本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种pet水解酶突变体及其应用。
背景技术：
聚对苯二甲酸乙二醇酯(poly(ethyleneterephthalate)；pet)作为生产和使用量最大的塑料之一，广泛用于食品包装、饮料瓶、管道、电子工业等各个方面，由于pet中含有较高比例的芳烃组分，存在明显化学惰性，自然条件下降解难度很大。因此pet在给人类生活带来很大便利的同时，也给环境带来很大的压力。pet塑料在自然环境中的大量堆积，不仅造成了严重的白色污染，同时也危害着畜牧养殖业、旅游业和人体健康。
目前，针对塑料问题，并没有特别的解决方法。若是进行焚烧发电，又会产生有毒有害气体威胁人类和环境健康；常规的垃圾掩埋技术已经被证明会污染土壤，造成土壤肥力流失；虽然目前部分塑料垃圾得到了回收，但是更多的塑料则是被遗弃在了环境之中，无法得到妥善的解决。而pet等塑料的降解方式主要有光氧化降解、热氧化降解和生物降解。其中光氧化降解、热氧化降解是塑料自然降解的主要方式，这个过程需要较长的时间(几十年，甚至上百年)，而且根据不同的环境条件，降解速度差异很大；同时已有研究表明，这种降解并不彻底，纳米级塑料碎片可以吸收进入生物体内，从而危害生物体健康。
研究者们发现，自然界中有一部分微生物(特别是一些真菌和细菌)在某些特定条件下可以通过分泌胞外酶来降解塑料，将其作为自身生长所需的碳源和氮源，并且有着较好的降解能力和高效的降解速率。这为解决塑料污染问题提供了解决的思路和方向。
最近有报道称【yoshidas.etal,abacteriumthatdegradesandassimilatespoly(ethyleneterephthalate)，science,2016,351(6278),1196-9】，日本科学家从细菌ideonellasakaiensis中，分离鉴定了一种新的降解pet塑料的pet水解酶(petase)，该酶能够催化分解pet，产生对苯二甲酸单羟乙酯(mhet)单体，最终转化为乙二醇(eg)和对苯二甲酸(tpa)这两种结构相对简单的化合物。该酶反应条件简单，常温下即可进行酶促反应，为pet塑料的生物降解带来了希望，但目前降低效率仍有待提高，需要进一步改造后才能用于工业化应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够有效降解pet塑料的水解酶(petase)突变体及其应用。
本发明提供了一种pet水解酶突变体，它是在野生型pet水解酶的基础上，经过氨基酸位点突变得到，所述野生型pet水解酶的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述突变的位点为tyr58、trp130、ala180、ser185中至少一个位点。
其中，它包含tyr58ala、trp130his、ala180ile、ser185his的至少一个突变。
突变以tyr58ala为例，是指第58位的氨基酸从tyr突变为ala。
其中，它的氨基酸序列为seqidno：2-5任意一项所示。
本发明还提供了一种编码pet水解酶突变体的核苷酸序列，它编码seqidno：2-5任意一项所示的氨基酸序列；优选地，它的序列如seqidno：7-10任意一项所示。
本发明还提供了一种重组载体，它包含上述核苷酸序列；所述的重组载体是原核表达载体；优选地，所述原核载体为pet21b载体。
本发明还提供了一种重组菌，它包含上述重组载体；优选地，所述细菌为大肠杆菌bl21-codonplus(de3)ripl菌株。
本发明还提供了一种制备上述pet水解酶突变体的方法，包含如下步骤：
a、取上述重组菌，接种到lb培养基上，振荡培养至od600为0.8-1.0时，用iptg进行诱导培养；
b、离心，取沉淀，分离纯化，即可。
其中，所述诱导培养的条件为：0.1mmiptg，16℃下，220rpm，培养18h；
所述分离纯化时，依次使用ni亲和层析柱、resources离子交换柱及凝胶层析柱纯化蛋白。
本发明还提供了上述pet水解酶突变体在制备pet降解剂中的用途。
本发明还提供了一种pet降解剂，它含有上述pet水解酶突变体、上述核苷酸序列、上述重组载体，或上述重组菌。
本发明通过结构生物学与生物信息学方法对pet水解酶(petase)进行改造，获得的突变体对pet塑料的分解能力增强，与野生pet水解酶相比，活性大大提高，提高了对pet塑料的降解效率，具有良好的工业应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1野生型及不同突变体蛋白对pet塑料瓶降解能力测定(wt：野生型petase蛋白)。
图2活性提高突变体蛋白对pet塑料瓶降解能力测定及显著性比较，注：*代表差异性显著(p<0.05)，**代表性差异性极显著(p<0.01)。
图3活性提高突变体蛋白的相对活性变化(以野生型(wt)活性作为1，计算其他蛋白的活性)。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明pet水解酶突变体的制备及活性检测
一、实验方法
1、野生型及突变体重组质粒的构建
1)将petase基因(uniprot编号：a0a0k8p6t7，由金斯瑞生物科技有限公司进行人工合成，合成时去掉该蛋白n端信号肽(第1-29位氨基酸)，将第30位氨基酸(n)命名为新序列的第1位氨基酸。由于载体构建的特性，在1位氨基酸之前额外添加了3个氨基酸。最终形成序列如seqidno：6所示)克隆到pet21b载体的ndei和xhoi位点之间，形成pet21b-petase质粒；使用的试剂盒为gibsonassemblycloningkit(neb公司，货号e5510s)；随后以此为基础，进行定点突变pcr。
