本发明涉及动物模型建立
技术领域：
，特别是涉及一种sgrna及其制备的gal抗原缺失兔子模型和应用。
背景技术：
：已有研究显示，异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1，3-galactosyle，α-gal，即：gal抗原)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。gal抗原是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪、兔子等低等动物体内。gal抗原主要受α-1，3半乳糖基转移酶(α1，3-galactosyltransferase，α-1，3gt或者ggta1)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖基转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗-gal抗体(占总血清球蛋白的1～5％)，因此当人体接受含有gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。国际上早在90年代就有通过构建ggta1基因敲除小鼠，来研究gal抗原相关的免疫学反应，探讨不含gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。在1996年，rgtearle等报告了ggta1基因敲除小鼠模型的成功制作方法。之后开始有报告使用ggta1基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。这些研究提示ggta1基因敲除小鼠模型对gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。在2000年初研究者们开始了ggta1基因敲除猪的研究，甚至ggta1基因敲除牛的研究，期望能够直接从ggta1基因敲除猪或牛获得没有gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫排斥反应。然而，目前还没有成功制备ggta1基因敲除兔子的报道，亟需一种可用于猪、牛等异种组织/器官移植和动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究的ggta1基因敲除gal抗原缺失兔子模型。技术实现要素：基于此，有必要针对上述问题，提供一种sgrna及其制备的gal抗原缺失兔子模型和应用，该模型可用于猪、牛等异种组织/器官移植和动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究；可作为动物源性生物材料/医疗产品的人体植入反应试验模型和植入后组织再生、修复、重建的有效性评价模型；可用于膜类动物源性生物材料/医疗产品的钙化试验研究。一种用于gal抗原缺失兔子模型制备的sgrna，所述sgrna为针对兔物种基因组编号为loc100348435的第8外显子的正链及互补链上满足(n)20agg序列模式的序列部分分别设计得到的识别序列，所述sgrna分别记为第一sgrna识别序列和第二sgrna识别序列；其中，所述第一sgrna识别序列与所述第8外显子的互补链上序列(n)20agg一致，所述第二sgrna识别序列与所述第8外显子的正链上序列(n)20agg一致，n为a、t、c或g，下标20表示n的个数。打靶序列的选择和设计是打靶成功与否的关键，针对兔物种的ggta1功能区，本发明人通过大量的信息比对和筛选，通过分析兔物种基因组编号为loc100348435的编码序列，包括exon1:16-286(271bp)，exon2:34958-35072(115bp)，exon3:41258-41346(89bp)，exon4:48906-48941(36bp)，exon5:51613-51678(66bp)，exon6:52163-52279(117bp)，exon7:59218-59355(138bp)，exon8:63151-63844(694bp)等8个外显子，最终选择了全长为694bp的第8外显子作为兔子的ggta1功能区，经过后续的打靶，从基因操作的兔子中筛选出ggta1功能失活的仔兔，并证实了兔子ggta1基因的第8外显子cds区确实是兔子ggta1的功能区域所在。可以理解的，上述兔物种优选但不限于新西兰大白兔(拉丁名：newzealandwhiterabbit,nzwr)。在其中一个实施例中，所述第一sgrna识别序列如seqidno.1所示，所述第二sgrna识别序列如seqidno.2所示。可以理解的，为了达到兔物种敲除ggta1基因的目的，可根据crispr/cas9技术的要求选择适宜的打靶序列，但是选用seqidno.1和seqidno.2的序列，具有打靶效果好的优点。