本发明属于材料与组织工程领域，涉及曲面上微蛋白图案的制作和细胞的捕获和排列，可以模拟人体典型拥有复杂曲面、管状、螺旋状结构组织中细胞的生存环境，可用于组织再生医学中。
背景技术：
拥有自然功能性的人体是通过组织和器官的结构与其功能相适应体现的。这些结构不断生长和再生过程是细胞不断增值和相互作用的过程。细胞的微环境是细胞生存的环境，维持着细胞的正常增值、分化和代谢功能。微环境主要由临近细胞、细胞外基质和其他细胞的细胞间质构成。细胞与细胞外基质间存在很多粘附因子来完成相互作用，所以调控细胞行为可以通过调节细胞粘附来完成。
微接触印刷技术是制备表面微图案获取细胞常用的方法之一，最初建立并应用于微电子学中(singhvietal.,1994)。随着近几年微电子学在生物医学领域的发展，微接触印刷技术广泛应用于细胞生物学，为细胞提供了合适的生存基底用于细胞的粘附和生长。
微接触印刷技术主要利用在pdms图案化表面孵育活性蛋白，使蛋白沉降后，再通过接触印刷将蛋白图案转印到基底上形成亲水和疏水区域，来选择性的粘附细胞。并以此来控制细胞的形状和活性(chenetal.,1997)，规定细胞的伸展及骨架排布(wangetal.,2014)，在干细胞的相关研究中微图案的形状会影响细胞的分化方向(mcbeathetal.,2004)，除此之外图案化也会帮助细胞生成功能性组织(rachelleetal.,2014)。
微接触印刷技术的优点显而易见，主要表现在：技术操作简单，结果方便观察，无需严苛的实验室环境，所需的基底和材料制作成本较低，且可以实现精确地表面图案化，对研究细胞的行为及细胞间的相互作用十分方便可行。但是其缺点是固体印章的平整性决定其很难在非平面结构上实现蛋白图案化。
目前大多数细胞研究都基于平面或锐角面，而体内复杂曲面和管状结构的组织和器官占很大比例。目前很多研究都在设法高度模拟这种结构，还原细胞生存的真实环境。比如利用纤维辅助成型技术(vahidhosseinietal.,2014)或者通过等离子刻蚀技术(mathuretal.,2012)进行曲面上微图案的制作，可以成功的引导细胞进行排列，但是这些方法无法进行精细复杂微图案的制作从而无法针对特定细胞控制细胞的骨架排布；并且这些技术在曲面上形成的微图案不是平面图案，而是有拓扑结构的三维图案，无法实现在平曲面上进行的细胞培养。3d打印技术(polzinetal.,2013)，可以制作复杂图案，但是3d打印很难实现细胞尺度几十微米的精确度，无法完成几毫米直径的管腔内部的微图案制备。
与本发明相关的研究参考文献：
singhvir,kumara,lopezgp,etal.engineeringcellshapeandfunction[j].science,1994,264(5159):696-8.
chencs,mrksichm,huangs,etal.geometriccontrolofcelllifeanddeath[j].science,1997,276(5317):1425-8.
wangd,zhengw,xiey,etal.tissue-specificmechanicalandgeometricalcontrolofcellviabilityandactincytoskeletonalignment[j].scientificreports,2014,4(6160).
mcbeathr,pironedm,nelsoncm,bhadrirajuk,chencscellshape,cytoskeletaltension,andrhoaregulatestemcelllineagecommitment.devcell,2004,6:483–495.
rachellen.palchesko,kiral.lathrop,jamesl.funderburgh.invitroexpansionofcornealendothelialcellsonbiomimeticsubstrates.scientificrepores,2014；5,7955-7964.
vahidhosseini,philipkollmannsberger,samadahadian.fiber-assistedmolding(fam)ofsurfaceswithtunablecurvaturetoguidecellalignmentandcomplextissuearchitecture.small2014,10,4851–4857.
a.mathur,s.w.moore,m.p.sheetz,j.hone.roleoffeaturecurvatureincontactguidance.actabiomater.2012,8,2597.
c.polzin,s.spath,h.seitz.characterizationandevaluationofapmma-based3dprintingprocess.rapidprototypingjournal2013,19,37.
