本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于血清exosomallncrnas的食管癌诊断特异性表达图谱及检测分析系统。
背景技术：
食管癌是全球常见的消化道肿瘤之一，严重威胁人类健康。因此，早期诊断和早期治疗是提高食管癌患者预后生存及降低死亡率的关键。目前，用于食管癌的诊断方法主要包括钡餐、胃镜、组织活检及血清传统肿瘤标志物等检查。临床上，影像学钡餐检查是食管癌早期筛查最常用的手段，但由于其敏感性低不易发现食管内微小的病变，对食管癌早期诊断具有一定的局限性；胃镜及组织活检检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在食管癌筛查中的广泛应用；目前血清中scca和cea是临床常用食管癌检查的传统标志物，但其对食管癌早期诊断的敏感性和特异性均较低。因此，寻找敏感性高和特异性好的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学食管癌诊断方法是临床亟待解决的难题。
长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类转录本长度大于200个核苷酸，缺乏编码蛋白功能的rna分子，对基因的表达调控起着关键的作用。目前，已有研究证实lncrna可在表观遗传学、转录水平、转录后水平与大分子相互结合,并在多个重要节点调控肿瘤的进展。lncrna异常表达与肿瘤的发生、发展和转移均密切相关，提示其可作为肿瘤诊断的新型生物标志物。exosome(外泌体)是一类粒径为30～150nm的脂质体囊泡，可由多种细胞分泌并在血液、尿液等其他体液中被检出，其包裹了蛋白质、mrna、微小rna、lncrna、dna及脂质等多种物质。研究发现exosome在细胞间通讯、肿瘤免疫、肿瘤治疗、组织损伤修复、疾病诊断中具有重要的意义。对不同来源的exosome携带的lncrnas进行分析并筛选其特异性的分子标志物，将为相关疾病的诊断及其发生发展的研究提供非常重要的帮助。随着exosome分离和分析检测技术的发展，越来越多分子标志物被发现，尤其是exosome中存在丰富且稳定的lncrnas作为分子标志物，通过比较分析肿瘤患者和对照组血清exosomallncrnas表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的lncrnas表达谱，有望为恶性疾病的早期诊断、预后判断提供新的依据。因此，确定食管癌lncrnas特异表达谱，筛选差异表达的lncrnas，建立食管癌血清exosomallncrnas诊断模型，有助于实现对食管癌的早期诊断。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于血清exosomallncrnas的食管癌诊断特异性表达图谱及检测分析系统，为食管癌的早期发现和早期治疗提供支持。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明目的之一，提供一种早期食管癌lncrnas特异表达谱，由表达上调的uca1和pou3f3构成。
本发明目的之二，提供一组用于检测以上所述早期食管癌lncrnas特异表达谱的引物，包括以下引物：uca1的上游引物的序列如seqidno：1所示，下游引物的序列如seqidno：2所示；pou3f3的上游引物的序列如seqidno：3所示，下游引物的序列如seqidno：4所示；内参gapdh的上游引物序列如seqidno：5所示，下游引物的序列如seqidno：6所示；
本发明目的之三，提供以上所述的引物在制备检测早期食管癌试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明目的之四，提供一种检测早期食管癌的试剂盒或生物芯片，包括seqidno：1～seqidno：6引物。
本发明目的之五，提供以上所述的试剂盒或生物芯片在制备检测早期食管癌试剂中的应用。
本发明目的之六，提供一种以上所述早期食管癌lncrnas特异表达谱检测分析系统，包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。
本发明目的之七，提供一种所述的分析系统运行方法，包括以下步骤：
(1)采用定量检测模块，获得uca1表达量数值u，pou3f3表达量数值p；
(2)将上述步骤(1)所得u和p数值输进输入模块；
(3)分析模块进行运算分析；
(4)输出模块输出1或0；其中0代表早期食管癌检测阴性；1代表早期食管癌检测阳性。
本发明首先基于临床常规收集的食管癌患者及对照者组织和血清样本筛查差异表达lncrnas的技术路径，采用“pubmed文献查阅+组织验证”的研究策略，对两组组织标本中lncrnas表达谱进行了比对分析，筛查出8个差异表达lncrnas，包括pou3f3、uca1、esccal-1、peg10、ccat2、hotair、malat-1和tug1。然后采用sybrgreen的逆转录-实时荧光定量pcr方法，对上述8个差异表达lncrnas在食管癌患者及对照血清exosome的表达丰度进行验证。通过统计学分析，pou3f3和uca1在食管癌组表达显著增高，而esccal-1、peg10、ccat2、hotair、malat-1和tug1在食管癌患者和对照血清exosome的表达不具有统计学意义。最终确定了与食管癌相关差异的2个lncrnas分子，包括表达上调uca1和pou3f3，且设计了正向反向检测引物，具体见表1。进而，提供了一种食管癌的血清exosomallncrnas特异性表达图谱检测分析模型，包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。所述分析模块利用多元logistic回归方法提供了模型的计算公式：
