本发明涉及一种抑制rbap48基因的sirna及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
癌症是全球第二大死因，2015年癌症死亡人数多达880万。从全球情况来看，有近六分之一的死亡是由癌症造成，其中最常见的癌症类型为肺癌，肝癌和结直肠癌等。具体来说，肺癌的发病率和死亡率都居各类癌症之首，此外肝癌也是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肺癌位于第2位。宫颈癌位列全球女性恶性肿瘤发病和致死人数的第四位，在我国，每年新发宫颈癌病例数约13万，居我国女性生殖系统恶性肿瘤首位。消化道肿瘤亦是最常见的恶性肿瘤之一，包括食管癌、大肠癌、胃癌等的发病率和死亡率一直位居各种癌症的前列。
目前对于肿瘤的治疗主要采取的是放疗、化疗及外科手术这三大传统方法。然而以肺癌为例，其早期多无明显症状，部分患者确诊时已属中晚期，有远处病灶转移，已失去外科手术和放疗的机会。因此，在肺癌的治疗上，药物的作用显得尤为重要。遗憾的是，目前仍然缺乏持久有效的肺癌治疗药物。对于宫颈癌，食管癌，大肠癌，胃癌及肝癌等，其放疗和外科手术治疗均存在易复发和预后差的问题。至于化疗，一般是用于放疗增敏、术前辅助治疗、晚期远处转移和复发患者的姑息治疗等。但由于一线肿瘤化疗药物均为细胞毒性药物，不仅能作用于肿瘤细胞，也能会伤及正常细胞，故其作用的特异性差，毒副作用强，临床效果差强人意。所以，寻找能选择性作用于肿瘤的精准治疗方案已成为当前科学研究的热点和难点。
rb结合蛋白4(rbbp4或rbap48)，因为最早发现其和rb蛋白结合命名，近来研究发现它还参与了其他复合物的组成和功能调节，因此它又被称为染色质重塑因子、lin-53和nurf55。rbap48由rbbp4基因编码，位于1号染色体短臂3区5带1亚带(1p35.1)，碱基长度为35064bp，分子量为48kd。rbap48可以参与rb蛋白、极光激酶c对细胞周期的调节，还参与muvb复合物的组成和功能调节，从而对细胞周期产生影响。rbap48在rb蛋白的招募下，通过hdac1介导，形成rb-hdacl-rbap48三聚复合体，从而抑制e2f的转录启动和细胞周期的进行。同时，rbap48参与prc2的组成和功能调节。prc2(polycombrepressivecomplex2)是转录抑制因子polycomb复合物的成员之一，通过催化亚基ezh2的set结构，在eed、sμz12的协同下，对核小体组蛋白进行甲基化修饰，rbap48参与prc2/eed-ezh2复合物和pcl蛋白调节h3k27me3的形成过程，从而抑制基因转录。这种基因沉默作用已被证实具有维持细胞增殖和存活、抑制细胞衰老及分化效果的作用。
rbap48参与众多复合物的组成和功能调节，因此它的表达对表观遗传修饰相关的基因沉默、细胞周期调控、细胞增殖分化、细胞衰老等生命活动的正常进行尤为重要。有研究报道，rbap48的异常表达与多种疾病的发生和发展有关，近年来rbap48在肿瘤中的表达以及与肿瘤发生发展的关系越来越受到关注。rbap48蛋白在多种肿瘤中高表达，包括宫颈癌、肺癌、甲状腺癌急性髓性白血病和多种胃肠道肿瘤。组织芯片显示，rbap48蛋白在人肺癌，宫颈癌，结肠癌，食管癌，胃癌及肝癌细胞中的表达显著高于其癌旁细胞。因此，rbap48可能是治疗人肺癌，宫颈癌，结肠癌，食管癌，胃癌及肝癌细胞的潜在靶点。
1998年克雷格·梅洛和安德鲁·法尔在研究线虫基因沉默机制时证实，双链rna较单链的正义或反义rna对基因表达起着更强有力的抑制作用，并首次将这种现象称之为rna干扰。随后tuschl和他的同事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19－25个碱基的小干扰rna(sirna)，可特异且高效地沉默靶mrna。sirna可特异结合序列互补的靶mrna，并使其降解。长片段的双链rna被dicer酶切割成21－23个碱基长度短片段rna。两条链中同靶mrna结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体外化学合成的sirna进入细胞后同样发挥rna干扰作用，而且有效降低了长链rna引起的机体免疫反应。