一种磷酸化蛋白激酶SAPK10突变体及其方法与流程

文档序号：15306627发布日期：2018-08-31 21:06阅读：778来源：国知局

本发明属于基因工程以及作物遗传改良技术领域，具体涉及一种磷酸化蛋白激酶sapk10突变体及其方法。

背景技术：

snrk2是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸激酶家族，主要参与植物的抗逆胁迫和aba诱导的信号转导过程(shuklaandmattoo，2008)。已报道一些snrk2激酶家族成员受aba的诱导(boudsocqetal.，2004；kobayashietal.，2005)，并在植株响应aba介导的植株发育和种子休眠过程中发挥着关键的作用(johnsonetal.，2002；mustillietal.，2002；fujiietal.，2007)。

脱落酸(abscisicacid，aba)是20世纪60年代鉴定的一种天然激素，是一类15碳的酸性倍半萜，广泛存在于高等植物中。脱落酸调节植物多种生长发育及抗逆胁迫过程。当植株遭遇逆境(干旱、高渗胁迫，寒冷，高温，水涝等)，其体内会快速合成和累积aba，增强抵御外界非生物胁迫的能力(zhuetal.，2002)，因此aba也被称为应激激素或胁迫激素(stresshormone)，是植物较为重要的一类抗逆诱导因子。另一方面，脱落酸在调节植物器官的发育和种子的萌发方面也发挥着重要的作用(nakashimaandyamaguchi-shinozaki，2013)。

已报道脱落酸(aba)调节作物的许多农业性状，包括调控种子贮藏蛋白和脂类的合成、提高植株的耐旱性与抑制种子萌发、抑制植株由营养生长阶段到生殖生长的转变等，其遗传学基础和生理方面的具体机制研究主要是通过aba合成缺失或aba不敏感型突变体进行的。如在拟南芥中，通过遗传学筛选获得了一系列拟南芥aba合成途径阻断的突变体，包括aba1、aba2、aba3等，这些突变体的种子休眠程度下降，同时苗期生长受aba抑制的程度降低；另一方面，aba-不敏感型突变体(abi4，abi5)的种子具有正常含量的内源aba，但种子休眠程度显著下降，并且苗期的生长对aba的敏感性下降，表型与aba合成途径缺失的突变体相似。abi4和abi5是aba信号途径的正调控因子，前者属于apetala2型转录因子，后者属于bzip型转录因子，均促进种子的休眠和抑制苗期的生长(finkelsteinetal，2002；seoetal.，2006)

蛋白的磷酸化修饰是一类主要的翻译后修饰方式之一，将atp或gtp第λ位的磷酸化基团转移到底物的氨基酸(丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸)残基上，该过程是可逆的，主要分别由蛋白激酶和磷酸酶执行。生物体的许多细胞核蛋白和细胞质蛋白受到磷酸化的修饰，包括各类代谢途径里的转录因子或调节蛋白，影响后者与dna的结合能力、二聚体的形成、蛋白的活性、蛋白间的互作以及蛋白的靶向运输等，最终影响植株的生长和发育。已报道pyr/pyl/rcar-pp2c-snrk2双重负调控模式来感知和传递aba信号，调控下游靶基因对aba信号的应答。具体是pyr/pyl/rcar受体蛋白与aba结合后，竞争性结合pp2c(一类磷酸酶，主要功能是去磷酸化修饰靶蛋白)，pyr/pyl/rcar-pp2c复合物抑制pp2c的活性，使pp2c去磷酸化snrk2的能力下降，snrk2酶活提高，snrk2激酶可磷酸化abf(abre-bindingfactor)/areb(abaresponsiveelementbindingprotein)/abi5等bzip型转录因子，abf/areb被激活后可结合启动子上含abre(abaresponsiveelements)元件的下游靶基因，调节植株的各种生长发育和抗逆过程；而在正常条件下，pp2c去磷酸化snrk2，使后者的酶活下降，关闭脱落酸信号转导途径，维持植株自身的稳态(nakashimaandyamaguchi-shinozaki，2013)。