技术实现要素：
本发明技术解决问题：克服关于曲面细胞行为研究较少且操作复杂精准度不够等问题。在材料与组织工程领域提供多曲面大阵列高精度的细胞捕获和排列，提供一种曲面蛋白微图案化制作方法，实现在曲面和管腔内曲面制作微图案的效果，通过接种细胞模拟体内曲面结构上细胞的生长粘附来研究细胞行为，在材料与组织工程领域提供多曲面大阵列高精度的细胞捕获和排列，用于细胞行为的研究。
本发明一种曲面蛋白微图案化制作方法，包括：
将聚合物材料介质倒入可拆卸的模具中；
在所述模具内所述聚合物材料中插入不同直径的光滑杆，所述光滑杆从所述聚合物材料和模具中剥离，得到不同孔径的聚合物材料空管；
制作包含不同形状、大小和设定图案分布的微孔的多孔膜；
所述多孔膜在所述聚合物材料空管的所述管腔内曲面紧贴；
在所述多孔膜上滴加包含粘附蛋白的试剂，所述粘附蛋白通过所述多孔膜上的所述微孔渗透到所述多孔膜下层的所述管腔内曲面上，从所述管腔内表面揭下所述多孔膜，所述粘附蛋白按照所述多孔膜上的所述微孔的设定微图案分布在所述管腔内曲面上；
所述多孔膜上的微孔图案与管腔内曲面上微图案一致，微图案为根据不同的细胞粘附需要设置的特定图案；
接种细胞前用表面活性剂普兰尼克(pluronic127)1mg/ml处理5分钟，加强无蛋白管腔内表面的疏水性。
将细胞接种于所述管腔内曲面上，所述细胞会在所述管腔内表面上按照所述粘附蛋白的设定微图案上粘附生长。
所述聚合物材料为pdms聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,简称pdms)。
所述光滑杆指不同直径经过抛光处理的表面光滑无瑕疵的金属棒或玻璃棒。
所述光滑杆的直径为1mm～6mm，符合小口径血管的直径范围。
还包括将所述聚合物材料抽真空去气泡后在65℃加热4小时，凝固后放入丙酮中使所述聚合物材料溶胀，导致所述光滑杆自然剥离。
所述多孔膜材料为聚对二甲苯(parylene，简写pac)。
所述多孔膜由事先设计的微图案经光刻技术制得。
还包括将所述多孔膜加热软化后浸入酒精中至所述多孔膜上的所述孔洞内充满酒精，同时对所述管腔内曲面进行亲水处理，然后将所述多孔膜置于所述管腔内曲面上，干燥使所述多孔膜在所述管腔内曲面上紧贴。
所述粘附蛋白为细胞外基质蛋白，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原等。
所述多孔膜上的微孔图案与管腔内曲面上微图案一致，微图案为根据不同的细胞粘附需要设置的特定图案，所述特定图案为：内皮细胞为边长17.5μm六边形微图案，心肌、骨骼肌和平滑肌细胞为宽20μm长40μm的长方形微图案。微孔的大小、形状和位置根据不同细胞培养要求设定。
接种细胞前用表面活性剂普兰尼克(pluronic127)1mg/ml处理5分钟，加强无蛋白管腔内表面的疏水性,便于细胞粘附在粘附蛋白微图案上。
所述的方法中的细胞可以是包括哺乳动物细胞和原生动物细胞等任意贴壁细胞。
本发明与现有技术相比的优点在于：
(1)本发明可以实现在化学稳定性和生物相容性好的pdms曲面上制备阵列型蛋白微图案，使细胞在曲面上可以按照预期排列、粘附和生长，可以弥补现在用于曲面结构细胞的研究方法的空缺，从而为体外曲面组织的细胞研究提供可能。目前的曲面微图案方法一般使用拓扑表面为模板，制备曲面拓扑微图案，所制备的微图案不在一个平面上，不能满足后续细胞生物学研究。本发明在曲面上制备的微图案是在同一个平面上，为后续的细胞粘附、铺展、连接研究提供了良好的平台。
(2)本发明中的粘附蛋白微图案与多孔膜上微孔的形状、大小和位置相符合，可以通过设计多孔膜上的微孔形状、大小和位置来实现曲面上的粘附蛋白微图案，微孔的尺度可在2μm到几十微米之间随意变化。由于多孔膜可以很好的贴服在曲面上，曲面的直径可在1-6mm范围内变化。因此，本发明的方法具有可以根据实验需要改变不同曲面和不同微图案的优点。
附图说明
图1为pdms空管；
图2为多孔膜示意图。其内部图案可以按照不同组织中细胞的形状和排布自己设计，精确度可最小达到2μm，误差小于1μm；
图3为经过蛋白微图案化的管腔示意图，其中1-管腔截面示意图、2-蛋白微图案示意图、3-细胞粘附示意图；
图4为曲面蛋白微图案制作方法示意图，其中4-不同直径模具、5-pdms管腔示意图、6-多孔膜、7-粘附蛋白溶液、8-蛋白微图案、9-细胞溶液；
图5直径为1mm曲面蛋白微图案荧光照片(左)，生长在蛋白微图案上的内皮细胞(右)；
图6直径为6mm曲面蛋白微图案荧光照片(左)，生长在蛋白微图案上的内皮细胞(右)
