本发明属于医药技术领域，具体涉及一种培美曲塞二钠中间体以及制备方法。
背景技术：
培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。体外研究显示，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的活性，这些酶都是合成叶酸所必需的酶，参与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的生物再合成过程。培美曲塞二钠为多靶点抗叶酸剂，干扰细胞增殖过程中必须的叶酸依赖性代谢过程发挥抗增殖活性，对多种实体瘤具有活性。目前已在欧洲获准用于治疗恶性胸膜间皮瘤和非小细胞肺癌，2004年在美国获准用于治疗恶性胸膜间皮瘤。
专利及行政保护检索表明，培美曲塞在中国没有化合物专利，国外公司在我国申请了制备专利及组合物专利，但均尚未授权。作为治疗恶性胸膜间皮瘤的特效药物及治疗肺癌晚期的潜力药物，自上市以来得到了众多制药企业的追捧，目前已有多家国内制药企业获得生产批件，市场前景非常看好。
公开的培美曲塞合成路线主要包括三条：
1.用氯乙酸乙酯和2-溴-1，1-二乙氧基乙烷经缩合、与胍成环得嘧啶酮、盐酸作用下闭环得吡咯并嘧啶酮、酰化、二碘代、选择性脱碘、与n-(4-乙炔基苯甲酰基)-l-谷氨酸二甲酯缩合、催化氢化还原得到培美曲塞，该方法路线较长，中间体需要提纯，不利于实际生产。
2.用4-(2-甲酰基乙基)苯甲酸乙酯和多聚甲醛在n-乙基苯并噻唑溴鎓盐作用下反应与氰乙酸乙酯缩合，再与胍反应闭环氢氧化钠作用下得到4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸，与l-谷氨酸二乙酯缩合、水解后得到培美曲塞，该方法原料不易得，不利于实际生产。
3.以4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸为起始原料，与l-谷氨酸二乙酯盐酸盐经过缩合、成盐、水解后得培美曲塞二钠，本路线原料易得，反应步骤较短、操作简便、成本相对较低，适合工业化生产。但是此工艺路线存在较多不足，主要表现在n-{4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐(结构ⅴ)的制备所用起始物料培美酸，反应活性位点较多，导致副产物较多，较难控制，特别是杂质ⅵ(结构如式ⅵ)的含量高达5-10％。为达到质量要求，必须通过2-3次精制此中间体ⅴ，从而导致整体收率较低，成本较高，占整个培美曲塞二钠原料成本的比例较大。
技术实现要素：
为了克服现有技术中培美曲塞二钠制备收率较低、生产成本高、不稳定易降解纯度低的问题，本发明提供了一种培美曲塞二钠中间体ⅲ及其制备方法以及培美曲塞二钠ⅳ的制备方法。
本发明第一方面，提供了一种培美曲塞二钠中间体ⅲ，其结构如下：
其中，r选自苄基、三苯甲基、对甲苯磺酰基中的一种。
本发明另一方面提供了培美曲塞二钠中间体ⅲ的制备方法，包括以下步骤：
将4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸加入dmf、三乙胺搅拌溶解，与r-cl反应,处理后得中间体ⅱ；
以中间体ⅰl-谷氨酸二乙酯和中间体ⅱ为原料，在n,n-羰基二咪唑作用下发生缩合反应，然后与对甲苯磺酸反应，得到中间体ⅲ；
具体地，中间体ⅲ制备方法包括以下步骤：
将4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸加入dmf、三乙胺，升温到30℃搅拌溶解，滴加r-cl,保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至5-6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得中间体ⅱ；
将中间体ⅱ加入dmf搅拌溶解，加入n,n-羰基二咪唑，50-60℃反应2小时，加入中间体ⅰ升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入二氯甲烷溶解后，倒入纯水和三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，洗涤，干燥蒸干，加入无水乙醇搅拌溶解，加入对甲苯磺酸反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得中间体ⅲ。
优选的，4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸与r-cl的摩尔比为1：1-2，更优选1:1.5。
优选的，培美曲塞二钠的制备方法，中间体ⅱ和中间体ⅰ的摩尔比为1：1-1.8。
优选的，培美曲塞二钠的制备方法，中间体ⅱ和对甲苯磺酸的摩尔比为1：1-1.8。
优选的，中间体ⅱ和n,n-羰基二咪唑的摩尔比为1：1.2-1.8。
本发明所述培美曲塞二钠中间体ⅰ，化学名称为：l-谷氨酸二乙酯，结构如下：
中间体ⅰ的制备方法，包括以下步骤：
以l-谷氨酸二乙酯盐酸盐为起始物料，碳酸钾为脱酸剂，以二氯甲烷为溶剂进行脱酸反应，得淡黄色油状物中间体ⅰl-谷氨酸二乙酯。
一种中间体ⅲ在制备培美曲塞二钠中的用途。
本发明第三方面还提供了一种中间体ⅲ用于制备培美曲塞二钠的方法，包括以下步骤：
中间体ⅲ在氢氧化钠溶液中脱去对甲苯磺酸、酯水解、酰胺水解，然后成钠盐得到培美曲塞二钠ⅳ；
合成路线如下：