本发明还公开了一种gal抗原缺失兔子模型的制备方法，包括以下步骤：sgrna载体构建：根据上述的sgrna合成寡聚核苷酸链，将得到的双链dna连入经bbsi酶切回收的puc57-t7-sgrna载体，得到puc57-t7-sgrna重组载体，扩增重组载体；转录：对重组载体的扩增pcr产物进行转录并纯化，得到合成的对应于第一sgrna识别序列的sgrna1和对应于第二sgrna识别序列的sgrna2，备用；囊胚注射：将cas9mrna和sgrna组成的cas9sgrna体系对胚胎以细胞质注射的方式进行囊胚注射；胚胎移植：将注射后的胚胎移植入受体兔输卵管内，进行饲养。在其中一个实施例中，所述sgrna载体构建步骤中，针对所述第一sgrna识别序列合成寡聚核苷酸链序列如seqidno.3和seqidno.4所示，针对所述第二sgrna识别序列合成寡聚核苷酸链序列如seqidno.5和seqidno.6所示；上述寡聚核苷酸经退火合成双链dna。在其中一个实施例中，所述转录步骤中，用maxiscriptt7试剂盒对重组载体的pcr产物进行转录，用t7引物进行扩增，并用mirneasymini试剂盒进行纯化；所述t7引物序列如seqidno.8和seqidno.9所示。在其中一个实施例中，所述囊胚注射步骤中，所述cas9mrna由以下方法得到：将3×flag-nls-spcas9-nls载体经not1线性化后，用mmessagemmachinesp6试剂进行转录，即得。优选地，可再用rneasymini试剂盒纯化。在其中一个实施例中，所述囊胚注射步骤中，所述cas9sgrna体系中，cas9mrna和sgrna的使用浓度比为4～6:1。其中，cas9mrna的使用浓度优选150～250ng/μl，sgrna的使用浓度优选20～60ng/μl。本发明还公开了上述的gal抗原缺失兔子模型的制备方法制备得到的gal抗原缺失兔子模型。该模型兔为双侧染色体的ggta1基因均被剔除的纯合子。本发明还公开了上述的gal抗原缺失兔子模型动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞。本发明还公开了上述的gal抗原缺失兔子模型在异种组织移植、和/或动物源性生物材料免疫学研究、和/或动物源性生物材料的人体植入反应试验模型、和/或动物源性生物材料的人体植入后组织再生、修复、重建的评价模型、和/或膜类动物源性生物材料的钙化试验研究中的应用。所述异种包括但不限于猪、牛等，组织也即包括器官等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的一种用于gal抗原缺失兔子模型制备的sgrna，以及制备得到的gal抗原缺失兔子模型，通过采用crispr/cas9打靶技术制备双侧染色体ggta1基因均被剔除的纯合子兔子。该ggta1基因敲除兔子的纯合子失去了gal抗原的表达能力，与人体具有相似的抗-gal抗体的表达趋势；因此，该gal抗原缺失兔子模型可以用于猪、牛等异种组织/器官移植和动物源性生物材料，动物组织、器官及其衍生物的免疫学研究；动物源性生物材料/医疗产品的人体植入反应试验模型和植入后组织再生、修复、重建的有效性评价模型；膜类动物源性生物材料/医疗产品的钙化试验研究等，具有广泛的用途和深远的应用前景。附图说明图1为实施例中兔子与小鼠ggta基因功能区cds序列一致性比较示意图；图2基因打靶示意图；图3为实施例中t-克隆及sanger测序鉴定仔兔ggta1基因突变示意图。其中：下划线代表两个sgrna的靶位点，斜体加粗代表pam区，(-)代表缺失的碱基，(双箭头)代表增加的碱基。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。以下实施例中所用试剂，除非特别说明，均为市售。以下实施例中的pcr扩增或转录，除非特别说明，均按照常规方式操作即可。实施例一种gal抗原缺失兔子模型，通过以下方法制备得到：一、sgrna载体构建。1、确定兔子gal抗原调控基因ggta1的功能区。针对兔物种的ggta1功能区，本发明人通过ncbi网站查找兔子ggta1基因信息，获得计算机自动分析基因预测方法(gnomon)拼接序列(基因id:loc100348435，英文名称：n-acetyllactosaminidealpha-1，3-galactosyltransferase)再通过大量的信息比对和筛选，分析兔物种基因组编号loc100348435的编码序列，包括exon1:16-286，exon2:34958-35072，exon3:41258-41346，exon4:48906-48941，exon5:51613-51678，exon6:52163-52279，exon7:59218-59355，exon8:63151-63844等8个外显子，最终选择了全长为694bp的第8外显子(如seqidno.7所示)作为兔子的ggta1功能区，该第8外显子与已知的、公认和验证的小鼠ggta1功能区(第9外显子)相比匹配度高达99％，如图1所示。