本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及植物乳杆菌ccfm1019、其发酵食品及其在制备药物中的应用。
背景技术：
：邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(以下简称dehp)作为一种塑化剂，添加在塑料中可增加其柔韧性和可塑性。因价格低廉，dehp被广泛地应用于生产医药器材、化工产品等塑料制品，是我国目前使用最广泛的塑化剂。在这些塑料产品中，dehp主要以氢键和范德华力而非共价键的形式与其他分子结合，因此在使用的过程中极易逸出，从而迁移到环境甚至人体中，对动植物和人体健康产生危害。研究表明，dehp在人体内吸收和分布期持续约4～8h，大部分可在24h内被人体完全代谢。尿液是dehp主要的排出途径。dehp进入体内24h后，小于10％的dehp原液直接经尿液排出，约67％的dehp转化为五种二次代谢产物经尿液排出。由于dehp具有脂溶性，少数dehp则滞留于脂肪或乳汁中。储存于脂肪组织中的dehp长时间不能被完全代谢，半衰期长达156h。dehp对机体的毒性作用主要由其代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯mehp发挥。积累在体内的dehp及其代谢产物mehp可产生多种毒性，包括生殖毒性、肝脏毒性、胚胎毒性、甲状腺毒性、神经毒性等。由于dehp是一种过氧化物酶体增殖剂，可以打破细胞内的氧化还原平衡，使细胞内ros等自由基水平升高。此外，dehp及其代谢产物还可通过影响抗氧化基因的表达，导致ros积累从而引发脂质过氧化，产生丙二醛等脂质过氧化物，引起氧化损伤。目前主要通过服用一些如维生素c，维生素e，葡萄籽精华、黄酮类等具有抗氧化作用的生物活性物质来预防和缓解dehp对人体的损害。然而，要通过补充活性物质来缓解dehp的毒性作用需要较大的剂量，而且过量摄取活性物质也会引起机体产生副作用，例如过量黄酮类物质的摄入则会引起人体内分泌紊乱。且以上的方法并不能降低机体内摄入及残留的塑化剂。因此，寻找一种新型、安全的预防和治疗方法显得尤为必要。在目前已经公开的文献中，未见通过益生菌缓解塑化剂毒害的专利。据已有的文献报道，益生菌在体外对dehp最高吸附率仅为9.62％，吸附效果并不理想。因此开发出一种对塑化剂具备较强吸附能力的益生菌，并且通过动物实验证明其能在体内具有良好的缓解塑化剂毒性损伤的作用显得尤为重要。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种植物乳杆菌ccfm1019，(lactobacilusplantarum)，于2018年2月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno.60333。作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种发酵食品。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述发酵食品为使用ccfm1019发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。作为本发明所述的发酵食品的一种优选方案，其中：所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供植物乳杆菌ccfm1019在制备体内定植益生菌中的应用。作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供植物乳杆菌ccfm1019在制备促进体内塑化剂及其代谢产物的排出的药物中的应用。作为本发明所述植物乳杆菌ccfm1019在制备促进体内塑化剂及其代谢产物的排出的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述植物乳杆菌ccfm1019能够耐胃酸、耐胆盐、促进塑化剂及其代谢产物从体内排出、减少塑化剂及其代谢产物在血清中的含量、显著地减轻塑化剂及其代谢产物对睾丸组织和肝脏组织的损害。作为本发明所述植物乳杆菌ccfm1019在制备促进体内塑化剂及其代谢产物的排出的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述塑化剂包括邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯。作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供权利要求2或3所述的发酵食品在制备促进体内塑化剂及其代谢产物的排出的功能性食品中的应用。作为本发明所述发酵食品在制备促进体内塑化剂及其代谢产物的排出的功能性食品中的应用的一种优选方案，其中：所述发酵食品能够耐胃酸、耐胆盐、促进塑化剂及其代谢产物从体内排出、减少塑化剂及其代谢产物在血清中的含量、显著地减轻塑化剂及其代谢产物对睾丸组织和肝脏组织的损害。本发明的有益效果：本发明的植物乳杆菌ccfm1019具有良好的耐胃酸耐胆盐特性，能够促进塑化剂dehp及其代谢产物mehp从体内排出，减少其在血清中的含量，显著地减轻其对睾丸组织和肝脏组织的损害作用。该菌在体外吸附dehp及mehp效果方面(分别为52.22％和70.54％)不仅显著优于肠道常驻菌群大肠杆菌(dehp:5.86％，mehp:0.28％)和粪肠球菌(dehp:1.75％，mehp：0.17％)，且优于商业菌株鼠李糖乳杆菌lgg(dehp:13.75％，mehp:15.60％)。在大鼠体内，可显著降低血清中dehp和mehp含量(对比空白对照组分别降低54.3％和55.7％)，同时提高dehp及mehp在粪便中的含量(对比空白对照组分别提高了34.18％和93.88％)。因此，本发明的植物乳杆菌ccfm1019可以作为预防和缓解因dehp和mehp造成的机体损伤的有效手段，且不具有药物的毒副作用。植物乳杆菌ccfm1019可用于制备缓解、预防dehp及其代谢产物毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1是本专利菌株及对照菌株lactobacilusrhamnosusgg(lgg)、escherichiacoli及enterococcusfaecalis在体外对dehp和mehp的吸附能力的比较示意图；图2是本专利菌株对血清和粪便中dehp及mehp含量的影响示意图；图3是本专利菌株对dehp暴露模型大鼠血清中睾酮水平的改善情况示意图；图4是本专利菌株对dehp暴露模型大鼠睾丸中丙二醛(mda)含量的影响示意图；图5是本专利菌株对dehp暴露模型大鼠睾丸部位组织损伤的改善情况示意图；图6是本专利菌株对dehp暴露模型大鼠血清中alp，ast和alt含量的影响示意图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明的植物乳杆菌ccfm1019(lactobacilusplantarum)，于2018年2月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno.60333。所述植物乳杆菌ccfm1019具有下述生物学特性：(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，具有耐酸性，在ph3.0-7.2环境条件下生长良好，不形成孢子。菌体约(0.9-1.2)μm×(3.0-8.0)μm，圆端直杆菌，单个、成对或短链状，通常缺乏鞭毛但能运动；(2)菌落特征：在mrs培养基上形成明显的菌落，直径在0.3-3.0mm之间，圆形，凸面或透镜状，细密、色白，有平滑至粘液状的柔软表面，不形成菌丝体；(3)生长特性：该菌为兼性厌氧菌，最适生长温度为36-38℃，32-38℃生长良好，15℃亦能生长。最适初始ph为6-7。在含有葡萄糖的培养液中生长良好；(4)对人工模拟胃肠液具有较好的耐受能力；(5)能够缓解dehp及代谢产物mehp对睾丸的损伤；(6)能显著增加粪便中dehp和mehp水平；(7)能显著降低血清中dehp和mehp水平，降低dehp和mehp在机体内的积累；(8)能显著改善血清中谷丙转氨酶alt(glutamic-pyruvictransaminase)，谷草转氨酶ast(glutamicoxalacetictransaminase)和碱性磷酸酶alp(alkalinephosphatase)水平。本菌株的提取方法为：(一)乳酸菌的分离筛选(l)收集产自不同地区的泡菜样本，将样品在含有山梨醇mrs培养基中富集12h；(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的mrs固体平板上，培养24-48h；(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；(4)将上述单菌落培养于液体mrs培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。