近年来，rna干扰技术作为一种新型的基因沉默技术，由于其具有高特异性抑制靶基因的表达、疗效显著、副作用轻微等特点，应用rna干扰技术已经是药物研究领域中重点发展的方向之一，并逐渐应用于临床。2010年，davis等发表了全身的sirna转运至人体肿瘤的纳米技术，这是第一个用于人体的sirna靶向转运纳米粒，更为rnai作为新的临床治疗手段提供了强有力的支持。从此sirna被广泛用于基因功能研究，疾病治疗。目前已有多种sirna药物进入了临床阶段，其中涉及到了眼部疾病，癌症，病毒感染，先天性厚甲，高胆固醇血症，急性肾损伤等不同疾病的治疗，表明sirna作为治疗手段的多样性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抑制rbap48基因的sirna及其应用。
本发明提供一种抑制rbap48基因的双链sirna分子，其序列号及核苷酸序列如下所示：sirbap48#1：senses5‘caaccaugaaggagaaguadtdt3‘seqidno.1
antisenses：3‘dtdtguugguacuuccucuucau5‘seqidno.2，或
sirbap48#2：senses5‘cugccaagauaucugauuudtdt3‘seqidno.3
antisenses：3‘dtdtgacgguucuauagacuaaa5‘seqidno.4，或
sirbap48#3：senses5‘ccaguggcuuccagauguadtdt3‘seqidno.5
antisenses：3‘dtdtggucaccgaaggucuacau5‘seqidno.
本发明另一个方面提供了一种rbap48基因抑制剂作为抗肿瘤药物的用途。
本发明另一个方面提供了一种rbap48基因抑制剂作为抑制肿瘤细胞增殖或或诱导细胞衰老的药物的用途。
在本发明的技术发明方案中，所述的rbap48基因抑制剂为双链sirna分子seqidno.1和seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4，或seqidno.5和seqidno.6。
在本发明的技术方案中，所述的肿瘤包括起源于大脑、中枢神经系统、肾脏、肝、胆囊、头颈部、口腔、甲状腺、皮肤、黏膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、肺脏、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宫、卵巢、子宫内膜、子宫颈、前列腺、膀胱、结肠或直肠的原发或转移的癌或肉瘤或癌肉瘤。优选自黑色素瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔表皮癌、宫颈腺癌、宫颈鳞癌、食管癌、大肠癌、、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或结肠癌。
本发明另一个方面提供了一种药物组合物，其中包含至少一种rbap48基因抑制剂以及可接受的药物载体。
在本发明的技术方案中，所述的药物组合物的制剂为纳米制剂，优选为阳离子脂质体。
有益效果
本发明通过实验证明抑制rbap48基因的sirna(sirbap48)具有显著的抗人实体瘤的作用。sirbap48对人宫颈腺癌hela细胞，人宫颈鳞癌ms751、siha细胞，人食管癌ec109细胞，人大肠癌ht-29细胞，人胃癌hgc-27细胞，人肝癌hepg2、hep3b细胞的增殖均有显著的抑制作用，其用量为50nmol，细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡等实验证实sirbap48可诱导肿瘤细胞发生周期阻滞、细胞衰老和凋亡。
附图说明
图1为抑制rbap48基因表达的有效sirna筛选。
图2为sirbap48对肿瘤细胞增殖抑制作用的时效量效关系。
图3为sirbap48对肿瘤细胞体外克隆形成的抑制。
图4为sirbap48对裸鼠体内肿瘤形成的影响。
