本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种菠萝泛菌的pcr检测方法。
背景技术：
植物病原细菌pantoeaananatis(serrano1928)，属原核生物界procaryotae，薄壁菌门gracilicutes，变形菌纲gammaproteobacteria，肠杆菌科enterobacteriaceae。自1928年首次在菲律宾报道p.ananatis引起菠萝的果实腐烂以来，已经发现p.ananatis是包括单子叶植物和双子叶植物在内的很多植物的病原菌，在适宜的环境条件下会引起寄主植物的突发性病害，p.ananatis在自然界的分布很广，它不仅是植物的共生细菌、内生细菌、致病菌，还在不同的生态小环境(ecologicalniches)中起不同寻常的作用，例如有报道称它可以作为腐生菌。
已报道p.ananatis至少在11个国家引起10多种植物的病害，造成严重的经济损失。p.ananatis可以导致总叶面积50％或更多的叶片萎蔫；可以致使洋葱产量损失达到100％；而被p.ananatis严重侵染的玉米叶片干枯，进而导致果实的重量和体积严重减少；被p.ananatis感染的桉树死亡或产生多干现象，很多不同的桉树品种都可以被p.ananatis侵染。p.ananatis还可以导致哈密瓜、白兰瓜和洋葱收获后果实的腐烂。已知p.ananatis的传播方式有通过花或昆虫、机械等造成的伤口侵染，以及在大风中植物与植物之间的接触传播。研究发现洋葱、苏丹草和水稻种子可以携带并传播p.ananatis。另外，p.ananatis引起不同植物感病的严重程度受到环境因素的影响。如果寄主植物是桉树和玉米，气候温暖(温度在20-25℃)和高湿度条件下发病率高且危害严重。如果寄主是苏丹草，发病的最适条件为温度32℃和高湿度；寄主为洋葱，发病的最适条件在温度为28-35℃，高湿度的条件下，洋葱球茎的形成过程中，可以分离到大量的p.ananatis。
玉米是我国三大粮食作物之一，近年来我国玉米的种植面积稳居第一位。随着全球气候变化、耕作方式改变和新品种推广，我国玉米病害的发生也有所改变，一些病原细菌引起的叶斑病有逐年加重发生的趋势，感病品种既涉及普通玉米，也涉及甜糯玉米。其中，由植物病原细菌菠萝泛菌p.ananatis引起的玉米细菌性斑点病，在我国的主要玉米产区呈上升趋势，该病可以造成玉米叶片大面积枯死。玉米细菌性斑点病具有传播快，发病快、难防控的特点，对玉米生产造成了很大的损失。目前，还没用一种可以直接从植物材料等组织或环境中，快速特异准确的检测到p.ananatis的方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种菠萝泛菌的pcr检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种菠萝泛菌的pcr检测方法，其特征在于，以菠萝泛菌的基因组dna作为pcr反应模板进行pcr反应；pcr反应体系为：10×pcrbuffer2.5μl；10mmdntp1.0μl；10mm上游引物panits2-1f1.0μl；10mm下游引物panits2-1r1.0μl；模板dna1.0μl；2.5u/mltaq酶0.5μl；ddh2o18.0μl；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火15s，72℃延伸25s，25个循环；
所述上游引物panits2-1f为：5’-tcgcctgattatacaatctcaccttca-3’；
所述下游引物panits2-1r为：5’-gtgggttgtgaggttaagcgactaa-3’。
本发明是根据菠萝泛菌pantoeaananatis的itsrdna序列中的一条537bp的序列，设计了该菌株的特异性引物对panits2-1f/panits2-1r，该引物可以将菠萝泛菌与其他植物病原细菌区分开，基于该引物开发的pcr检测方法可以用于菠萝泛菌的快速检测，该方法能够快速特异准确的检测到植株材料中的菠萝泛菌，为玉米细菌斑点病的早期诊断、检疫和病害的早期预警提供了一种方法，也可为该菌株在其他环境中的快速检测提供一种方法。
附图说明
图1为菌株yb022、yb102itsrdna扩增结果；
图中：m:100bpdnamarker；泳道1:yb022；泳道2:yb102
图2为pcr扩增鉴定重组质粒结果；
图中：m:100bpdnamarker；泳道1、2:yb022692bp片段的重组质粒；3、4:yb022466bp片段的重组质粒；5、6:yb022537bp片段的重组质粒；7-9：yb102692bp片段的重组质粒；10:蓝斑；11:阴性对照
图3为在its-2上设计特异性引物。
图4为pcr扩增检测引物特异性结果；
图中：m:100bpdnamarker；1:yb022；2:p.agglomerans；3:p.agglomerans；4：e.amylovora；5:e.amylovora；6:cmn；7:a.avenae；8:s.maltophilia；9p.syringae；10e.carotovoravar.carotovora；11b.subtilis12:control。
图5为特异性引物扩增yb022菌悬液的灵敏度
图中：m:100bpdnamarker；1-7浓度依次为：2×109～2×103cfu/ml；8:阴性对照。