具体的，培美曲塞二钠的制备方法，包括以下步骤：
将中间体ⅲ与氢氧化钠溶液混合，全溶后滴加10％盐酸溶液调节ph至2-3，搅拌析晶，抽滤，滤饼加入无水乙醇升温至50-60℃搅拌溶解，用20％氢氧化钠溶液调节ph至6-7搅拌析晶，热滤，滤液倒回瓶中，加入50％氢氧化钠溶液析晶，抽滤，真空干燥，得培美曲塞二钠。
本发明的优越性表现在：
(1)以中间体ⅰ和中间体ⅱ为原料制备中间体ⅲ，由于中间体ⅱ的-nh2受到保护，避免了中间体ⅱ自身反应生成杂质ⅵ化合物，大幅提高了中间体ⅲ的质量和收率，生产成本大幅下降。
(2)以中间体ⅲ为原料制备培美曲塞二钠在乙醇氢氧化钠溶液中就可以完成脱酸、水解、成盐反应，操作简单，条件温和，不需要进行专门的脱保反应，但由于氨基受到了保护，防止了氨基的氧化降解，最终产品的质量和纯度大大提高，纯度大于99.85％。
具体实施方式
实施例1：
l-谷氨酸二乙酯的制备：
准确秤取l-谷氨酸二乙酯盐酸盐(48g0.2mol)加入500ml四口瓶中，加入120ml纯水搅拌溶解后，加入18g碳酸钾反应0.5小时，加入100ml二氯甲烷搅拌分液，水层再用纯水80ml×3萃取三次，收集有机相，干燥后蒸干得产品l-谷氨酸二乙酯(摩尔收率98.1％,纯度93.9％)。
实施例2
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺60.6g升温到30℃搅拌溶解，滴加苄基氯(0.2mol),升温至50℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入200ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至5，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率95.8％，纯度99.0％)。
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱
[m-h]+＝387.15。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,d2o)δ＝12.12(s,1h)；8.15(d,2h,j＝8.20hz)；7.58(d,2h,j＝8.20hz)；7.31(d,2h,j＝8.21hz)；7.29(d,1h,j＝8.21hz)；7.27(d,1h,j＝8.23hz)；7.27(d,1h,j＝8.23hz)；7.03(d,2h,j＝8.26hz)；6.06(s,1h)；4.64(m,2h)2.76～2.92(m,2h)；2.70～2.87(m,2h)；1.96(s,1h)。
13c-nmr：13cnmr(400mhz,d2o)δ：169.34，160.08，148.74，148.53，146.68，137.91,130.43，130.43，128.91,128.54,128.54,128.18，128.18，127.91，126.94,126.94,126.70,117.14，104.97，44.95,37.12，29.43。
实施例3
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺60.6g升温到30℃搅拌溶解，滴加苄基氯(0.4mol),升温至60℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入200ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率96.3％，纯度99.2％)。
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例2。
实施例4
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺60.6g升温到30℃搅拌溶解，滴加苄基氯(0.3mol),升温至60℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入200ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率96.9％，纯度99.4％)。
4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例2。
实施例5
4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备：
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺40.4g升温到30℃搅拌溶解，滴加三苯甲基氯(0.3mol),在35℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入200ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至5-6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率96.3％，纯度99.2％)。