图5为sirbap48对肿瘤细胞周期的影响。
图6为sirbap48诱导肿瘤细胞发生凋亡。
图7为sirbap48诱导肿瘤细胞衰老。
具体实施方式
lipofectamine2000试剂盒为invitrogen产品。
sirna由广州市锐博生物科技有限公司设计合成，该产品采用化学合成法生成，共合成3对sirbap48以供实验。
实施例1设计并确定抑制rbap48基因的有效sirna序列
进行sirna设计以确定靶向于rbap48的sirna，并进行生物信息学筛选，确保序列对于rbap48序列是特异性的且对于任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列使用的是ncbi提供的blast引擎搜索，通过相对于genbank中的序列进行核对，再经化学合成出3个有效sirna，分别命名为sirbap48#1，sirbap48#2，sirbap48#3。
sirbap48序列号及寡核苷酸序列如下所示：
sirbap48#1:senses5‘caaccaugaaggagaaguadtdt3‘seqidno.1
antisenses3‘dtdtguugguacuuccucuucau5‘seqidno.2sirbap48#2:senses5‘cugccaagauaucugauuudtdt3‘seqidno.3
antisenses3‘dtdtgacgguucuauagacuaaa5‘seqidno.4sirbap48#3:senses5‘ccaguggcuuccagauguadtdt3‘seqidno.5
antisenses3‘dtdtggucaccgaaggucuacau5‘seqidno.6
实施例2检测sirbap48对细胞中rbap48蛋白表达的下调作用，筛选效果最明显的sirbap48序列
1.sirna转染
实验分为5组，分别为sirbap48#1至sirbap48#3实验组，sirna-nc为阴性对照组、untreated为空白对照组。
1.1sirbap48#1至sirbap48#3实验组的设置方法如下：
将hela、ms751、siha、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞用0.25％的胰酶进行消化，再用1640培养基制成浓度为5×104个/ml的细胞悬液，将其接种于6孔培养板中，每孔2ml；24h后，按照lipofectamine2000试剂盒的说明书，将各个对应的sirna按照50nm的终浓度转染细胞。
1.2sirna-nc阴性对照组设置方法：实验组的sirna替换为sirna-nc，其余步骤不变。
1.3untreated为空白对照组设置方法：加lipofectamine2000，其余步骤与实验组一致。
2.westernblot
2.1蛋白样品制备
转染完48小时后将细胞消化收集于15ml离心管中，3000rpm离心5min；小心弃去上清液，加入1mlpbs重悬细胞并转入1.5mlep管中，3000rpm离心5min。小心弃去上清液，根据ep管底部细胞量加入适量含有1％pmsf(100nm)的细胞裂解液充分混匀细胞，置于冰上裂解10min；然后将其用细胞超声粉碎仪粉碎，4℃、12000rpm离心10min，取上清液分装至另一干净的1.5mlep管中。
2.2蛋白浓度的测定
按照bca法蛋白质定量测定试剂盒的步骤，制备浓度为0、50、100、200、300、400、500μg/ml的标准曲线，加入200μl工作液(solutiona∶solutionb＝50∶1)，同时将上述的蛋白样品适当稀释后，按照相同操作加入工作液，放入37℃烘箱中30min，然后用570nm波长检测吸光度，根据od值计算绘制标准曲线然后测蛋白样品浓度，确定具体上样量；最后将剩余的蛋白样品上清液以4:1的比例加入上样缓冲液，沸水煮5min，分装待用。
2.3sds-page电泳
(1)玻璃板的清洗：在海绵上加入适量的洗洁精后，将玻璃板的两面充分清洗。直至玻璃板上的水既不聚集成滴也不成股流下，清洗干净后再用蒸馏水浸洗一遍晾干即可；
(2)装板和检漏：短板朝外，两侧及底部齐平将板安装到制胶架上，在板中间加入超纯水，10分钟后液面不发生明显的变化即可认为不漏胶，将水倒去，并晾干；