2004年，kobayashi等人检测了水稻snrk2激酶家族的10个成员(sapk1-sapk10)受高渗胁迫和aba处理下的激酶活性(后面简称酶活)，结果发现所有成员的酶活均受到高渗胁迫的诱导，部分成员的酶活还受aba的诱导。其中sapk1和sapk2的酶活受磷酸化修饰的调控，当这两个成员受到磷酸酶去磷酸化修饰后，酶的活性下降，通过突变sapk1蛋白上t-loop环上可能的氨基酸位点(第158位丝氨酸，第159位苏氨酸和第162位苏氨酸)使之成为持续磷酸化蛋白形式，研究人员发现sapk1激酶丧失磷酸化修饰下游靶蛋白的能力，即使是受到高渗胁迫的处理，表明这几个磷酸化修饰氨基酸位点对于sapk1发挥激酶功能至关重要(kobayashietal.，2004)。2006年，belin等人发现拟南芥snrk2激酶家族成员snrk2.6的原核表达蛋白存在自磷酸化修饰现象，通过质谱分析发现位于t-loop上的第175位丝氨酸的磷酸化修饰对其酶活的发挥具有重要的作用，同时转基因研究表明该位点突变后影响气孔的关闭，从而调节植株抵御干旱逆境(belinetal.，2006)。目前关于水稻snrk2激酶家族基因成员sapk10的磷酸化修饰位点及其转基因效应还未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种改变水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶sapk10磷酸化修饰位点及其方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

研究表明，拟南芥snrk2激酶家族成员snrk2.6的磷酸化状态对该激酶活性的发挥具有重要的作用。而ser-175(s175)被报道为snrk2.6的磷酸化调控关键位点(belin，2006)。用sapk10蛋白序列与snrk2.6序列比对后发现，sapk10蛋白序列第177位丝氨酸为s175的同源位点，是可能的磷酸化位点，将丝氨酸突变成丙氨酸(ala)可以模拟非磷酸化形式的sapk10蛋白，即将sapk10^s177同源位点经过突变，突变成丙氨酸。

一种磷酸化蛋白激酶sapk10突变体，sapk10的第177位由丝氨酸(ser)突变为丙氨酸(ala)。

所述的磷酸化蛋白激酶sapk10突变体编码基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

所述的磷酸化蛋白激酶sapk10突变体的氨基酸序列如seqidno：3所示。

一种改变水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶sapk10磷酸化修饰位点的方法，具体为将sapk10蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第177处氨基酸残基丝氨酸(ser)突变为丙氨酸(ala)；得修饰过的sap10蛋白，记为sapk10^s177a，其中s表示ser，a表示ala。

本发明利用玉米ubiquitin启动子分别启动未修饰过的sapk10和修饰过的sapk10^s177a基因序列，通过转基因的方法转入水稻，得到未修饰的sapk10转基因水稻和经过修饰的sapk10^s177a转基因水稻。农艺性状分析显示在自然栽培条件下，sapk10转基因水稻植株长势矮小，株高明显下降，粒型、结实率、千粒重、有效穗数、穗长方面均较野生型有明显的下降，这与aba抑制植株生长是一致的，同时在种子萌发方面休眠加深，萌发延迟；而sapk10^s177a超表达材料对aba敏感程度降低，农艺性状上株高能恢复至野生型的水平，同时粒型、结实率、千粒重、有效穗数、穗长也具有同样的回复趋势，而在种子萌发能力可以恢复至野生型nip的水平。上述结果表明sapk10蛋白第177处氨基酸残基通过非磷酸化修饰，由丝氨酸(ser)突变为丙氨酸(ala)后，植株对aba的敏感性下降。

本发明的有益效果为：

本发明通过将水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶sapk10的第177位磷酸化位点丝氨酸(ser)经过基因工程修饰突变为丙氨酸(ala)，模拟非磷酸化形式的sapk10蛋白，同时通过玉米ubiquitin启动子驱动，转化水稻后较磷酸化位点未修饰的sapk10转基因水稻相比对aba敏感性下降，具体表现在农艺性状如株高、粒型、结实率、千粒重、有效穗数、穗长等能回复至野生型nip的水平，而种子萌发同样对aba不敏感，其种子萌发在不同aba浓度梯度的处理下能够恢复至野生型的程度，表明该磷酸化位点在sapk10响应aba调控植株生长和种子萌发上发挥着重要的作用。

附图说明

图1是水稻与拟南芥snrk2激酶家族成员t-loop部分序列磷酸化位点联配分析图；

图2是pu1301质粒图谱；

图3是玉米ubiquitin启动子分别驱动水稻野生型sapk10和磷酸化位点修饰后的sapk10^s177a在转基因水稻t0代植株阳性材料鉴定；

图4是转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系的qrt-pcr检测；

图5是转基因阳性株系sapk10^s177a的磷酸化位点突变的测序验证；

图6是转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系的农艺性状分析；

图7是转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系的粒型性状考察；

图8是转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系的种子在脱落酸(aba)不同浓度(对照，不施加aba；2μmaba；5μmaba；10μmaba)处理下的萌发率统计；