4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱[m-h]+＝539.22。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,d2o)δ＝12.12(s,1h)；8.15(d,2h,j＝8.20hz)；7.58(d,2h,j＝8.20hz)；7.33(d,6h,j＝8.22hz)；7.30(d,2h,j＝8.31hz)；7.29(d,1h,j＝8.31hz)；7.28(d,6h,j＝8.30hz)；7.03(d,2h,j＝8.26hz)；6.06(s,1h)；2.76～2.97(m,2h)；2.70～2.92(m,2h)；2.54(s,1h)。
13c-nmr：13cnmr(400mhz,d2o)δ：169.34，160.08，148.74，148.53，146.68，145.06,145.06,130.43，130.43，129.23,129.23,129.23,129.23,129.23,129.23,128.91,128.18，128.18，127.91,127.08,127.08,127.08,127.08,127.08,127.08,126.28,126.28,126.28,126.28,117.14，104.97，78.45,37.12，29.43。
实施例6
4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备：
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺40.4g升温到30℃搅拌溶解，滴加对甲苯磺酰氯(0.3mol),降温至0-5℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入300ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至5-6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率96.7％，纯度98.7％)。4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱
[m-h]+＝451.12。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,d2o)δ＝12.12(s,1h)；8.15(d,2h,j＝8.20hz)；7.82(d,2h,j＝8.30hz)；7.58(d,2h,j＝8.20hz)；7.31(d,2h,j＝8.31hz)；7.03(d,2h,j＝8.26hz)；6.06(s,1h)；2.76～2.97(m,2h)；2.70～2.92(m,2h)；2.44(s,3h)；2.16(s,1h)。
13c-nmr：13cnmr(400mhz,d2o)δ：169.34，160.08，148.74，148.53，146.68，140.96,137.61,130.43，130.43，129.34,129.34,128.91,128.35,128.35,128.18，128.18，127.91,117.14，104.97，37.12，29.43，21.35。
实施例7
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.228moln,n-羰基二咪唑，50-60℃保温反应2小时，加入中间体l-谷氨酸二乙酯(0.19mol)，升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加36.1g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得产品(摩尔收率88.5％，纯度98.9％，杂质ⅵ含量为0)。
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的质谱[m-h]-＝572.26。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,(cd3)2so)δ＝7.80(d,2h,j＝8.26hz)；7.55～7.66(m,2h)；7.35(d,2h,j＝8.30hz)；7.30(d,2h,j＝8.28hz)；7.29(d,1h,j＝8.28hz)；7.28(d,2h,j＝8.30hz)；7.19(d,1h,j＝8.30hz)；7.16(d,2h,j＝7.87hz)；6.52(d,1h,j＝2.06hz)；4.51(s,1h)；4.43(m,2h)；4.09～4.10(m,2h)；4.01(m,2h)；2.93(m,2h)；2.95(m,2h)；2.44(t,2h,j＝7.49hz,)；2.51(s,1h)；1.29(s,3h)；1.20(s,3h)。
13c-nmr(400mhz,(cd3)2so):δ:172.32,170.32,167.08,157.74,151.06,144.98,139.11,138.89,131.70,128.80,128.80,128.68,128.68,127.95,127.95,126.90,126.90,126.76,125.98,125.98,119.53,115.80,99.48,61.02,60.41,44.98,36.18,27.65,23.21,21.26,14.54。
实施例8