(3)分离胶和浓缩胶的配制：配方(以制作两块胶需各试剂的量为例)见下表，加入的分离胶高度约为短板的2/3，灌好胶后，在其上方加入超纯水，使胶面齐平，放在室温自然凝固，倒去分离胶上层的水，并用吸水纸将残留的水吸干；加入混合好的浓缩胶，插入梳子，防止产生气泡；待胶完全凝固后，取下后在其表面洒上适量的超纯水，用保鲜膜包好后放到4℃冰箱中，一周内使用。下表中胶的不同浓度是指丙烯酰胺的浓度；
12％分离胶的配制
5％浓缩胶的配制
上样：将配制好的胶放于干净的电泳架内(短板朝里，长板朝外)并固定，然后将电泳架置于电泳槽内；将电泳液倒入内槽和外槽，使内外液面齐平，拔下样品梳，在样品孔内依次加入marker和蛋白样品；
(4)电泳：设置电泳时间为：浓缩电压60伏20分钟，分离电压120伏60分钟；
(5)湿法转膜：电泳完毕后，配好转膜缓冲液后，将海绵和滤纸放到转膜缓冲液中充分浸泡；取下玻璃板，分开长短板，将整块分离胶取下并根据胶的大小切下比胶略大的nc膜，将膜放在转膜缓冲液中润湿备用；从负极到正极依次为海绵、滤纸、凝胶、nc膜、滤纸、海绵，驱赶气泡后放到转膜槽中进行转膜，电压为100v，时间为90分钟；
(6)封闭：转膜完成后，用丽春红染膜，判断转膜是否成功，根据marker的标记剪裁含目的条带的nc膜，用5％脱脂奶粉室温封闭1小时；
(7)一抗孵育：将稀释好的抗体和nc膜放到抗体孵育盒中，室温摇床孵育半1小时后转到4℃摇床孵育过夜；
(8)二抗孵育：将nc膜从一抗中取出，用tbst在洗脱摇床上洗脱4次，每次10分钟，而后将膜和二抗放到抗体孵育盒中，室温孵育1小时；
(9)化学发光、曝光、洗片：将膜从二抗中取出，用tbst洗涤四次，每次10分钟；把ecl发光液中的a液和b液以1:1的体积加到抗体孵育盒中，将膜放入其中，在摇床上孵育4分钟后，把膜取出，放到保鲜膜上；包好后(保鲜膜紧贴nc膜上，中间无气泡)，放到暗匣中固定好，进入暗室显影，根据荧光的强弱决定显影时间的长短，最后用自来水将x胶片冲洗干净，放到阴凉干燥处晾干后，标记好日期和蛋白名称然后扫描保存。
图1结果表明，sirbap48#1(seqidno.1和seqidno.2)对hela、siha、hepg2细胞中rbap48的下调效果最好；sirbap48#2(seqidno.3和seqidno.4)对ec109、ht-29、hgc-27细胞中rbap48的下调效果最好；sirbap48#3(seqidno.5和seqidno.6)对ms751、hep3b细胞中rbap48的下调效果最好；后续实验将分别采用下调效果最好的sirbap48序列。
实施例3mtt(四甲基偶氮唑蓝)法检测sirbap48对细胞增殖的抑制作用
(1)量效：取对数生长期人宫颈癌hela、ms751、siha细胞，人食管癌ec109细胞、人大肠癌ht-29细胞、人胃癌hgc-27细胞、人肝癌hepg2、hep3b细胞，消化后，用全培稀释成密度合适的单细胞悬液，计数，以每孔2×103个细胞接种到96孔细胞培养板中,每孔混悬液体积为100μl。细胞接种24小时后，按照不同组别转染要求转染sirna(设置各组sirna量分别为:10nm、20nm、30nm、50nm、100nm，对应加入的sirna量为0.3μl、0.6μl、0.9μl、1.5μl、3μl，每组6个复孔)。转染完96小时后按照mtt法测细胞生存率：生存率％＝(加药组平均od值/对照组平均od值)×100％。
(2)时效：取对数生长期hela、ms751、siha、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞，弃去原培养基，用无菌pbs漂洗1遍，弃去pbs，加入0.25％柠檬酸胰酶0.5ml消化细胞，再加入4.5ml全培吹打成单细胞悬液并计数，配制细胞悬液浓度分别为2000个/孔，然后每孔体积加入100μl接种细胞于96孔板。接种24h后，按照不同组别转染要求转染sirna，每组每个时间点设置6个复孔，根据设计时间待在测定点时每孔加入含mtt(5mg/ml)5ul的全培100ul，37℃、5％co2培养4h后吸净孔内液体，加入dmso150ul/孔。震荡10min待甲臢完全溶解于dmso呈均匀紫色溶液时，570nm波长测吸光度od值，根据测定的od值计算生存率：生存率％＝(加药组平均od值/对照组平均od值)×100％。