(二)植物乳杆菌的初步鉴定：溶钙圈测定法(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体山梨醇mrs培养液中培养24h，然后取lml培养物8000×g离心2min；(2)用0.05mkh2po4溶液洗涤两次；(3)将所得菌泥重悬，划线在山梨醇mrs-0.75％caco3的固体培养基上，培养24h；(4)选取溶钙圈明显，且呈凸面圆形、细密色白、无菌丝体的菌落，革兰氏染色后显微镜观察菌体为杆状即初步判定为乳杆菌。(三)植物乳杆菌的分子生物学鉴定(l)单菌基因组抽提a.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lml于1.5ml离心管，10000×g离心2min，弃上清得菌体；b.用lml无菌水吹洗菌体后，10000×g离心2min，弃上清得菌体；c.加入200μlsds裂解液，80℃水浴30min；d.加入酚-氯仿溶液200μl于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000×g离心5-10min，取上清200μl；e.加入400μl冰乙醇或冰异丙醇于200μl上清中，﹣20℃静置1h，12000×g离心5-10min，弃上清；f.加入500μl70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000×g离心1-3min，弃上清；g.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；h.50μlddh2o重溶沉淀以备pcr；(2)16srdnapcra.细菌16srdna50μlpcr反应体系：10×taqbuffer，5μl；dntp，5μl；27f，0.5μl；1492r，0.5μl；taq酶，0.5μl；模板，0.5μl；ddh2o，38μl。b.pcr条件：95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将pcr产物与10×loadingbuffer混合，上样量5μl，120v跑30min，然后进行凝胶成像；(4)将16srdna的pcr产物进行测序分析，将得到的序列结果使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为属于乳酸乳球菌的一种新的乳酸菌目菌株，-80℃保藏备用。实施例1：植物乳杆菌ccfm1019在对模拟胃肠液具有良好的耐受性将冷冻保存的植物乳杆菌ccfm1019划线接种于mrs固体培养基中，在温度37℃有氧静置培养24h，再经mrs培养液传代培养2～3次后，取植物乳杆菌ccfm1019培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1:1)ph2.5的人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、ph＝2.5的mrs培养基)混合，然后在37℃下有氧培养，分别在开始(0h)、1h、2h和3h时取样，用mrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。取植物乳杆菌ccfm1019的培养液，8000×g离心5min收集菌体，重悬于(1:1)人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mrs培养基)中，在37℃下有氧培养，分别在0h、1h、2h、3h和4h时取样，用mrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比，以％表示。实验结果如表1、表2所示，可以看到植物乳杆菌ccfm1019对人工胃、肠液具有良好的耐受性。表1植物乳杆菌ccfm1019在人工模拟胃液中的耐受性表2植物乳杆菌ccfm1019在人工模拟肠液中的耐受性实施例2：植物乳杆菌ccfm1019在体外含塑化剂dehp或mehp水溶液中对dehp和mehp具有良好的吸附能力菌体吸附：将实验菌进行纯化和活化培养后，按照1％(v/v)接种量接入mrs液体培养基，于37℃培养20h(e.coli使用lb培养基于37℃震荡培养；e.faecalis使用mrs液体培养基于37℃培养)，然后在8000×g条件下离心20min，倒掉上清，并用超纯水重悬后继续在8000×g条件下离心20min，倒掉上清即得活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于50mg/ldehp或者10mg/lmehp水溶液中，并使最终菌体浓度达到1g湿菌体/l，空白对照为湿菌体重悬于不含dehp和mehp的超纯水中。