2)定点突变：
根据拟突变的氨基酸序列进行设计引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，所用引物见表1。
表1定点突变引物
注：加粗字体表示突变氨基酸的位置
(y：tyrosine，酪氨酸；a：alanine，丙氨酸；w：tryptophan，色氨酸；h：histidine，组氨酸；i：isoleucine，异亮氨酸；s：serine，丝氨酸；l：leucine，亮氨酸；q：glutamine，谷氨酰胺；r：arginine，精氨酸；m：methionine，甲硫氨酸；c：cysteine，半胱氨酸；f：phenylalanine，苯丙氨酸；n：asparagine，天冬酰胺)
利用所得的引物进行定点突变pcr，模板为pet21b-petase质粒，所用酶为q5高保真酶(neb公司，货号m0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；72℃，3min；72℃，5min；4℃，保存；运行25个循环。
对pcr产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号dp214)，随后利用限制性内切酶dpni(neb公司，货号r0176l)去除模板(37℃，2h)，将上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(dh5α)中，涂布于lb(含100μg/ml氨苄抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。挑取平板中的单克隆，测序(北京擎科新业生物技术有限公司)，获得含有目标突变的正确克隆。
野生型及突变型重组质粒中，petase核苷酸序列及氨基酸序列分别如下：野生型及突变型petase核苷酸序列如下：
野生型petase序列：(seqidno：6)
atgcagaccaacccgtacgcgcgtggtccgaacccgaccgcggcgagcctggaggcgagcgcgggtccgttcaccgtgcgtagctttaccgttagccgtccgagcggttacggtgcgggtaccgtgtactatccgaccaacgcgggtggcaccgtgggtgcgatcgcgattgttccgggttataccgcgcgtcaaagcagcatcaagtggtggggtccgcgtctggcgagccacggtttcgtggttatcaccattgacaccaacagcaccctggatcagccgagcagccgtagcagccagcaaatggcggcgctgcgtcaagttgcgagcctgaacggtaccagcagcagcccgatctatggcaaggtggacaccgcgcgtatgggcgttatgggttggagcatgggtggcggtggcagcctgattagcgcggcgaacaacccgagcctgaaagcggcggcgccgcaggcgccgtgggatagcagcaccaacttcagcagcgtgaccgttccgaccctgatctttgcgtgcgagaacgacagcattgcgccggtgaacagcagcgcgctgccgatctacgatagcatgagccgtaacgcgaagcagttcctggaaattaacggtggcagccacagctgcgcgaacagcggtaacagcaaccaagcgctgattggcaagaaaggtgtggcgtggatgaaacgtttcatggacaacgatacccgttatagcacctttgcgtgcgaaaacccgaacagcacccgtgttagcgactttcgtaccgcgaactgcagc
y58apetase序列：(seqidno：7)
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w130hpetase序列：(seqidno：8)
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a180ipetase序列：(seqidno：9)
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s185hpetase序列：(seqidno：10)
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野生型及突变型petase蛋白氨基酸序列如下：
野生型petase氨基酸序列：(seqidno：1)
mqtnpyargpnptaasleasagpftvrsftvsrpsgygagtvyyptnaggtvgaiaivpgytarqssikwwgprlashgfvvitidtnstldqpssrssqqmaalrqvaslngtssspiygkvdtarmgvmgwsmggggslisaannpslkaaapqapwdsstnfssvtvptlifacendsiapvnssalpiydsmsrnakqfleinggshscansgnsnqaligkkgvawmkrfmdndtrystfacenpnstrvsdfrtancs
y58apetase氨基酸序列：(seqidno：2)
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w130hpetase氨基酸序列：(seqidno：3)