图2结果表明，随着sirbap48浓度的提高，其抑制细胞增殖的作用越发明显，hela/ms751/siha/ec109/ht-29/hgc-27/hepg2/hep3b细胞株均在50nm剂量时达峰值，在后续实验中，sirna的浓度均采用50nm。转染sirbap48后，均产生对hela、ms751、siha、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞的抑制作用。其中hela细胞在sirbap48#1(seqidno.1和seqidno.2)转染第四天细胞抑制作用最明显，生存率为36.11±4.47％；ms751细胞在sirbap48#3(seqidno.5和seqidno.6)转染第七天时抑制作用最大，细胞生存率为47.80±5.08％；siha细胞在sirbap48-001(seqidno.1和seqidno.2)转染第五天时抑制作用最大，细胞生存率为79.35±8.50％细胞生存率显著降低；ec109细胞在sirbap48-002(seqidno.3和seqidno.4)转染第五天时抑制作用最大，细胞生存率为54.76±2.74％；ht-29细胞在sirbap48-002(seqidno.3和seqidno.4)转染第五天时抑制作用最大，细胞生存率为66.31±6.30％；hgc-27细胞在sirbap48-002(seqidno.3和seqidno.4)转染第五天时抑制作用最大，细胞生存率为20.95±1.69％；hepg2细胞在sirbap48-001(seqidno.1和seqidno.2)转染第七天时抑制作用最大，细胞生存率为36.60±2.99％；hep3b细胞在sirbap48-003(seqidno.5和seqidno.6)转染第四天细胞抑制作用最明显，生存率为54.56±8.37％。sirbap48抑制hela、ms751、siha、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞增殖。
实施例4检测sirbap48对细胞体外克隆形成的影响
取对数生长期hela、ms751、siha、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞，消化后，用全培稀释成所需密度的单细胞悬液并计数，以每孔1.5×105/个细胞接种与6孔细胞培养板中,每孔混悬液体积为2ml。接种24小时后，转染sirna；转染完48小时后，消化下细胞，每孔用1ml全培重悬细胞成单细胞悬液，并计数三次取平均值，以每个培养皿200个细胞接种于细胞培养皿中，37℃、5％co2培养至可肉眼见白色细胞集落(期间可按需更换全培)；弃去原培养基，pbs小心清洗3次；每皿加入1ml100％结晶紫(无水甲醇配制)固定染色15分钟，弃去染色液，缓慢清水洗净至无染色液，室温干燥，计数，拍照。
图3结果显示，hela细胞sirnanc对照组和sirbap48组克隆形成数分别是87.17±8.63和36.67±2.89，p<0.01；ms751细胞sirnanc对照组和sirbap48组克隆形成数分别是130±8.89和87.33±1.16，p<0.01；ec109细胞空白组、阴性对照组和rbap48-sirna组克隆形成数分别是165.00±13.00、161.00±11.53和101.00±3.61，p<0.01；ht-29细胞空白组、阴性对照组和rbap48-sirna组克隆形成数分别是108.70±4.67、103.00±2.08和68.00±4.62，p<0.01；hgc-27细胞空白组、阴性对照组和rbap48-sirna组的克隆形成数分别是111.30±8.62、31.33±2.19和4.00±1.73，p<0.01；hepg2细胞sirnanc对照组和sirbap48组克隆形成数分别是81.00±4.24和22.50±14.84，p<0.01；hep3b细胞sirnanc对照组和sirbap48组克隆形成数分别是79.00±8.08和20.33±8.50，p<0.01。sirbap48可以显著抑制hela、ms751、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞的克隆形成。