图6为特异性引物扩增yb022基因组dna的灵敏度；
图中：m:100bpdnamarker；1-5浓度依次为:160ng/μl～0.016ng/μl；6:1.6pg/μl；7:0.16pg/μl；8:阴性对照。
图7为特异性引物扩增供试菌株；
图中：m:d2000dnamarker；泳道1-14:yb022、yb037、yb059、yb060、yb061、yb062、yb084、yb094、yb104、yb106、yb107、yb113、yb114、yb151。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
菌株rdna-its的扩增及测序
1材料与方法
1.1供试菌株
yb022及33株其它对照菌株(表1)
1.2细菌基因组dna的提取
采用细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)，购于天根生化科技(北京)有限公司。
1.3细菌its序列扩增
采用细菌its通用引物l1/l2对供试菌株的its序列进行扩增。
l1：5'-agtcgtaacaaggtagccgt-3'
l2：5'-gtgccaaggcatccacc-3'
引物序列由上海生工生物程技术服务有限公司合成。
1.4its序列pcr扩增体系及条件
取6μl扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为2％，电泳缓冲液为1×tbe，恒定电压为150v，电泳30min。取出凝胶放进凝胶成像设备检测pcr产物。
(1)pcr反应体系
(2)pcr反应条件
1.5its序列pcr产物克隆
1.5.1pcr产物的纯化与回收
从琼脂糖凝胶上切取目标片段，用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司，纯化与回收目标片段。
1.5.2pcr产物与载体的连接
回收纯化的pcr产物与pgem-teasy质粒载体(购于promega公司)连接，使用前短暂离心装有载体和对照的离心管，混匀2×rapidligationbuffer。标准的10μl连接反应体系为：
连接体系混匀后4℃过夜连接。
1.5.3连接产物的转化
(1)取一管－70℃保存的100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后，轻弹离心管壁将细胞均匀悬浮，将其分装于两个1.5ml离心管中，每管50μl感受态细胞；
(2)用冰预冷的枪头加5μl连接产物于50μl感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min；
(3)将离心管放入42℃水浴锅中热激60～90s，不要摇动；快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min；
(4)每管加250μllb培养基混匀，置于37℃，150rpm摇床振荡培养，温育45min使细菌复苏；
(5)准备含70μg/ml氨苄青霉素的lb平板，加40μlx-gal，8μliptg，涂布均匀；
(6)将100μl已转化的感受态细胞涂布于上述平板上，直至涂干；
(7)倒置平板，于37℃培养17h至长出明显的蓝白斑。
1.5.4重组质粒的pcr鉴定
挑取白斑接种于含氨苄青霉素70μg/ml的500μllb培养液中，37℃，200rpm振荡培养6h，以菌液作为pcr反应模板进行扩增，筛选阳性克隆。
(1)pcr反应体系
(2)pcr反应条件
1.6核苷酸序列的测定与分析
将阳性克隆菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测得的its序列输入genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中，利用引物设计软件beacondesign7.2设计特异性引物以便与其他菌株区分开。该软件可以直接与ncbi数据库连接，进行blast分析。
2结果与分析
2.1病原菌的its序列扩增及纯化
采用its通用引物l1/l2扩增yb022，扩增产物有三条，大小为400～700bp的条带(图1)，它们都是its区域扩增产物，但由于每个片段中所含trna基因的多少不同而扩增出的产物大小不一。将这三条片段分别切胶回收纯化。再经过琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的产物只有一条条带，可以用于下一步的克隆测序。
2.2病原菌的its序列克隆
挑取白斑于500μl含70μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm摇床振荡培养6h后直接作为pcr反应的模板，用引物l1/l2进行扩增，其反应条件及反应体系与itspcr一致。pcr产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，挑选阳性克隆。
2.3病原菌的its序列测定及分析
利用通用引物扩增得到三条its序列，测序后大小分别为692bp、537bp和466bp，将它们在ncbi中blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比对得知，该序列位于16s–23srdna区域，其中its-2(537bp)与pantoeaananatislmg20103(cp001875.2)的相似性为99％。