以下为seqidno.7所示的兔子ggta1基因功能区cds(编码区)序列(694bp)：第8个外显子基因序列：所选定的打靶序列为斜体下划线表示部分，其中sgrna1为92分、sgrna2为84分，高分数有助于预测打靶成功率。2、设计打靶序列sgrna。根据上述sgrna设计，基因打靶示意图如图2所示；经过对比分析，打靶序列选定在ggta1功能区(第8外显子内)的2个序列，sgrna识别序列和寡聚核苷酸链见表1。表1sgrna设计序列3、sgrna载体构建本实施例中，将上述设计的两个相辅的打靶序列dna寡核苷酸在95℃退火5分钟合成双链dna；再将双链dna克隆到bbsi酶切回收的puc57-t7表达载体(基因id51306)；随后用以下t7引物扩增重组的载体(puc57-t7-ggta1/sgrna)；t7-f:5`-gaaattaatacgactcactata-3`(seqidno.8)t7-r:5`-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3`(seqidno.9)二、转录。通过上述步骤得到可用于体外转录的扩增重组的载体(puc57-t7-ggta1/sgrna)后，用maxiscripttmt7试剂盒(市售，ambion)对上述puc57-t7-ggta1/grna的pcr产物进行转录，并用mirneasymini试剂盒(市售，qiagen)进行纯化，得到合成的ggta/sgrna1和ggta/sgrna2。三、囊胚注射。1、将6～8个月的雌性新西兰大白兔注射促滤泡激素(fsh，50iu)进行促进超速排卵，每12小时注射一次，连续注射3天。在最后一次注射后将其与雄性兔子合笼，并注射100iu人源绒毛膜促性腺激素(hcg)，18小时候将雌性受孕兔子实施安乐死处死，用dpbs-bas冲洗输卵管收集受精卵。将原核阶段的胚胎培养在卵母细胞培养液中。2、将200ng/μl的cas9及40ng/μl的ggta1/sgrnamrnas，按照常规的细胞质注射方式进行囊胚注射。3、将注射了cas9-ggta1/sgrnamrna的胚胎转移至ebss培养液，在38.5℃，5％co2，100％湿度条件下进行短期培养。四、胚胎移植。1、将224个注射了cas9-ggta1/sgrnamrna的胚胎移植入4只受体兔输卵管内(胚胎移植情况见表2)，进行常规饲养。表2ggta敲除兔胚胎移植情况#注：4只兔子中有1只兔子没有受孕，分析其原因可能是受体没有达到很好的同期发情。2、经检查有3只兔子注射的基因处理胚胎成功着床怀孕，常规饲养后共获得15只仔兔出生。五、新生小兔基因型鉴定1、根据图1兔子ggta1基因功能区cds序列，设计如下扩增引物对新生小兔基因型进行鉴定：f:tggaggagttcataacatctgc；(seqidno.10)r:tgctgggattatcatataggcct。(seqidno.11)2、实验过程。从新生小兔耳缘组织提取dna(tiamampgenomicdna试剂盒)，pcr扩增后纯化，nebuffer2(neb,usa)热变性、退火，杂交pcr产物经t7内源性核苷酸酶(neb,usa)在37℃消化30分钟；经2％琼脂凝胶电泳后进行纯化(tiangelmidi纯化试剂盒)，分析琼脂糖凝胶电泳结果。同时将pcr产物连接pgm-t(tiangen)载体后测序(dnaman)，确定新生小兔基因型。3、测序结果如图3所示，表明结果，15只f0代仔兔中有14只针对ggta1基因设计的sgrna处发生了基因敲除变异，成功率为93.3％，体现了本发明基因剔除技术的优势。本发明靶位点的选择符合crispr的设计规则(ngg)，在cas9切割完之后，细胞启动hdr或nhej机制修复，导致所编码的cds区域移码突变，破坏基因的编码致使基因功能丢失。根据鉴定结果，所得仔兔个体大部分为移码突变，因此该基因功能缺失。六、ggta1基因敲除仔兔出生后体重统计和存活情况1、出生仔兔体重统计。表3是截稿日仍然生存的9只兔子体重情况((其中15号为非基因变异型)。结果可见，与同等周龄的野生型小兔体重(见15号及表4)相比略显偏低，除个别的个体(4号)外未见显著差异。表3ggta1基因敲除仔兔体重统计表(单位：kg)表4野生型仔兔体重统计表(单位：kg)3、出生仔兔存活情况。15只f0代仔兔中，其中，1、3、7、9、11、12编号的仔兔分别于1周、1周、3周、6周、10周及6周后死亡，死因判定为自然死亡，未观察到与野生型死亡率不同的现象。其它仔兔生长发育正常。未见其它生活习性、饮食、行为等异常。七、新生小兔表型鉴定本发明获得的ggta基因敲除兔子具有新的表型，一般生命指征正常。1、基因敲除仔兔ggtamrna表达的测定。在ggta功能区(第8外显子内)设计如下表所示的定量pcr用引物(seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14和seqidno.15)。