年龄等个体内在因素；(2)空间和资源受限等环境因素引起竞争；(3)种群地位等级、领地等种群内部社会因素。近些年来，微卫星现代分子标记技术因能解决等位酶技术不能发现的细微遗传差异而广泛用于生物育种和遗传研究，具有多态性高、共显性遗传、重复性高和易检测等优点。目前，罗氏沼虾自主或者人为的长期近亲交配导致了种质退化，迫切要求对其进行鉴定区分。再加上罗氏沼虾雄性形态遗传不可控，造成了父本遗传差异精确性评估不足，严重影响了良种选育，因此利用微卫星标记技术摸清近亲交配形态型雄虾的个体生长遗传多样性有助于解决该现实问题。技术实现要素：为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了用于雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星标记组合及引物。为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：用于雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星标记组合，包括以下微卫星标记或其核苷酸序列的互补序列：微卫星标记1、微卫星标记2、微卫星标记3、微卫星标记4、微卫星标记5、微卫星标记6、微卫星标记7；其中，所述微卫星标记1的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述微卫星标记2的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述微卫星标记3的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述微卫星标记4的核苷酸序列如seqidno.4所示；所述微卫星标记5的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述微卫星标记6的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述微卫星标记7的核苷酸序列如seqidno.7所示。本发明的内容还包括：用于雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星标记组合的特异性引物组，包括：微卫星标记1的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.8和seqidno.9所示；微卫星标记2的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.10和seqidno.11所示；微卫星标记3的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.12和seqidno.13所示；微卫星标记4的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.14和seqidno.15所示；微卫星标记5的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.16和seqidno.17所示；微卫星标记6的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.18和seqidno.19所示；微卫星标记7的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.20和seqidno.21所示；本发明的内容还包括雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的试剂盒，包括上述特异性引物组。本发明提供了一种用于提供雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星位点，结果显示，所有微卫星位点均显示高度差异性，该微卫星标记组合易识别、高度多态，非常适于研究不同的近亲雄虾组遗传结构，为罗氏沼虾优质父本选育提供基础性遗传信息，同时也对调控雄性罗氏沼虾遗传发育具有一定意义，为父本选育提供遗传信息，提高苗种质量提供基础。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。【实施例1】1.1样品采集广西种群近亲交配成年雄性罗氏沼虾，200尾，由国家(广西南宁)罗氏沼虾良种中心提供，在良种中心实验室养殖池(5×5×1.8m)中养殖4个月，基于颜色、行为、生长特征及锯齿状螯，分蓝色长臂型(bcm)、橙色长臂型(ocm)、小个体型(sm)三种不同形态型雄虾。3个形态型各50尾，共收集150尾，bcm、ocm、sm体重分别为14.48±1.05g、10.04±1.15g、5.86±0.66g。1.2dna提取罗氏沼虾腹部肌肉组织基因组dna提取按照wizard基因组dna纯化试剂盒(购于美国promega公司)步骤提取，利用紫外分光光度计测定提取液在260nm和280nm的吸光值(od)，依据od260nm/od280nm比率测定dna浓度和纯度，用双蒸液定容1:40至后-20℃保存。1.3pcr扩增pcr反应液制备，共50μl：10.0μl5xpcrbuffer，5.0μlmgcl2(2.5mm)，1.0μldntp(0.2mm)，2.0μl上下游引物(0.4μm)，24.75μl无菌ddh2o2，0.25μltaq聚合酶，2.0μldna模板，灭菌去离子水补齐。dan微卫星引物设计如表1所示。表1罗氏沼虾的微卫星位点的特性table1characteristicsof8microsatellitelociform.rosenbergiif：正向，r：反向pcr反应程序为：95℃预变性3min，按照95℃变性30s进行40个循环、每对引物的实际退火温度(48-60℃)反应30s、72℃延伸30s，最后72℃延伸40s，4℃保温。pcr扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测结束后，红色凝胶染红，紫外显色。然后采用聚丙烯酰胺电泳评价pcr产物数，反应液加入含有1xtbe缓冲液的凝胶体系，在75v条件下泳动8min，然后凝胶成像系统(美国alphainnotech公司)下观察，以20bp扩展dna梯型(美国linza公司)为参考标准目测法观察等位基因分型和大小。1.4数据分析记录每个雄虾的等位基因数(a)、等位基因复制数(g)、观察杂合度(ho)、期望杂合度(he)、基于哈代-温伯格平衡定律的精确偏差值(p)，并利用arlequin3.11分析微卫星位点差异。遗传分化程度采用f统计分析，如种群等位基因频率参数(fis，fit，fst)，按照wright方法计算基因流(nm)，公式：nm＝fst0.25(1-fst)/fst.fis。用对基因nei系数法测定基因间距，基于非加权配对算数平均法利用popgen1.32软件构建系统树图。