logit(p＝escc)＝-1.1338+0.3957*u+0.2561*p；所述u为uca1表达量数值，p为pou3f3表达量数值。
本发明取得的有益效果：
本发明以上调的uca1和pou3f3构成检测早期食管癌的特异性表达图谱，建立检测分析系统用于检测早期食管癌，对早期食管癌诊断的auc为0.805，敏感性和特异性分别为77.5％和71.2％，高于传统的scca(auc为0.636，p<0.001)。
附图说明
图1：透射电子显微镜下血清exosome形态特征。
图2：免疫印迹技术检测exosome特异性分子标志物hsp70和cd9的表达，其中exo：exosome；eds：去除exosome的上清。
图3：两种lncrnas在食管癌组和对照组中的表达，其中，a：uca1；b：pou3f3。
图4：两种lncrnas在食管癌的诊断roc曲线，其中，a：uca1；b：pou3f3。
图5：建立的诊断模型(panel)及scca对食管癌的诊断roc曲线。
图6：建立的诊断模型对不同分期食管癌的诊断roc曲线，其中，a：i-ii；b：iii。
图4、5、6中，横坐标：特异性；纵坐标：敏感性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
本发明目的之一，提供一种早期食管癌lncrnas特异表达谱，由表达上调的uca1和pou3f3构成。
进一步，所述lncrnas来自外周静脉血的血清exosome。
本发明目的之二，提供一组用于检测以上所述早期食管癌lncrnas特异表达谱的引物，包括以下引物：uca1的上游引物的序列如seqidno：1所示，下游引物的序列如seqidno：2所示；pou3f3的上游引物的序列如seqidno：3所示，下游引物的序列如seqidno：4所示；内参gapdh的上游引物序列如seqidno：5所示，下游引物的序列如seqidno：6所示；
本发明目的之三，提供以上所述的引物在制备检测早期食管癌试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明目的之四，提供一种检测早期食管癌的试剂盒或生物芯片，包括seqidno：1～seqidno：6引物。
本发明目的之五，提供以上所述的试剂盒或生物芯片在制备检测早期食管癌试剂中的应用。
本发明目的之六，提供一种以上所述早期食管癌lncrnas特异表达谱检测分析系统，包括定量检测模块、输入模块、分析模块和输出模块。
进一步，所述定量检测模块包括：所述定检测模块采用以上所述引物外周静脉血的血清exosomaluca1和pou3f3表达量，采用2-△△ct方法分别进行分析，得uca1表达量数值u，pou3f3表达量数值p。
进一步，所述分析模块包括logit模型计算和roc曲线分析；所述logit模型为：
logit(p＝escc)＝-1.1338+0.3957*u+0.2561*p；所述u为uca1表达量数值，p为pou3f3表达量数值。
本发明目的之七，提供一种所述的分析系统运行方法，包括以下步骤：
(1)采用定量检测模块，获得得uca1表达量数值u，pou3f3表达量数值p；
(2)将上述步骤(1)所得u和p数值输进输入模块；
(3)分析模块进行运算分析；
(4)输出模块输出1或0；其中0代表早期食管癌检测阴性；1代表早期食管癌检测阳性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例一
1、研究对象
血清标本均来自经受试者同意的159例食管癌患者和159例排除食管癌的对照者。所有食管癌患者均来自山东大学齐鲁医院胸外科住院患者，均为首次诊断为食管癌，其病理类型均经术后病理检查确认。所有血清标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。标本采集经山东大学齐鲁医院医学伦理会委员会批准，患者及家属知情同意。
2、标本采集及处理
采集血清3ml，立即1600g离心5min，然后16000g离心10min，将分离上清液部分用于scca的检测，另外一部分保存于-80℃待测。另外收取胸外科食管癌患者的肿瘤与对照组织48对，保存在液氮以备后续的提rna。
3.血清exosome的提取
按照美国sbi公司血清exosome抽提试剂盒说明书进行,具体步骤按照试剂盒说明书操作。250μl血清中加入63μl的exoquicktmprecipitationsolution试剂；上下颠倒5次混匀后，4℃静置30min；室温1500g离心30min，弃上清液，再次1500g离心5min，洗弃上清液，收集exosome沉淀，并将沉淀保存于-80℃冰箱中，以备后续的rna及蛋白的提取，以及电子显微镜下检测exosome的粒径。
