本发明细胞生物学和生物制品技术领域，特别是涉及一种自动化培养二倍体细胞的方法。可在生物反应器大规模在线放大细胞基质，为人二倍体细胞的大量清晰代次的繁殖及以细胞为基质的生物制品生产提供重要的细胞资源。
背景技术：
人的二倍体细胞是用于繁殖病毒制备疫苗的重要细胞基质。细胞作为病毒疫苗生产的主要原材料，直接影响疫苗的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。目前许多人用疫苗采用不同的细胞基质，例如：地鼠肾细胞、鸡胚细胞、vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、人二倍体细胞等。但是，在细胞基质上任何一种动物细胞的安全性均没有人二倍体细胞高。人二倍体细胞，的突出优点是：无致肿瘤性；无外源蛋白过敏源，无已知潜在污染因子；与人抗原性一致，更适应人种属的免疫系统；不足：产业化大规模培养难度大，人二倍体细胞在体外增殖缓慢和世代的严格限定，提高了微载体贴壁培养和在线放大规模培养的应用难度。相对而言其他大多数细胞采用消化传代一次作为一个代次而言，人二倍体需要以倍增一次作为一个代次，从这一点来看似乎反应器大规模培养已经在规模化程度上没有了前景。但是由于人二倍体细胞本身同源性，更加适合作为人用医疗制剂的生产和载物。引起的免疫性和潜在异源型污染都是最小的。正因为这些不可忽视的优势在，世界范围的都在寻找能够良好人二倍体细胞贴壁培养与在线放大规模培养方法。只有贴壁培养才能更好的控制细胞系的致瘤性变异，也只有在线放大规模化培养才能更好的实现市场化和医疗价值。
目前的实现的应用中，人二倍体细胞的培养在线放大的损失率太高，基本上维持在40％的利用率上，其中的浪费可想而知，也就严重阻碍了市场化的进程。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服人二倍体细胞在体外增殖缓慢和代次的严格限定的缺点，克服微载体贴壁培养和在线放大规模培养的应用难度，提高二倍体细胞的生物反应器大规模培养及应用的水平，可以明显提升细胞的利用率，在线放大保持细胞活性在80％以上。
本发明是将人的二倍体细胞在无气泡通气式生物反应器内在线连续三级放大，大规模自自动化微载体贴壁悬浮培养工艺培养细胞，本方法具有明显的工业化生产大规模，符合人二倍体规程的健康细胞。本发明优先地初级生物反应器培养人二倍体细胞通过胰酶消化分散细胞，优点是保持人二倍体细胞的活性和清晰的代次区分，生产规模大，细胞生长效率高，实现了人二倍体细胞的产业化，保持80％以上的成活率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是提供了一种自动化培养二倍体细胞的方法，包括单层种子制备、初次细胞培养、二级在线放大以及三级在线放大的步骤，在无气泡通气式生物反应器内在线连续三级放大。
本发明优先地控制微载体浓度和细胞浓度，初级培养工艺中，生物反应器体积5l。微载体25-50g，细胞数2.0x109-4.0x109cells/ml，以保持4-8倍的放大浓度接种生物反应器内。培养后细胞数达到：8.0x109-3.2x1010cells/ml。
本发明优先的二级生物反应器在线放大，所采用的生物反应器体积50l，微载体100-400g，接种细胞数量8.0x109-3.2x1010cells/ml，以4-8倍体积放大连续培养，培养后细胞数达到：3.2x1010-2.5x1011cells/ml。
本发明优先地三级生物反应器放大，所采用的生物反应器体积500l，微载体400-3200g，接种细胞数量3.2x1010-2.5x1011cells/ml，以4-8倍体积放大连续培养，培养后细胞数达到：1.2x1011-2.0x1012cells/ml。实现应用生物反应器在线三级放大大规模自动化微载体贴壁悬浮培养保持人二倍体细胞在线放大代次清楚，细胞生长和倍增数量符合人二倍体细胞培养工艺标准。
本发明优先地选择培养的生物反应器：广州齐志生物工程设备有限公司制造的无泡通气式bc-5l，50l，500l型动物细胞培养生物反应器。
本发明优先地使用的生长细胞为人二倍体细胞wi38，f32，2bs等多个品种的人二倍体细胞。
与现有技术相比，本发明可以明显提升细胞的利用率，在线放大保持细胞活性在80％以上。
附图说明
图1是生物反应器自动三级放大培养人二倍体细胞流程图。
图2是二倍体细胞在生物反应器中一级培养细胞生长图片及细胞pid曲线。
图3是二倍体细胞在生物反应器中二级培养细胞生长图片及细胞pid曲线。
图4是二倍体细胞在生物反应器中三级培养细胞生长图片及细胞pid曲线。
具体实施方式
以下为本发明具体的实施方案，一种自动化培养二倍体细胞的方法，进一步阐述本发明，但不能限制本发明的范围，具体实施步骤：
实施例1：一种自动化培养二倍体细胞的方法，包括单层种子制备、初次细胞培养及放大、二级在线放大以及三级在线放大的步骤，在无气泡通气式生物反应器内在线连续三级放大。
单层细胞种子制备：细胞保持1:2传代，单层细胞经trypsin1:250(胰蛋白酶)，浓度为0.025％-0.050％孵育3-5分钟消化，轻轻吹打可以完全剥离细胞。
初次细胞培养：将胰酶分散后细胞接种到5l生物反应器中，细胞接种数量2.0x109-4.0x109cells，微载体数量25-50g，每48小时换培养液一次。所述的生物反应器参数设定为：ph6.0-7.0，温度为22-30度，溶氧为30％-80％和搅拌速度为20-150rpm，培养中细胞在生物反应器内培养贴壁初期的细胞耗氧速率应该保证在4.17％/h以上，溶氧能够在12h内降至50％的溶氧设定值。待细胞全部覆盖微载体表面时，消化计数细胞数150-200个细胞/微球，细胞数8.0x109-3.2x1010cells/ml，完成初级在线放大规模培养。
实施实例2：二级在线放大：生物反应器为50l，微载体浓度：100-400g，当5l生物反应器培养细胞计数在150-200个细胞/微球时进行消化放大，消化放大按照trypsin1:250胰蛋白酶0.025％-0.050％浓度孵育3-5分钟，细胞90％-100％同步消化，生长液10％血清dmem终止消化后管道自动输送至二级反应器反复吹打1-3次，完成二级在线放大规模培养，培养基加入方式批次，细胞耗氧率4.17％/h以上，生物反应器参数设定为：ph6.0-7.0，温度为22-30度，溶氧为30％-80％和搅拌速度为20-150rpm，二级生物反应器培养后细胞数达到：3.2x1010-2.5x1011cells/ml。培养后细胞倍增数为4-8倍。完成二级在线放大规模培养。
实施实例3：三级在线放大：500l体积生物反应器，微载体浓度：400-3200g，三级放大细胞数3.2x1010-2.5x1011cells/ml，培养基加入方式批次，细胞耗氧率4.17％/h以上，生物反应器参数设定为：ph6.0-7.0，温度为22-30度，溶氧为30％-80％和搅拌速度为20-150rpm，三级生物反应器培养后细胞数达到：1.2x1011-2.0x1012cells/ml。培养后细胞倍增数4-8倍,完成三级在线放大规模培养。
与现有技术相比，本发明可以明显提升细胞的利用率，在线放大保持细胞活性在80％以上。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，对其进行简单的组合变化都列为本发明的保护之内。