图9是转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系的种子在脱落酸(aba)不同浓度(对照，不施加aba；2μmaba；5μmaba；10μmaba)处理4天后的地上部长度统计。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明实技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1sapk10定点突变

1、寻找可能的磷酸化位点：从水稻基因组注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载拟南芥10个snrk2家族成员和10个水稻的同源蛋白做序列联配比对(图1)，发现sapk10蛋白序列第177位丝氨酸(seqidno：1)是与拟南芥ost1的第175位丝氨酸的最可能的同源位点。

2、定点突变引物设计：由于不同物种蛋白的密码子偏好不同，因此利用dnastar公司的editseq软件对sapk10中编码丙氨酸的密码子进行统计，发现sapk10中gcc为主要的丙氨酸密码子，因此选择将sapk10ser-177突变为gcc(ala)。通过设计带有突变碱基的引物，引物序列如下：

表1sapk10蛋白ser的点突变引物

3、提取nipponbare水稻叶片组织rna。rna提取采用上海翊圣生物科技有限公司公司trizol试剂(产品货号10606es60)抽提方法，操作步骤如下：

1)研钵和研棒用液氮预冷，取50～100mg组织用液氮充分研磨，加1mltrizol(样品体积不能超过trizol的10％)，继续研磨直至完全成为粉末，待融化成匀浆后转入离心管，室温下放置5分钟；

2)加入200μl氯仿，剧烈摇荡15秒，室温放置2-3分钟，于4℃，15000g离心10分钟；注：离心后混合物可分3层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯酚氯仿层。rna存在于水样层中。

3)小心吸取400-500μl上层水相至新的离心管中，再加入等体积的氯仿，加入1/2体积异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min，于4℃，15000g离心10分钟；注：rna沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

4)小心弃去上清，加入1ml75％乙醇(depc水配制)，涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来，于4℃，12000g离心5分钟；注：0.1％depch2o：取1mldepc水加入1l去离子水中混匀，放置过夜后高压灭菌。

5)小心弃去上清，加入1ml75％乙醇(depc水配制)，涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来，于4℃，7500g离心5分钟，弃上清，剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要丢失rna沉淀；注：0.1％depch2o：取1mldepc水加入1l去离子水中混匀，放置过夜后高压灭菌。

6)室温放置空气干燥5-10min。加入50μldepc水溶解rna，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液-70℃保存。注：rna沉淀不能彻底干燥，过分干燥会导致rna溶解度降低。

7)用nanodrop核酸蛋白测定仪nd-2200测其浓度及质量：检测260nm，280nmod值，并计算a260/a280比值:1.8～2.0为蛋白去除指标；检测260nm，230nmod值，并计算a260/a230比值:1.8～2.0为盐分去除指标。

8)逆转录

第一链cdna合成采用toyobo公司的逆转录酶试剂盒(货号：fsk-100)，在进口的0.2ml离心管内混合下列试剂：

样品混匀后，短暂离心，65℃变性5min，迅速置于冰上冷却2min，短暂离心后，再向管内加入下列试剂：

用移液枪轻轻混匀样品，置于pcr仪中进行逆转录反应，扩增反应程序为：1cycle(42℃，60min)，1cycle(99℃，5min)，1cycle(4℃，5min)。反应结束后-20℃保存。

4、pcr扩增

利用水稻cdna为模板，利用步骤2设计的引物，先用各个点突变组合中的p1+p2，p3+p4引物组合做pcr，产物回收。

pcr反应体系为50μl。

第一个反应包括cdna模板100ng，10μm引物p1和p2各0.75μl，2×pcrbuffer25μl，2mmdntp混合液5μl，kod-plusnero1μl(toyobo公司，货号kod-401，1u/μl)，25mmmgso42μl，加ddh2o至总体积50μl。pcr扩增反应程序为：1cycle(94℃，2min)，29cycles(94℃，15s；70℃，30s；68℃，30s)，1cycle(68℃，10min)。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。

第二个反应包括cdna模板100ng，10μm引物p3和p4各0.75μl，2×pcrbuffer25μl，2mmdntp混合液5μl，kod-plusnero1μl(toyobo公司，货号kod-401，1u/μl)，25mmmgso42μl，加ddh2o至总体积50μl。pcr扩增反应程序为：1cycle(94℃，2min)，29cycles(94℃，15s；70℃，30s；68℃，30s)，1cycle(68℃，10min)。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。