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.342moln,n-羰基二咪唑，50-60℃保温反应2小时，加入中间体l-谷氨酸二乙酯(0.342mol)，升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加65g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得产品(摩尔收率89.3％，纯度99.3％，杂质ⅵ含量为0)。
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例8。
实施例9
n-{4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.342moln,n-羰基二咪唑，50-60℃保温反应2小时，加入中间体l-谷氨酸二乙酯(0.342mol)，升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加65g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得产品(摩尔收率88.7％，纯度99.1％，杂质ⅵ含量为0)。
n-{4-[2-(2-对甲苯磺酰氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的质谱[m-h]-＝636.22。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,(cd3)2so)δ＝7.80(d,2h,j＝8.26hz)；7.55～7.66(m,2h)；7.35(d,2h,j＝8.30hz)；7.30(d,2h,j＝8.28hz)；7.29(d,1h,j＝8.28hz)；7.28(d,2h,j＝8.30hz)；7.16(d,2h,j＝7.87hz)；6.52(d,1h,j＝2.06hz)；4.51(s,1h)；4.09～4.10(m,2h)；4.01(m,2h)；2.93(m,2h)；2.95(m,2h)；2.44(t,2h,j＝7.49hz,)；2.51(s,1h)；2.43(s,3h)；1.29(s,3h)；1.20(s,3h)。
13c-nmr(400mhz,(cd3)2so):δ:172.32,170.32,167.08,157.74,151.06,144.98,139.11,138.89,131.70,128.80,128.80,128.68,128.68,127.95,127.95,126.90,126.90,126.76,125.98,125.98,119.53,115.80,99.48,61.02,60.41,44.98,36.18,27.65,24.21,14.56,14.54。
实施例10
n-{4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.342moln,n-羰基二咪唑，50-60℃保温反应2小时，加入中间体l-谷氨酸二乙酯(0.342mol)，升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加65g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得产品(摩尔收率88.5％，纯度99.0％，杂质ⅵ含量为0)。
n-{4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的质谱[m-h]-＝724.32。
1h-nmr：1hnmr(400mhz,(cd3)2so)δ＝7.80(d,2h,j＝8.26hz)；7.55～7.66(m,2h)；7.35(d,6h,j＝8.30hz)；7.30(d,2h,j＝8.28hz)；7.29(d,1h,j＝8.28hz)；7.28(d,6h,j＝8.30hz)；7.20(d,2h,j＝8.30hz)；7.19(d,1h,j＝8.30hz)；7.16(d,2h,j＝7.87hz)；6.52(d,1h,j＝2.06hz)；4.43(m,1h)；4.09～4.10(m,2h)；2.93(m,2h)；2.95(m,2h)；2.44(t,2h,j＝7.49hz,)；2.29(s,3h)；1.20(m,3h)；1.17(m,3h)。
13c-nmr(400mhz,(cd3)2so):δ:172.32,170.32,167.08,157.74,151.06,146.20,145.04,145.04,144.98,139.11,138.89,131.70,129.23,129.23,129.23,129.23,129.23,129.23,128.68,128.68,127.95,127.95,127.05,127.05,127.05,127.05,127.05,127.05,125.98,125.98,126.23,126.23,126.23,126.23,119.53,115.80,99.48,60.41,52.45,36.18,26.17,21.26,14.54。
实施例11
培美曲塞二钠的制备：
秤取36g氢氧化钠加入600ml纯水中搅拌溶解后降温至30℃以下，加入n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐(112.7g0.16mol)搅拌溶解，全溶后滴加10％盐酸溶液调节ph至2-3，搅拌析晶，抽滤，滤饼加入1l四口瓶中，加入500ml无水乙醇升温至50-60℃搅拌溶解，用20％氢氧化钠溶液调节ph至6-7搅拌析晶，热滤，滤液倒回瓶中，加入50％氢氧化钠溶液24g,搅拌升温至50℃，搅拌反应1小时，降温到0℃，搅拌析晶5小时，抽滤，真空干燥，得白色固体培美曲塞二钠(摩尔收率83.5％，纯度99.9％)。