实施例5检测sirbap48对裸鼠体内肿瘤形成的影响
取对数生长期a549、hela、ms751、ht-29、hgc-27、hep3b细胞，消化后，接种于细胞培养皿中，待细胞长至30-50％细胞密度时根据实验分组转染sirna，转染完后24小时消化细胞，再用无菌的生理盐水重悬细胞并配制成浓度为2×107个/ml的单细胞悬液并置于无菌ep管中，用锡箔纸包好待用。
用1ml无菌注射器重新混匀单细胞悬液后吸取并在每只裸鼠的背部皮下注入0.1ml。每周可记录肿瘤生长情况，待各组裸鼠肿瘤长至可见差异后将其麻醉脱臼处死，取下肿瘤称重量体积，计算抑瘤率(％)＝[(sirnanc组平均瘤重-sirbap48组平均瘤重)/sirnanc组平均瘤重]×100％。
图4结果显示，sirbap48可显著抑制hela、ms751、ht-29/hgc-27、hep3b细胞在裸鼠体内的增殖。
实施例6检测sirbap48对细胞周期的影响
(1)取对数生长期的a549、hela、ms751/ec109/hgc-27、hepg2、hep3b细胞将其消化，用新鲜全培稀释成合适密度的单细胞悬液并计数，并以每孔1×105个细胞接种到6孔细胞培养板中；接种24h后根据设定的实验分组转染sirna；
(2)sirna转染后24h，48h，72h，96h，120h分别收集细胞：收集各孔培养基至离心管内；再用pbs清洗，并将清洗后的pbs移入之前所对应的离心管内；加入0.25％柠檬酸胰酶消化细胞，待细胞消化回缩成圆形后，加入之前收集的细胞原液，轻轻吹打细胞，将细胞完全吹下后转移至离心管内，1000rpm离心5min，弃去上清(可以残留约50μl左右的原液，以避免吸走细胞)。轻弹管底以分散细胞，避免细胞成团；
(3)每管样品加入1ml预冷的70％乙醇轻轻混匀，4℃固定保存。待需测定时取出样品1000g离心5分钟，小心吸弃上清(可以残留约50μl左右的原液，以避免吸走细胞)；加入1ml预冷pbs轻轻混匀洗涤，小心吸弃上清(可以残留约50μl左右的原液，以避免吸走细胞)；轻弹管底以分散细胞，避免细胞成团；
(4)碘化丙啶(pi)染色工作液的配制如下表:
注：pi染色工作液宜现配现用。
(5)染色：将上述所得细胞样品每管加入0.5mlpi染色工作液，轻轻重悬细胞，用锡箔纸将其包裹避光置于37℃恒温烤箱中30分钟，取出细胞，4℃避光保存待测；
(6)24小时内进行流式细胞仪检测。
图5结果表明，hela细胞在sirbap48作用48小时后g2/m期细胞数比例显著升高至32.33±7.14％，与对照组比较，**p<0.01，显示细胞发生了g2/m期阻滞。ms751细胞在sirbap48作用96小时后g2/m期细胞数比例显著升高至35.61±3.79％，与对照组比较，**p<0.01。rbap48-sirna转染细胞后第三天，ec109细胞在sirbap48作用72小时后g2/m期细胞比例分别由(13.35±2.84)％、(16.97±2.64)％上升为(31.48±11.39)％，p<0.01；显示细胞发生g2/m期阻滞。hgc-27细胞在sirbap48作用72小时后g2/m期细胞比例分别由(8.42±0.28)％、(13.33±2.94)％上升为(30.75±1.65)％，p<0.01；显示细胞发生g2/m期阻滞。hepg2细胞在sirbap48作用48小时后g0/g1期细胞增加到76.15±3.79％，明显高于对照组的58.39±1.39％，p＜0.01，显示细胞发生了g1/s期阻滞。hep3b细胞再sirbap48作用72小时后g2/m期细胞为40.07±1.62％，也明显高于对照组的16.98±0.97％，p＜0.01，显示细胞发生g2/m期阻滞。sirbap48可诱导hela、ms751、ec109、hgc-27、hepg2、hep3b细胞发生周期阻滞。
实施例7检测sirbap48对细胞凋亡的影响
