本发明涉及动物遗传标记筛选技术领域，具体涉及hbegf基因片段作为猪繁殖性状相关的遗传标记。所述的遗传标记分离自hbegf基因片段。本发明还包括所述的遗传标记在猪辅助选择关联分析中的应用。
背景技术：
繁殖性状是猪的重要经济性状，主要包括初生窝重、总产仔数、健仔数和弱仔数等，是典型的由微效多基因控制的数量性状，并且受环境影响。利用分子标记辅助选择(markerassistedselection，mas)技术，通过对繁殖性状基因或与之连锁的遗传标记的选择，实现对控制性状的数量性状基因座位(quantitativetraitloci，qtl)的选择，寻找对繁殖性状有明显效应的主效基因，进而应用于猪繁殖性状的改良，对于培养优良品种具有重要的意义。
猪分子育种的研究和应用也在快速发展，并发现了一些与生产性状有关联的基因，并定位了繁殖性状相关的数量性状基因座(qtl)。其中，猪产仔数的qtl定位在ssc4、ssc7、ssc11、ssc12、ssc14、ssc17等；猪初生重qtl位于ssc1、ssc12、ssc13上。
肝素结合表皮生长因子(heparinbindingegflikegrowthfactor，hbegf)是表皮生长因子家族中的一员，能够直接调控胚胎着床，是着床期很重要的细胞因子[1]。有研究报道，在人的子宫内膜间质中，hbegf蛋白表达在增殖后期显着增加，而在分泌早期则显着降低[2]。das等[3]则证实hbegf高表达于胚泡植入部位的子宫内膜，而在假孕小鼠的子宫内膜内低表达。而hbegf的高表达与胚胎着床有关[4]，能够直接介导胚胎的定位和植入[5]。另外，通过全基因组关联分析(genomewideassociationstudy，gwas)在2号染色体上筛选一个了与妊娠期相关的区域，并定位在hbegf基因[6]。这些研究结果说明hbegf基因对于猪的繁殖能力有一定的影响。在本发明中，申请人克隆了大白猪hbegf基因序列，发现该基因在大白猪群体中存在一个snp位点。推测此snp位点与大白猪繁殖性状差异显著。
技术实现要素：
本发明的目的在于客服现有技术的缺陷，筛选一种与猪繁殖性状关联的遗传标记。通过克隆大白猪hbegf基因包含第一外显子以及第一内含子在内的序列，运用直接测序法寻找snp位点，并通过sequenom质谱法进行基因分型，分析该突变位点与大白猪繁殖性状的关联性。从而为猪的繁殖性状建立新的标记辅助选择位点。
本发明获得了大白猪hbegf基因第六外显子与第五内含子序列片段(即hbegf基因的部分核苷酸序列)，该片段长度为826bp，其核苷酸序列如序列表seqidno：1所述，通过在ncbi网站对上述序列进行blast比对，在该扩增片段内发现一处核苷酸多态性(snp)位点，该snp位点如图2所示。其突变位点具体在该序列274bp处，(即在该序列的第274位碱基处，发生一个等位基因的突变)。申请人将在本说明书中涉及到该突变的位点都命名为t274c。
选择大白猪为试验材料，从猪血液中提取全基因组dna，根据ncbi数据库公布的猪hbegf基因序列(基因登陆号见实施例1所述)设计引物对，该引物对的dna序列如下所示：
正向引物：5’-aaccgacagacggagtgaacgaga-3’，
反向引物：5’-ccagggcgagaaagacaacagga-3’。
上述引物对可对seqidno:1所述的遗传标记和对hbegf基因片段(该片段的核苷酸序列如seqidno：1所示)进行分型。
利用该引物对进行pcr扩增、pcr产物的纯化、克隆测序和序列比对分析。筛选得到一种与猪繁殖性状关联的遗传标记，该遗传标记的核苷酸序列如下所示(r旁的括号内为突变位点)：
aaccgacagacggagtgaacgagagaggcgccgggcagccgcgagctccccgcacatcccagccaggcctgcaccccaaggccggcagcagatcgtgcccggcggggtctcctgcgctctgcccgccccggctcccgtgccagcgcccagctcccgccgccgcctctaaagtgatcgctgcctcgccgcctccgcccggcccgggaccatgaagctgctgccgtcggtggtgctgaagctctttctggctgcaggtaggagggctgctgccgcr(t/c)
cccgggggtcggtcgggggggatggggacgctctgccggggggcacggagggagatcgctgctgcgtccccggcgcgggccacttggtggggcccgtgttccctggcgggcgggcgccggctgcggtacgtagcgacgggggtctgggcggggggtctgatgcggccttgcccctcacccgcagtgttctcggcgctggtgaccggcgagagcctggagcgcctgcggagggggctggcggatggaaccagcaatctggtctcccctaccgaatctacggaccagctgctgcccccgggaggtggccgaggccgggaagtcctggacttggaagaggcagacctggaccttttgagaggttagtgctggggctgtccgtccttggaccttggtgggcagttgaagaataagtggatctggcaaggatgctgcttgcacacacctgcggtttgggggttttcagggagggaggacttcaaggaaaagccccttggcctgccaagctccctgggggatcctagaatgtaggtcctgttgtctttctcgccctgg