然后以上述2个pcr产物等量混合作为模板，再用p1+p4引物组合扩增出突变型sapk10^s177a基因(seqidno：2，蛋白序列为seqidno：3)，具体为：

pcr反应体系为50μl，包括cdna模板100ng，10μm引物p1和p4各0.75μl，2×pcrbuffer25μl，2mmdntp混合液5μl，kod-plusnero1μl(toyobo公司，货号kod-401，1u/μl)，25mmmgso42μl，加ddh2o至总体积50μl。pcr扩增反应程序为：1cycle(94℃，2min)，29cycles(94℃，15s；70℃，30s；68℃，1min)，1cycle(68℃，10min)。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。

实施例2载体构建与转基因阳性株系的鉴定

1、双元载体的构建：将实施例1中扩增出的突变型sapk10^s177a基因产物回收后，通过kpni(酶切位点为gaatcc)和bcli(bamhi的同尾酶，酶切位点为tgatca)酶切后，连入pu1301(图2)，得到pu1301-ubiquitin-sapk10^s177a超表达载体，测序验证，验证结果为正确。同时，利用水稻cdna为模板，p1+p4引物组合扩增出野生型sapk10基因(seqidno：4)，同样方法连入pu1301，得到pu1301-ubiquitin-sapk10超表达载体。

2、转基因。遗传转化的受体材料为粳稻(oryzasativel.sspjaponica)品种nipponbare，后面简称nip。分别将pu1301-ubiquitin-sapk10和pu1301-ubiquitin-sapk10^s177a通过农杆菌eha105介导的水稻遗传转化体系导入到nip中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因阳性植株。农杆菌(eha105)介导的水稻遗传转化体系主要应用hiei等人(1994)报道的方法。

3、阳性苗鉴定。转基因材料是潮霉素hpt(hygromycinphosphotransferase)基因为筛选标记，通过引物对hpt-1-f(5’-tttctttgccctcggacgagt-3’)、hpt-1023-r(5’-atgaaaaagcctgaactcacc-3’)进行pcr阳性检测。pcr反应体系为20μl，包括dna模板100ng，10μm引物对各0.75μl，2×hieff^tmpcrmastermix(withdye)(上海翊圣生物科技有限公司，货号10102es03)，加ddh2o至总体积20μl。pcr扩增反应程序为：1cycle(94℃,7min)，30cycles(95℃,30s；62℃,30s；72℃,1min)，1cycle(72℃,5min)。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。

结果见图3，在随机选取的转基因株系野生型sapk10共6个t0转基因株系中，有4个潮霉素筛选为阳性，阳性率为66.7％；在随机选取的转基因株系sapk10^s177a共8个t0转基因株系中，有6个潮霉素筛选为阳性，阳性率为75.0％。

实施例3转基因阳性株系的表达量检测及测序验证

首先选取实施例2中鉴定到的转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系并检测基因是否超表达，分别记为sapk10(o)-1，sapk10(o)-2，sapk10^s177a(o)-1，sapk10^s177a(o)-2。采用实施例1中的trizol法分别提取nipponbare和野生型sapk10和sapk10^s177a各2个株系的叶片总rna(所构建的载体为玉米的ubiquitin组成型表达启动子，如果为转基因阳性植株，那么植株体会整体超表达sapk10和sapk10^s177a)，逆转录成cdna，并以定量pcr反应测定转基因植株表达丰度。

表2、sapk10转基因株系定量检测的引物

试剂及qrt-pcr体系和程序：

master为bio-rad公司的itaq^tmuniversalsybrgreensupermix

反应体系(10μl)：2×master5μl，cdna模板0.1μl，primer-up(10μm)0.2μl，primer-low(10μm)0.2μl，h2o4.5ul，total10ul。

定量pcr反应仪器为bio-rad公司cfx96^tm定量pcr仪。

pcr反应程序为：95℃5分钟；(94℃10s，58℃15s，72℃14s)x45个循环。溶解曲线检测条件：95℃5s，65℃1分钟。反应结束后冷却：40℃,30s)，每个基因每次设3次重复。

用参照基因(如ubiquitin,genbankaccessionno.af184280)作为标准进行相对定量，优点是能准确量化初始材料的载量，缺点是这个方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因。用相对定量比较多个样本，样本之一常被选为参照。在其它所有样本中目的基因的表达都相对于参照上调或下调，通常用未处理的或基准样本作为参照样本，一般选择野生型样本。

进行相对基因表达分析普遍采取2^-δδct法(livakandschmittgen,2001)，条件是目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相互效率偏差在5％以内。