实施例2
菌株特异性引物的设计及检测
1材料与方法
1.1特异性引物的专一性检测
用于特异性引物专一性检测的pcr反应中以yb022和33株其它对照菌株的基因组dna作为pcr反应模板。
(1)pcr反应体系
(2)pcr反应条件
反应结束后，取6μl扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×tbe，恒定电压为150v，电泳30min。取出凝胶放进凝胶成像设备观察照相。
表1供试细菌菌株
注：cgmcc：中国普通微生物菌种保藏中心；cfcc：中国林业微生物菌种保藏管理中心
1.2特异性引物的灵敏度测定
1.2.1供试菌株：yb022。
1.2.2不同浓度的细菌菌悬液和基因组dna的准备
将浓度为2×109cfu/ml(紫外分光光度计测浓度)的纯培养的菠萝泛菌悬浮液以10倍梯度稀释6次，分别为2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103cfu/ml，取5μl悬浮液，作为pcr扩增模板；将浓度为160ng/μl的菠萝泛菌基因组dna以10倍梯度稀释6次，分别为160、16、1.6、1.6×10-1、1.6×10-2、1.6×10-3、1.6×10-4ng/μl，取5μl进行pcr反应。
将浓度分别为2×107、2×105、2×104、2×103、2×102cfu/ml的菌悬液取50μl涂布于lb平板上，每个浓度做三个重复，放于30℃恒温箱中培养48h后计数长出的单菌落数。
2结果与分析
2.1特异性引物的设计与合成
根据537bp的its序列，利用引物设计软件beacondesign7.2设计特异性引物，该软件可以直接与ncbi数据库连接，进行blast分析，设计得到一对yb022的特异性引物：panits2-1f/panits2-1r，panits2-1f：5’
-tcgcctgattatacaatctcaccttca-3’；panits2-1r：5’
-gtgggttgtgaggttaagcgactaa-3’。分析结果如图3所示：图中有灰色背景的为与ncbi中同源部分；箭头表示的是引物的位置。
2.2引物对panits2-1f/panits2-1r的特异性检测
引物对panits2-1f/panits2-1r从目标菌yb022中扩增出1条明显的大小为363bp的产物，非p.ananatis参试菌株均无扩增条带(表3、图4)。扩增产物带型清晰，结果稳定，说明引物panits2-1f/panits2-1r具有很高的特异性，在实际应用中仅需根据扩增产物的有无便可对目标菌yb022进行检测。
表3特异性引物pcr扩增结果
注：“+”代表特异性扩增为阳性；“－”代表特异性扩增为阴性。
2.3引物对panits2-1f/panits2-1r的灵敏度检测
用引物对panits2-1f/panits2-1r对菌株yb022系列浓度稀释的菌悬液和基因组dna模板进行pcr扩增，结果表明，检测病原菌菌悬液的限度为2×105cfu/ml，也就是说只要5μl模板的反应体系中有200个细菌，通过pcr就可检测得到；检测病原菌基因组dna的限度为16pg/μl。
实施例3保存玉米细菌性叶斑病病菌的特异性检测
1材料与方法
1.1供试菌株
通过观察分离物的菌落形态，用特异性引物pcr扩增分离保存的玉米细菌性叶斑病分离物中与yb022菌落形态相似的菌株，共62株(见表2)。
1.2细菌基因组dna的提取
沸水浴法提取细菌基因组dna。
(1)吸取2ml培养好的菌悬液于2ml灭菌离心管中，12,000rpm离心1min收集菌体，倒掉上清；
(2)用ddh2o(每次200μl)洗涤两次后，加入适量玻璃珠及2mlddh2o，剧烈振荡至菌体彻底悬浮，沸水煮15min后，可直接作为pcr反应模板。
1.3特异性引物pcr扩增病原物
(1)pcr反应体系
(2)pcr反应条件
表2供试细菌菌株
2结果与分析
2.1用特异性引物扩增检测分离保存的部分玉米细菌性叶斑病菌
用引物对panits2-1f/panits2-1r扩增后，在挑选出的与yb022菌落形态相似的64株菌株中有25株有扩增条带(表4、图7)，初步将这25株菌鉴定为p.ananatis。
表4特异性引物pcr扩增结果
注：“+”代表特异性扩增为阳性；“－”代表特异性扩增为阴性。
note:“+”meansthepositiveamplificationwiththespecificprimer；“－”meansthenegativeamplificationwiththespecificprimer。
本具体实施克隆并测序了病原菌p.ananatis的its序列，并在此区段设计了p.ananatis的种特异性引物对panits2-1f/panits2-1r，建立了病原菌的分子检测体系，检测灵敏度达到2×105cfu/ml细菌细胞和16pg/μl基因组dna。经特异性引物对panits2-1f/panits2-1r扩增保存的与p.ananatis菌落形态和培养性状相似的玉米细菌性叶斑病病原菌，其中有25株扩增出363bp的特异性条带，因此初步得出我国北京、河北、广东、海南、贵州和宁夏均有pantoeaananatis引起的玉米斑点病发生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。