上述序列中274位碱基处的r是t或c，该突变导致hbegf基因多态性。
本发明提供了一种筛选猪繁殖性状相关联的遗传标记的方法，所述的方法包括以下步骤：
从大白猪血液中提取基因组dna，根据猪hbegf基因的基因组序列设计引物，该引物对的dna序列如seqidno：2和seqidno：3所示，用所述的引物对在猪基因组dna中进行pcr扩增，通过直接测序法，得到导致hbegf基因多态性的核苷酸序列；利用sequenom质谱法对样本进行分型，hbegf基因的部分核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，在序列表seqid：1所示碱基的第274处存在一个t/c碱基突变(即等位基因突变)，利用该突变位点作为遗传标记对大白猪繁殖性状进行关联分析。
本发明提供了检测上述序列t274c变异的基因型分型方法。
进一步，本发明提供了利用sequenom质谱法确定不同基因型个体与泌乳性状之间关联分析的应用。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表seqidno：1是大白猪hbegf基因的部分核苷酸序列(序列表seqidno:1的274bp处的碱基为突变(替换)后的碱基“t”)，即作为本发明的遗传标记的核苷酸序列。在该序列的第274位碱基处产生一个等位基因的突变位点，即由“t”突变为“c”。
序列表seqidno：2和seqidno：3是扩增hbegf基因的引物对的dna序列，该引物对的序列也是检测本发明遗传标记的引物对。
图1：本发明的技术流程图。
图2：大白猪hbegf基因的核苷酸序列和突变位点示意图。在序列的第274位碱基处r的括号内的t/c突变位点是导致hbegf基因多态性的特异性位点。
具体实施方式
实施例1：猪hbegf基因第一外显子与第一内含子部分区域dna片段的获得及snp检测方法的建立
试验选择大白猪，根据猪hbegf基因组序列(登陆号geneid:397564)设计如下引物对，具体序列如下：
正向引物：5’-aaccgacagacggagtgaacgaga-3’
反向引物：5’-ccagggcgagaaagacaacagga-3’
利用上述引物对在大白猪基因组dna中进行pcr扩增。
pcr反应体系见表1所示。
表1pcr反应体系
pcr反应条件见表2所示。
表2pcr反应条件
将所得的pcr产物进行纯化和克隆后进行序列测定，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析，发现在该序列中第274位碱基处存在一个t/c碱基突变(碱基替换)，该突
变引起hbegf基因的多态性。
实施例2：本发明的遗传标记与水牛泌乳性状的关联分析及应用
为了确定猪hbegf基因内含子区域内的snp与猪表型差异是否相关，选择大白猪(样本数为383头)为试验材料，样本采集及其数据收集于浙江开盛生态农业发展有限公司，采用sequenom质谱法进行多态性检测，并分析猪hbegf基因内含子区内不同基因型与猪繁殖性状的相关关系。采用sas统计软件中混合线性模型(mixed)，进行基因型与表型值之间的关联分析，模型如下：
yijkl＝u+gi+pj+yksl+εijkl
式中，yijkl，性状观察值；u为性状总平均值；gi为基因型效应；pj为胎次效应及固定效应；yksl为第k个季度效应；εijkl为随机误差，假定服从n(0，σ2)分布。
对大白猪hbegf基因内含子区域t274c位点的多态性检测，在这两个群体中均检测到两种基因型，基因型频率及分布情况如表3所示。
表3大白猪hbegf基因基因型频率和等位基因频率
注：表3括号外的为个体数，括号内的为基因型频率。
表4大白猪hbegf基因t274c位点的多态性与繁殖性状的关联分析
数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著。
注：上表中“±”前的数值表示平均数；“±”后的数值表示标准误。
由表4可以看出，hbegf基因第一内含子区域t274c位点的多态性在大白猪中与初产母猪的初生窝重性状
具有显著相关性(p<0.05)，与经产母猪的初生窝重、健仔数、弱仔数具有极显著相关性(p<0.01)，且在初产母猪以及经产母猪中，tc基因型的初生窝重要显著高于tt基因型；经产母猪tc基因型的健仔数显著高于tt基因型，tc基因型的弱仔数显著低于tt基因型。初产母猪的健仔数和弱仔数与t274c位点虽无显著性，但tc基因型仍然要优于tt基因型，具有一定的研究价值。从遗传稳定性和遗传进展方面来讲，tc基因型对于增加猪初生窝重和健仔数以及降低弱仔数具有明显优势。综合以上结果，本发明的位点可作为提高大白猪繁殖性状的潜在遗传标记。
主要参考文献
1、iidjr,sterndf.specificitywithintheegffamily/erbbreceptorfamilysignalingnetwork[m]//bioessays.1998:41–48；