表5rt-pcr引物序列从基因操作f0子兔的耳部皮肤取少量组织，提取rna，逆转录成cdna后，用ggta-f/ggta-r特异性定量pcr用引物进行扩增。结果如预期，基因剔出的纯合子子兔完全失去了ggta1mrna的表达。2、ggta1基因敲除仔兔体内gal抗原的测定gal抗原的蛋白质表达水平表型鉴定采用特异性抗gal抗体的elisa抑制法进行检测。研究显示gal抗原的表达主要由ggta调控，ggta基因表达的缺失将会导致gal抗原表达的消失。因此，elisa抑制法采用gal抗原的特异性抗体(鼠源，m86)，先用m86与组织中的gal抗原进行反应，再进行离心分离未反应的剩余抗体；将剩余抗体通过人工合成的gal/bsa固相抗原包被96孔板进行测定，以此计算与组织反应的抗原的表达量。兔血红细胞膜表达丰富的gal抗原，很多研究采用兔血红细胞作为gal抗原阳性对照物进行相关研究。因此，检测兔血红细胞的gal抗原表达情况可以评价ggta基因敲除后的效果。具体操作参照行业标准yy/t1561-2017(组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-gal抗原检测)及参考文献(单永强等，《生物医学工程学杂志》，2015，32(3)：680-687)进行。检测结果见表6，野生型兔子(wt)血液红细胞的gal抗原表达量为2.72×107(表位数/细胞)，与文献报道一致；而ggta1基因剔出纯合子兔子的gal抗原表达量未检测到，说明本实施例的gal抗原缺失兔子模型制备成功。表6gal抗原的表达量检测结果兔血红细胞gal表达量(表位数/细胞)wttype2.72×107ggta1ko未检测到decreasedrate(％)100以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心<120>sgrna及其制备的gal抗原缺失兔子模型和应用<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>5<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>6<210>7<211>694<212>dna<213>cds<400>7atacattgagcattacttggaggagttcataacatctgctaatagatacttcatgattgg60ccacaaagtcatattttacatcctggtggatgatgtctccagaatccctttgatagagct120gggtcctctacgctccttcaaagtgtttgagatcaagccagagaagaggtggcaggacat180cagcatgatgcgcatgaagaccattggggagcacatttcagcccatatccaacacgaggt240tgacttcctcttttgcatggatgtggaccaggtcttccaagacaactttggggtggagac300cctgggccagtcagtggctcagctacaggcctggtggtacaaagcagatcctgacgaatt360tacctatgagaggcggaaagagtcggcagcatacattccatttggacaaggggattttta420ttaccatgcagccatttttggaggaacaccccttcaggttctcaacctcacccaggagtg480ctttaagggaatcctccaggacaagcaaaatgacatcgaagctgagtggcatgatgaaag540ccacctgaacaagtatttcctgctcaacaaacccactaaaatcttatctccagaatactg600ctgggattatcatataggcctaccttcagatattaaaattgtcaagatatcttggcagac660aaaagaatatagtttggttaggaataatgtctga694<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>8<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>9<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>10<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>11<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>12<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>13<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>14<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>15当前第1页12