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a180ipetase氨基酸序列：(seqidno：4)
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s185hpetase氨基酸序列：(seqidno：5)
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2、野生型及突变体蛋白的表达纯化
1)取野生型及突变体重组质粒，分别转化入大肠杆菌表达菌株(e.colibl21-codonplus(de3)ripl)。
2)挑取单克隆菌体，随后置于lb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中进行过夜培养(37℃，220rpm)，将过夜培养所得菌液转接(1：1000)入1llb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中继续进行培养(37℃，220rpm)，通过紫外分光光度计对菌体浓度进行测定，待od≈0.8-1.0时，加入0.1mmiptg进行诱导，将所得菌液继续培养18h(16℃，220rpm)。
3)将菌液进行离心(4000rpm，15min，4℃)，弃上清，保留得到的菌体，利用缓冲液1(50mmtris-hcl，300mmnacl，20mm咪唑，ph7.5)将菌体进行重悬，利用超声破菌仪对悬浮菌液进行破碎(超3s，停6s，15min)，高速离心(18000rpm，20min，4℃)，用以去除菌体碎片，保留上清液，将所得的上清液过ni柱：先将上清液与ni胶进行孵育(2h，4℃)，随后去除其中液体，用缓冲液1对ni胶进行冲洗，接着用缓冲液2(50mmtris-hcl，300mmnacl，250mm咪唑，ph7.5)将目的蛋白洗脱下来。
4)利用离子交换柱resources对上述洗脱得到的蛋白进行进一步纯化，接着利用凝胶层析柱enrichsec650进一步纯化蛋白，对所得蛋白进行浓缩，并利用微量分光光度计nanodrop2000uv-vis对蛋白浓度进行测定。在最终所得蛋白中加入甘油(v/v＝1:1)，随后储存于-80℃备用。
3、活性分析
酶活反应体系：700μl反应缓冲液(50mmglycine-naoh，50mmnacl，ph9.0)中加入50nmpetase蛋白(或突变体蛋白)和pet塑料瓶碎片(常见市售矿泉水瓶，以怡宝为例)，置于30℃反应20h。每个反应均做3次重复。
热激(80℃，10min)终止反应；反应液通过0.22μm过滤器进行过滤。然后进行高效液相色谱(hplc)产物测定与分析。
仪器为agilent1260infinitysystem，分析柱为swellc185μmanalyticalcolumn(4.6×150mm)，流动相为乙腈/水(含0.1％甲酸)，流速1ml/min，波长240nm。程序为：0-15min，10-90％乙腈梯度；15-17min，90％乙腈；17-18min，90-10％乙腈梯度；18-23min，10％乙腈。
使用的标准品：
对苯二甲酸单羟乙酯(mhet)由bis(2-hydroxyethyl)terephthalat(bhet，购自tci公司，货号b3429)经过petase酶水解得到，经纯度鉴定后，作为hplc中出峰时间和浓度参考。
对苯二甲酸(tpa，购自tci公司，货号t0166)，经纯度鉴定后，作为hplc出峰时间和浓度参考。
二、实验结果：
1、野生型及不同突变体蛋白的活性测定结果
见图1。
活性测定原理如下：hplc实验中，溶液中化合物的量与峰面积成线性关系，因此可以通过峰面积来计算溶液中化合物的量。本实验中，根据反应后体系中各产物的峰面积，计算出本次反应中的产物的量。而且酶促反应中，相同时间内，相同数量的酶催化产生的产物越多(或者消耗底物越多)，则证明该酶具备越好的催化效果。因此，通过酶活测定实验，由产物的峰面积来定义突变体蛋白对底物的催化效果。产物越多(因为底物无法溶解，因此难以进行定量)，则说明该突变体蛋白具有越好的活性。
由图1可见，不同氨基酸定点突变蛋白的活性差异大，与野生型pet水解酶相比，y58a、w130h、a180i和s185h突变体蛋白对pet塑料瓶的降解能力有效提高，而其它12种突变体的降解能力变化不大、甚至大大降低。
2、4种活性提高突变体蛋白的活性分析
结果见图2-3及表2。
表2活性提高的突变体蛋白的降解数据
可见，4种突变体蛋白对pet塑料的降解活性均显著高于野生型蛋白，其中，y58a、w130h和s185h突变体，催化pet塑料产生的产物量提高了2-4倍，a180i催化产生的产物中mhet提高约2倍。
pet是一个难以降解的不溶性高聚物，本发明4种突变体均显著提高了pet水解酶活性，大大提高了pet塑料的降解效率，工业应用前景良好。
序列表
<110>四川大学
<120>pet水解酶突变体及其应用
<130>gy007-18p1110
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>264
<212>prt
<213>细菌(ideonellasakaiensis，野生型petase)
<400>1
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<213>细菌(ideonellasakaiensis，s185hpetase序列)
<400>10
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