2、leachre,khalifar,ramireznd,etal.multiplerolesforheparin-bindingepidermalgrowthfactor-likegrowthfactoraresuggestedbyitscell-specificexpressionduringthehumanendometrialcycleandearlyplacentation[j].journalofclinicalendocrinology&metabolism,1999,84(9):3355；
3、dimitriadise,whiteca,jonesrl,etal.cytokines,chemokinesandgrowthfactorsinendometriumrelatedtoimplantation.[j].humanreproductionupdate,2005,11(6):613；
4、wirstleinpk,mikoナbjczykm,skrzypczakj.correlationoftheexpressionofheparanaseandheparin-bindingegf-likegrowthfactorintheimplantationwindowofnonconceptualcycleendometrium.[j].foliahistochemicaetcytobiologica,2013,51(2):127；
5、jessmonp,leachre,armantdr.diversefunctionsofhbegfduringpregnancy[j].molecularreproduction&development,2009,76(12):1116；
6、hidalgoam,lopesms,harliziusb,etal.genome‐wideassociationstudyrevealsregionsassociatedwithgestationlengthintwopigpopulations[j].animalgenetics,2016,47(2):223。
序列表
<110>华中农业大学
<120>hbegf基因片段作为猪繁殖性状相关的遗传标记
<141>2018-05-22
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>826
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(826)
<220>
<221>mutation
<222>(274)..(274)
<400>1
aaccgacagacggagtgaacgagagaggcgccgggcagccgcgagctccccgcacatccc60
agccaggcctgcaccccaaggccggcagcagatcgtgcccggcggggtctcctgcgctct120
gcccgccccggctcccgtgccagcgcccagctcccgccgccgcctctaaagtgatcgctg180
cctcgccgcctccgcccggcccgggaccatgaagctgctgccgtcggtggtgctgaagct240
ctttctggctgcaggtaggagggctgctgccgcccccgggggtcggtcgggggggatggg300
gacgctctgccggggggcacggagggagatcgctgctgcgtccccggcgcgggccacttg360
gtggggcccgtgttccctggcgggcgggcgccggctgcggtacgtagcgacgggggtctg420
ggcggggggtctgatgcggccttgcccctcacccgcagtgttctcggcgctggtgaccgg480
cgagagcctggagcgcctgcggagggggctggcggatggaaccagcaatctggtctcccc540
taccgaatctacggaccagctgctgcccccgggaggtggccgaggccgggaagtcctgga600
cttggaagaggcagacctggaccttttgagaggttagtgctggggctgtccgtccttgga660
ccttggtgggcagttgaagaataagtggatctggcaaggatgctgcttgcacacacctgc720
ggtttgggggttttcagggagggaggacttcaaggaaaagccccttggcctgccaagctc780
cctgggggatcctagaatgtaggtcctgttgtctttctcgccctgg826
<210>2
<211>24
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<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(24)
<400>2
aaccgacagacggagtgaacgaga24
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(23)
<400>3
ccagggcgagaaagacaacagga23