【实施例2】结果与分析2.1种群遗传多样性由表2可知，除了sm的sugbp8-109a以外，其它位点遗传信息呈多态性，所有统计分析中要移除该位点。3种形态型的雄虾种群显示高度遗传差异，bcm、ocm、sm的等位基因数分别为2.885、3.762和2.627，观察杂合度分别为0.5561、0.474和0.475。哈代-温伯格平衡定律的精确偏差值(p)采用markov链方法评估，随后被bonferroni多重假设实验校正。除了ocm的sugbp8-109a、sugbp8-109c、sugocc28-17d位点以外，其它位点显著偏移。表2三种形态型雄性罗氏沼虾卫星位点遗传多样性g：基因拷贝数，a：等位基因数，ho：观察杂合度，he：期望杂合度，p：哈代-温伯格平衡定律偏差值，--表示无多态性，**表示非常显著，++表示不显著。2.2样本遗传分化和关系由表3可知，样本fst平均值为0.2877，说明样本分化呈现显著差异。样本基因流平均值nm为0.7452，sugbp8-109d位点nm最大，为1.1074，sugbp8-109a位点nm最小，为0.2044。全部样本的fit和fis值呈显著差异(p<0.05)。由表4可知，最大基因距离位于bcm和sm，为1.0369，最小基因距离位于bcm和ocm，为0.7497。表3三组罗氏沼虾微卫星位点f统计值nm：基因流值表4基于罗氏沼虾微卫星位点nei数据的基因间距上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本
技术领域：
：的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。序列表<110>广西壮族自治区水产科学研究院<120>用于雄性罗氏沼虾遗传多样性分析的微卫星标记组合及引物<130>1<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>78<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>1gcgcggagcatagagaacgggaatctcgtgggcactcacagatgagtgggagtggccggg60gtgacagcaggatgaatg78<210>2<211>33<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>2gtgggagtggccggggtgacagcaggatgaatg33<210>3<211>53<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>3aatcggatgggagcgcggagcatagagaacgggaatctcgtgggcactcacag53<210>4<211>87<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>4caacagctgctgcttggaagcttaatcctgcaggcaaatgcaagcgcttggatgtgcctg60ctgctgctgctgatatacaaaatctga87<210>5<211>155<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>5atttcatccggttttgttccagtattgcttaatcatgaaaagaaacaacaagagcgataa60taatgatgatgatgatgatgatgatgagggtaaaaatctatgattcaagtataaatgtac120atttaaaaatagacatacttaaatatacatttata155<210>6<211>100<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>6cattaaagttttgtttcgtttttatttcatccggttttgttccagtattgcttaatcatg60aaaagaaacaacaagagcgataataatgatgatgatgatg100<210>7<211>50<212>dna<213>罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)<400>7agggtaaaaatctatgattcaagtataaatgtacatttaaaaatagacat50<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggctctctccaggaasgtc19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9agttccacctgcattcatcc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aggatgaatgcaggtggaac20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11caaaacaagacgtccccttc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12atttgcggaaggatgtgttc20<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tatgcttccggctcgtatg19<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tatcagcagcagcagagaag20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gtctgtttgtgcaggtggag20<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ggcattccgttgttgttg18<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cgctcttgttgtttcttctc20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18atttcatccggttttgttcc20<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19agctcggatccactagtaacg21<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ttgttatccgtccacaattcc21<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21attaccgcctttgagtgagc20当前第1页12当前第1页12