图7直径为5mm曲面微图案与曲面轴向成0(左),45(中)，和90°(右)角度分布的细胞粘附图和细胞骨架分析图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
实施列1：在1mm和6mm直径曲面上培养内皮细胞huvec
(1)聚合物材料pdms空管制备：聚二甲基硅氧烷sylgard184前聚物与交联剂以质量配比为10:1混匀倒入模具中，在模具中央插入直径1mm和6mm抛光玻璃棒，抽真空去气泡后在65℃加热4小时，凝固后放入丙酮中使pdms溶胀导致玻璃棒自然剥离，从而得到不同内径管腔，模拟体内不同直径曲面结构(如图1，图3中的1，图4中的5)。抛光玻璃棒直径可以在1-6mm变化图4中的4，本实施例用1mm和6mm。
(2)根据不同组织细胞的排布和形状设计图案，经光刻技术制作包含不同形状和大小的多孔膜。本实施例为20μm宽，40μm长的长方形微孔，微孔以5μm间隔纵向头对尾排列，整体长度3mm,微孔以50μm间隔横向排列，整体长度3mm(如图2)。将其90℃加热软化后浸入酒精中，待孔内充满酒精后利用液体的导向作用将膜放置于腔内并吹干使其完全贴紧(图4中的6)。配置50μg/ml的粘附蛋白纤维粘连蛋白溶液滴200μl于膜上(图4中的7)，待蛋白渗透20min后揭下多孔膜，形成蛋白质微图案(图3中的2，图4中的8)。pbs清洗3遍，用普兰尼克(pluronic127)1mg/ml处理5分钟使无蛋白区域更加疏水，pbs清洗3遍。所述粘附蛋白为细胞外基质蛋白，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原等，本发明实施例用纤维粘连蛋白。
(3)将浓度为2x105个/cm2内皮细胞混匀后接种于上述曲面上(图4中的9)，37o培养2h可观察到细胞按照设计图案排列生长(图3中的3)。可进行长时间培养观察骨架排布及方向来研究体内细胞的生长及排布。如图5为直径1mm空管内纤维粘连蛋白免疫荧光染色左侧视图，右侧为细胞粘附图。如图6为直径6mm空管内纤维粘连蛋白免疫荧光染色左侧视图，右侧为细胞粘附图。证明本发明可适用于1-6mm直径曲面的微图案化，并可以是细胞粘附。
实施列2：在5mm直径曲面上以不同角度培养内皮细胞huvec
(1)聚合物材料pdms空管制备：聚二甲基硅氧烷sylgard184前聚物与交联剂以质量配比为10:1混匀倒入模具中，在模具中央插入直径5mm抛光玻璃棒，抽真空去气泡后在65℃加热4小时，凝固后放入丙酮中使pdms溶胀导致玻璃棒自然剥离，从而得到不同内径管腔，模拟体内不同直径曲面结构(如图1，图3中的1，图4中的5)。抛光玻璃棒直径可以在1-6mm变化图4中的4，本实施例用5mm。
(2)根据不同组织细胞的排布和形状设计图案，经光刻技术制作包含不同形状和大小的多孔膜。本实施例为20μm宽，40μm长的长方形微孔，微孔以5μm间隔纵向头对尾排列，整体长度3mm,微孔以50μm间隔横向排列，整体长度3mm(如图2)。微孔排列角度与空管轴向夹角为0°(图7中的左图)，45°(图7中的中图)和90°(图7中的右图)。将其90℃加热软化后浸入酒精中，待孔内充满酒精后利用液体的导向作用将膜放置于腔内并吹干使其完全贴紧(图4中的6)。配置50μg/ml的粘附蛋白纤维粘连蛋白溶液滴200μl于膜上(图4中的7)，待蛋白渗透20min后揭下多孔膜，形成蛋白质微图案(图3中的2，图4中的8)。pbs清洗3遍，用普兰尼克(pluronic127)1mg/ml处理5分钟使无蛋白区域更加疏水，pbs清洗3遍。所述粘附蛋白为细胞外基质蛋白，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原等，本实施例用纤维粘连蛋白。
(3)将浓度为2x105个/cm2内皮细胞混匀后接种于上述曲面上(图4中的9)，37o培养12h培养观察骨架排布。如图7结果表明本发明可以在直径5mm曲面制备与曲面轴向有不同夹角的微图案，并且允许细胞粘附，细胞骨架分析表明细胞的排列方向与微图案方法一致。
按照本发明提供的技术方案，曲面微图案技术通过制作生物相容性好的曲面，亲水处理后将多孔膜覆盖其上并吹干使贴紧。通过多孔膜的渗透作用在曲面上形成结构精细、图案完整的微图案用于细胞粘附和后续生长。可以通过设计不同微图案控制细胞的骨架铺展和排布。
总之，本发明中曲面的直径在1mm到6mm间不等，图案的设计精度最大可达2μm，误差不超过1μm，可将细胞准确的定位在图案化曲面上。
提供以上实施例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。