如图4所示，定量pcr反应结果显示转基因株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系均超表达了sapk10基因，其表达量均为野生型对照的50倍以上。同时以上述sapk10^s177a转基因株系逆转录出来的cdna为模板(因sapk10^s177a在转录水平上过量表达后，其模板量远远高于植株本底表达的野生型sapk10)，用实施例1中的引物对p1和p4扩增出sapk10^s177a序列，pcr体系和扩增程序同实施例1中的方法，扩增产物送公司测序，测序结果与野生型sapk10基因进行比对分析，发现在sapk10基因的cdna序列的529bp和531bp处产生点突变(sapk10基因的cdna序列即为seqidno：4所示的cdna序列)，由一个编码丝氨酸的密码子突变成编码丙氨酸的密码子，表明sapk10蛋白在第177位氨基酸位置确实由丝氨酸突变为丙氨酸，从而模拟非磷酸化形式的sapk10^s177a蛋白(图5)。

实施例4转基因阳性株系的农艺性状分析

取nip野生型和实施例3鉴定的转基因阳性株系sapk10和sapk10^s177a各2个株系水稻种子40颗，37℃浸种至露白。将露白的种子田里育秧1个月后，分别移栽到中国水稻研究所位于富阳的同一块转基因试验田中，完成整个生长周期(约4个月后)进行植株农艺性状分析，种子的粒型以及种子的萌发能力考察。

如图6所示，在自然栽培条件下，转野生型sapk10超表达株系长势矮小，株高较野生型nip明显下降，有效穗数(每穗实粒数大于或等于5粒作为有效穗)、穗长和结实率均较野生型有明显的下降。而sapk10^s177a超表达株系的农艺性状分析显示sapk10的自磷酸化位点突变为非磷酸化位点后，株高能回复至野生型的水平，同时有效穗数、穗长和结实率表现出相同的回复趋势(图6)。已报道rab16a基因(loc_os11g26790，johnmundyandnam-haichua,1988)是受aba显著诱导的基因，可作为是否对ab敏感的指示基因，通过采用实施例1的方法提取叶片组织的rna并逆转录，采用实施例3的定量pcr检测方法，进一步分析了rab16a基因在转野生型sapk10超表达株系和sapk10^s177a超表达株系的表达水平，结果显示rab16a基因在转野生型sapk10超表达株系的表达量远远高于其在野生型nip和sapk10^s177a超表达株系的表达量，约是后两者的十几倍，表明转野生型sapk10超表达株系对aba敏感，而模拟非磷酸化修饰后的sapk10^s177a超表达株系对aba的敏感性下降并接近野生型，这与上述的农艺性状是一致的，因aba抑制植株的生长(finkelsteinetal,2002)。

另一方面，转野生型sapk10超表达株系种子的粒长、粒宽和干粒重均较较野生型nip明显下降，而sapk10^s177a超表达株系在这些方面能回复或接近野生型nip的水平(图7)。上述结果表明第177位的磷酸化位点对于sapk10响应aba具有重要的作用，而当该位点模拟非磷酸化修饰后，转基因植株对aba的敏感性下降。

实施例5转基因阳性株系的种子萌发能力分析

已报道脱落酸(abscisicacid，后面简称为aba)抑制种子萌发，而sapk10超表达材料对aba敏感，其种子萌发延迟(linetal,2015)。对同期收取的相同熟期的野生型nip、实施例3鉴定的sapk10超表达株系和模拟非磷酸化的sapk10^s177a超表达株系的种子分别进行脱落酸不同浓度梯度(对照，不施加aba；2μmaba；5μmaba；10μmaba)的处理，结果如图8和图9，sapk10超表达株系对脱落酸敏感，较野生型nip的种子休眠加深，萌发延迟，萌发4天后的地上部长度明显低于野生型nip；而模拟非磷酸化的sapk10^s177a超表达株系能够消除这种萌发延迟的现象，并且萌发4天后sapk10^s177a超表达株系的种子地上部的高度能够接近或回复至野生型nip的水平，表明该位点对于sapk10参与aba介导的种子萌发过程同样起着重要的作用(图8和图9)。

通过转基因产生的不同株系是不同的，虽然是同一个基因，但是由于插入位点、拷贝数等的差异，都可能导致基因功能的差异，进而导致上述测定结果的不同。用2个株系的结果是为了排除由于转基因过程产生突变的可能性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种磷酸化蛋白激酶sapk10突变体及其方法

<141>2018-04-09

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>362

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalaalaalaalaleuthrvalglyproglymetalametproile

151015

methisalaglyalaalathrglyleuvalalaalaileglysergly

202530

alaproglyvalalaalaleumetalaseralaalaalaglyglyleu

354045

valalavalleuthrileglyalaglyalaleuilealaglyalaval

505560

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

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