(1)取对数生长期的hela、ms751、ec109、hgc-27细胞将其消化，用新鲜全培稀释成合适密度的单细胞悬液并计数，并以每孔1×105个细胞接种到6孔细胞培养板中；接种完24h后根据设定的实验分组转染sirna；
(2)转染完后分别收集各孔培养基至离心管内；再用pbs清洗，并将清洗后的pbs移入之前所对应的离心管内；加入0.25％柠檬酸胰酶消化细胞，待细胞消化回缩成圆形后，加入之前收集的细胞原液，轻轻吹打细胞，将细胞完全吹下后转移至离心管内，1000rpm离心5min，弃去上清(可以残留约50μl左右的原液，以避免吸走细胞)。轻弹管底以分散细胞，避免细胞成团；
(3)吸取195μlannexinv-fitc结合液加入到上述各管中轻轻吹打重悬细胞，然后加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀；用锡箔纸包裹室温(20-25℃)避光孵育10分钟；然后将其1000rpm离心5min，小心弃去上清，加入190μlannexinv-fitc结合液轻轻吹打重悬细胞，接着加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，用锡箔纸包好冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测(annexinv-fitc为绿色荧光，碘化丙啶pi为红色荧光)。
图6结果显示，hela细胞在sirbap48作用72小时可见明显的凋亡现象，凋亡率为54.65±9.06％，与对照组比较，**p<0.01；ms751细胞经sirbap48作用120小时发生明显的凋亡现象，其凋亡率为32.20±4.47％，与对照组比较，*p<0.05；ec109细胞在sirbap48作用96小时可见明显的凋亡现象，凋亡率为(12.18±0.50)％，与对照组比较，**p<0.01；hgc-27细胞在sirbap48作用120小时可见明显的凋亡现象，凋亡率为61.30±8.07％，与对照组比较，**p<0.01。sirbap48可显著诱导hela、ms751、ec109、hgc-27细胞发生凋亡。
实施例8检测sirbap48对细胞衰老的影响
(1)取对数生长期a549/、hela/、ms751/、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2、hep3b细胞，消化后，用全培稀释成密度合适的单细胞悬液，计数，以每孔2×104个细胞接种到24孔细胞培养板中,每孔混悬液体积为1ml，按照实验分组转染sirna；
(2)转染sirna后，弃去原培养基，用pbs清洗一遍，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10分钟；
(3)弃去原β-半乳糖苷酶染色固定液，用pbs清洗3次以除去残余固定液，每次3分钟；
(4)小心吸弃pbs，每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶染色工作液。β-半乳糖苷酶染色工作液配制方法如下表(以下为一个样品所加量)：
(5)用保鲜膜将24孔板密封(防止染色液蒸发)，37℃恒温过夜；
(6)显微镜下观察衰老情况并拍照记录,比较差异。
图7结果显示，hela、ms751、ec109、ht-29、hgc-27、hepg2/hep3b细胞在sirbap48作用下，与untreated组和sirnanc组相比，胞内颗粒增多，可见明显蓝染。表明sirbap48可诱导细胞发生衰老。细胞衰老是指在致衰老因素作用下细胞周期受到阻滞，细胞丧失了对分裂原的反应，处于失去增殖分化能力的状态，是一种不可逆的生物学变化，细胞一旦发生衰老，则失去增殖能力，随之将走向凋亡。诱导肿瘤细胞发生衰老，使其增殖受到抑制，是抗肿瘤的一个重要途径。
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<110>南方医科大学
<120>一种抑制rbap48的基因的sirna及其抗肿瘤应用
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