4.电子显微镜检测exosome的形态和粒径
取一干净的100目载样铜网置于封口膜上，将新鲜得到的exosome溶液20μl用等体积pbs稀释后滴加到铜网上，室温静置1min，室温晾干。然后用3％磷钨酸钠溶液20μl滴到铜网上负染，1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去。将铜网放到透射电镜下观察，拍摄。
5.westernblot检测exosome表面标志物hsp70和cd9的表达
在收集获得的exosome沉淀中加入200μlripa裂解液，混匀后，冰上静置30min；4℃12000g离心30min；将上清液转移至新的ep离心管内，注意不要接触沉淀；bca试剂盒鉴定蛋白浓度；加入上样缓冲液(2×laemmlibuffer)，混匀后95℃煮沸5min；冰上冷却；行12％sds-page进行蛋白分离，将分离后的蛋白转移至pvdf膜上，用含5％bsa封闭液室温封闭处理1h，分别加入一抗[鼠抗人cd9单克隆抗体(体积稀释比为1∶1000)和鼠抗人hsp70单克隆抗体(体积稀释比为1∶1000)]，4℃反应过夜，tbst洗膜(5min×3次)后加入相应的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠igg)，室温反应1h，tbst洗膜(5min×3次)后，使用dab进行显色，拍照记录检测结果。
6.rna的提取及逆转录
用qiazol裂解液(qiagen公司)提取食管癌患者及体检健康者血清exosome中总rna，nanodrop2000超微量分光光度计检测rna浓度和纯度，取吸光度(a260/280nm)为1.8～2.0的rna样本，按逆转录试剂盒说明书操作将rna逆转录为cdna，均置-20℃保存。
7、实时荧光定量pcr
采用cfx96实时荧光定量pcr仪进行分析(bio-rad公司)。
pcr反应体系(25μl)：
模板dna：2ul
sybrpremixextaqii：12.5μl
dyeii：0.5μl
上游引物(10μm)：1μl
下游引物(10μm)：1μl
无菌水：8μl
反应条件为：95℃30秒→1个循环；(95℃5秒，60℃34秒)→45个循环；添加溶解曲线。
每个标本均重复测定三次，lncrna表达量采用2-δδct进行分析。
8、检测血清scca的水平
按照cobose601电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒说明书操作检测各研究对象血清scca的表达水平。scca参考范围为0～1.5ng/ml。
9、数据处理与统计学分析
通过spss19.0软件对数据进行统计学分析，使用mann-whitneyu非参数检验比较两组样本间lncrnas的浓度差异，p<0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立lncrnas诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断效能采用roc曲线及曲线下面积auc分析。
10、检测结果
1)检测exosome的形态和粒径
透射电子显微镜下观察结果(图1)显示，exoquick试剂盒抽提得到的exosome的粒径大小较为均一，约为100nm，与文献中报道的30～150nm基本一致，呈圆形囊泡状。
2)exosome特异性分子标志物的表达
从食管癌患者血清中提取的囊泡均exosome特异性分子标志物hsp70和cd9，进一步证明了该囊泡状物可能为exosome，见图2。
3)经文献查找和食管癌组织验证，共筛选8个差异表达的lncrnas包括pou3f3、uca1、esccal-1、peg10、ccat2、hotair、malat-1和tug1。
4)上述8个lncrnas经rt-qpcr验证，以平均cq值小于35且检测率大于75％；在食管癌组和对照组表达差异具有统计学意义，即p<0.05为入选标准，共确定出2个差异表达的lncrnas，包括uca1和pou3f3。检测引物为公司设计，其序列如表1所示(如seqidno：1～4所示)。
表1引物序列
5)如图3所示，uca1和pou3f3在食管癌组表达显著增高。建立上述2个lncrnas各自诊断食管癌的roc曲线，如图4所示。
6)将上述2个lncrnas带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为logit(p＝escc)＝-1.1338+0.3957*u+0.2561*p；所述u为uca1表达量数值，p为pou3f3表达量数值。经roc曲线分析，此模型对食管癌的诊断效能auc为0.805，敏感性和特异性分别为77.5％和71.2％，高于传统的scca(auc为0.636，p<0.001)，如图5所示。
7)利用该诊断模型对食管癌分期为i-ii，iii的患者进行分析，其诊断i-ii，iii患者的auc分别为0.809和0.798，如图6所示。说明该模型能够实现对食管癌的早期诊断。
sequencelisting
<110>山东大学第二医院
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