培美曲塞二钠的质谱：[m-2na-2.5h2o+h]-426.4。
培美曲塞二钠的1h-nmr：1hnmr(400mhz,d2o)δ＝7.58(d,1h,j＝8.20hz)；7.58(d,1h,j＝8.20hz)；7.02(d,1h,j＝8.26hz)；7.02(d,1h,j＝8.26hz)；6.16(s,1h)；4.32(dd,1h,j＝4.78hz)；2.59(m,2h)；2.59(m,2h)；2.34(m,2h)；2.18(m,1h)；2.06(m,1h)。
培美曲塞二钠的13c-nmr：13cnmr(400mhz,d2o)δ：182.33，179.10，169.84，160.88，151.74，150.53，146.58，130.43，128.18，128.18，126.91，126.91，118.14，114.97，98.72，56.00，35.12，34.32，28.43，26.71。
对比实施例1
4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的制备：
秤取4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(60g0.2mol)加入到500ml四口瓶中，加入200mldmf、三乙胺40.4g升温到30℃搅拌溶解，滴加三苯甲基氯(0.5mol),在35℃保温反应1小时，减压蒸干dmf，加入200ml纯水搅拌，用稀盐酸调节ph至5-6，搅拌析晶，降温到0-5℃抽滤，烘干得产品4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(摩尔收率92.8％，纯度95.6％)。
4-[2-(2-三苯甲氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例5。
对比实施例2
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.228moln,n-羰基二咪唑，50℃保温反应2小时，加入中间体l-谷氨酸二乙酯(0.475mol)，升温至70-80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加90g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得产品(摩尔收率83.1％,纯度92.8％)。
n-{4-[2-(2-苄氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例7。
对比实施例3
n-{4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐的制备：
将4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸(64.6g0.19mol)加入1l四口瓶中，加入650mldmf搅拌溶解，升温至50℃，加入0.38moln,n-羰基二咪唑，60℃保温反应2小时，加入l-谷氨酸二乙酯(0.38mol)，升温至80℃反应3小时，减压蒸干，加入800ml二氯甲烷溶解后，倒入1600ml纯水和160ml三乙胺的混合溶液中搅拌分液，分出有机相，纯水1600ml×2洗涤两次，干燥蒸干，加入500ml无水乙醇搅拌溶解，回流状态下滴加72g一水对甲苯磺酸和200ml的无水乙醇溶液，加毕，回流反应1小时，降温析晶，抽滤，烘干得粗品87.2g(摩尔收率70.1％，纯度92.3％，杂质ⅴ含量为6.52％)。
将上述粗品87.2g，加入到三口反应瓶中，加入用n,n-二甲基甲酰胺350ml，加热至40-45℃搅拌溶解，全溶后滴加无水乙醇700ml，慢慢析出固体，降至室温，搅拌析晶1-2h，过滤得固体69.8g，收率80.0％。重复上述精制操作1次，得固体55.4g(纯度98.2％，杂质ⅴ含量为0.07％)。
对比实施例3
四口瓶内加入55.4gn-{4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基}-l-谷氨酸二乙酯甲苯磺酸盐和200ml2mol/l氢氧化钠溶液，搅拌1小时，用0.5mol/l的盐酸溶液调节ph＝3，所得悬浮液加热至65℃，控温反应2.5小时。降至室温，过滤，固体用去离子水洗，得n-(4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰)-l-谷氨酸。四口瓶中加入上步所得n-(4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰)-l-谷氨酸及200ml0.5mol/l氢氧化钠，搅拌1小时，过滤除不溶物，得透明溶液，用0.5mol/l盐酸调节ph为8，所得溶液加热至50℃，搅拌30分钟，降至室温，加入300ml乙醇与二甲基亚砜的混合溶剂(体积比为10：1.8)，搅拌10分钟，于0℃下搅拌2小时，过滤，固体用60ml乙醇与二甲基亚砜的混合溶剂(体积比为10：1.8)洗涤，50℃真空干燥5小时得培美曲塞二钠，收率61.3％，纯度96.9％。
培美曲塞二钠的质谱、1h-nmr、13c-nmr见实施例11。