每组体积为1ml。将混合液于37℃振荡温育4h，然后于3500×g离心10min，收集上清液并过0.22μm滤膜后，用uplc-ms测定滤液中dehp或mehp的含量，3次平行实验取平均值。dehp和mehp吸附量测定：采用waterseynaptms系统的uplc-ms测定滤液中剩余的dehp或mehp的含量，c18柱(2.1×100mm，1.7μm，watersco.)，柱温35℃，进样量为1μl。a，b洗脱液分别为100％甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min。梯度洗脱条件如表3所示。表3梯度洗脱条件t/min0-0.50.5-7.07.0-7.57.5-10.0洗脱液a比例60％60-100％100-60％60％质谱条件：电离源为esi源；mrm检测(dehp:ms+；mehp:ms-)；capillary(毛细管):3.0kv；conc(椎体):40.00v；sourcetemperature(放射源温度)：120℃；desolvation(去溶剂化)温度：400℃；concgasflow:50l/h；desolvationgasflow:700l/h。气体流速为0.1ml/min；质荷比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用masslynxv4.1(waters公司)分析；在这项研究中，dehp和mehp的最低检测限分别为0.05ppm和0.1ppm。根据吸附前后的dehp或者mehp浓度差异计算乳酸菌的吸附率，吸附率按一下公式计算：吸附率(％)＝[(吸附前水溶液中塑化剂的含量-超纯水中塑化剂的含量)-(吸附后上清液中塑化剂的含量-空白对照中上清液塑化剂的含量)]/(吸附前水溶液中塑化剂的含量-超纯水中塑化剂的含量)×100。这些测定结果列于附图1中，从图1中可明显看出，与商业菌lgg(dehp:13.75％，mehp:15.60％)和肠道常驻菌e.coli(dehp:5.86％，mehp:0.28％)及e.faecalis(dehp:1.75，mehp:0.17％)相比，本发明植物乳杆菌ccfm1019对dehp和mehp的吸附率(dehp:52.22％，mehp:70.54％)均显著高于对照菌，且远远高于已有报导的dehp9.62％的吸附率。因此，植物乳杆菌ccfm1019对dehp和mehp具有良好的吸附能力。实施例3：植物乳杆菌ccfm1019对sd大鼠无急性毒副作用将植物乳杆菌ccfm1019重悬于2％(w/v)蔗糖溶液中，菌体密度为1.0×109cfu/ml。取体重100g左右的健康雄性sd大鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃2ml，观察一周，记录死亡和体重情况。这些试验结果列于表4中。结果表明，喂食浓度1.0×109cfu/ml的植物乳杆菌ccfm1019未对大鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。大鼠外观无明显病理症状。表4大鼠体重的变化及死亡情况注：-：大鼠无死亡实施例4：植物乳杆菌ccfm1019对dehp暴露大鼠血清和粪便中dehp及mehp含量影响取体重100g左右的健康雄性sd大鼠18只，随机分为3组：空白对照组(control)、dehp暴露模型组(dehp)、植物乳杆菌ccfm1019干预组(dehp+ccfm1018)，每组含大鼠6只。试验第1-7天，空白对照组和dehp暴露模型组每天灌胃2ml2％(w/v)蔗糖溶液，植物乳杆菌ccfm1019干预组大鼠灌喂按本说明书实施例3制备的浓度为1.0×109cfu/ml的植物乳杆菌ccfm1019悬液2ml。第8天，将空白对照组的饮水换为含0.05％(m/v)蔗糖脂肪酸酯水溶液；将dehp溶解于0.05％(m/v)蔗糖脂肪酸酯水溶液中，其他除空白组外按3000mg/kg体重·天的染毒剂量进行饮水染毒，染毒期间继续进行益生菌及对照2％(w/v)蔗糖溶液灌胃。连续染毒四周后，收集粪便并将动物安乐处死，收集睾丸和血清，测定血清和粪便中dehp和mehp含量，该测定结果列于附图2中。*表示与对照组中的dehp含量相比具有显著性；*p＜0.05,**p＜0.01，***p<0.005，****p<0.001；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.005，####p<0.001。实验结果表明，植物乳杆菌ccfm1019干预后，可显著降低血清中dehp和mehp含量(对比空白对照组分别降低54.3％和55.7％)，同时提高dehp及mehp在粪便中的含量(对比空白对照组分别提高了34.18％和93.88％)，由此可见植物乳杆菌ccfm1019可有效促进dehp及代谢产物mehp从机体的排出。实施例5：植物乳杆菌ccfm1019对dehp暴露大鼠生殖毒性的缓解作用取实施例4得到的血清，根据elisa试剂盒所示方法测定血清中睾酮含量。结果如图3所示。图3中，*表示与对照组中相比，*p＜0.05,**p＜0.01。称取实施例4中得到的睾丸组织，按1：9(m/m)比例加入生理盐水，于组织匀浆仪中破碎，得10％的睾丸组织匀浆液，测定匀浆液中丙二醛(malonaldehyde，mda)水平。测定结果列于附图4中。图4中*表示与对照组相比具有显著性，#表示与dehp模型组相比具有显著性；*p＜0.05，#p＜0.05。取睾丸组织进行石蜡切片操作并进行常规h&e染色。染色结果如图5所示。通过对dehp暴露模型组及植物乳杆菌ccfm1019干预组血清中睾酮含量、睾丸中mda水平及睾丸病变指标的比较，发现本发明植物乳杆菌ccfm1019能够缓解由dehp摄入导致的大鼠血清中睾酮含量的异常(dehp暴露模型组：19.65mmol/l，ccfm1019干预组：35.99mmol/l)，降低睾丸组织中mda的含量(dehp暴露模型组：50.28nmol/mg，ccfm1019干预组：29.32nmol/mg)，缓解睾丸组织损伤，对dehp摄入造成的生殖损伤起到了显著的缓解作用。实施例6：植物乳杆菌ccfm1019对dehp暴露大鼠血清中肝脏损伤指标的改善取实施例4中血清用于测定大鼠的血液生化指标包括谷丙转氨酶alt，谷草转氨酶ast和碱性磷酸酶alp。结果如图6所示，图6中*表示与对照组中相比具有显著性；*p＜0.05。通过dehp暴露模型组与植物乳杆菌ccfm1019干预组血清学指标进行比较，从图6可知，本发明植物乳杆菌ccfm1019能够有效缓解因dehp摄入导致的ast、alt和alp指标异常。ast在空白对照组，dehp暴露模型组和植物乳杆菌ccfm1019干预组的含量分别为58.35u/l，124.58u/l，71.45u/l；alp在空白对照组，dehp暴露模型组和植物乳杆菌ccfm1019干预组的含量分别为174.25u/l，252.60u/l，205.25u/l；alt在空白对照组，dehp暴露模型组和植物乳杆菌ccfm1019干预组的含量分别为20.00u/l，36.74u/l，28.63u/l。实施例7：利用本发明植物乳杆菌ccfm1019制造含该菌的果蔬饮料选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的植物乳杆菌ccfm1019菌剂发酵剂，使其浓度达到106cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明植物乳杆菌ccfm1019活菌的果蔬饮料。利用本发明能够使用植物乳杆菌ccfm1019发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。所述植物乳杆菌ccfm1019能够耐胃酸、耐胆盐、促进塑化剂及其代谢产物从体内排出、减少塑化剂及其代谢产物在血清中的含量、显著地减轻塑化剂及其代谢产物对睾丸组织和肝脏组织的损害。本发明的植物乳杆菌ccfm1019具有良好的耐胃酸耐胆盐特性，能够促进塑化剂dehp及其代谢产物mehp从体内排出，减少其在血清中的含量，显著地减轻其对睾丸组织和肝脏组织的损害作用。该菌在体外吸附dehp及mehp效果方面(分别为52.22％和70.54％)不仅显著优于肠道常驻菌群大肠杆菌(dehp:5.86％，mehp:0.28％)和粪肠球菌(dehp:1.75％，mehp：0.17％)，且优于商业菌株鼠李糖乳杆菌lgg(dehp:13.75％，mehp:15.60％)。在大鼠体内，可显著降低血清中dehp和mehp含量(对比空白对照组分别降低54.3％和55.7％)，同时提高dehp及mehp在粪便中的含量(对比空白对照组分别提高了34.18％和93.88％)。因此，本发明的植物乳杆菌ccfm1019可以作为预防和缓解因dehp和mehp造成的机体损伤的有效手段，且不具有药物的毒副作用。植物乳杆菌ccfm1019可用于制备缓解、预防dehp及其代谢产物毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12