本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白的抗体及应用。
背景技术：
肝癌是一种世界级恶性癌症，具有恶性程度高、病情进展迅速、临床治疗难度大、疗效不理想的问题，而每年新发病患者人数又在急速增长，成为国际医学界最头疼的问题之一，在我国亦是仅排肺癌之后的第二大杀手，发病率逐年上升无法遏制，本项申请中的研究正是基于甲胎蛋白的指标对原发性肝细胞癌的早期诊断的意义。
甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)是一种血清糖基化蛋白，含有两条复合糖链，最早在胎儿血清中发现，在胎儿发育的过程中开放表达，出生两年后逐渐关闭表达，同时也是肝细胞合成的高特异性蛋白，70％-80％的肝病患者在发病期间甲胎蛋白基因发生高表达。在成人肝细胞恶化的早期，肝细胞内的甲胎蛋白基因会重新被激活出现高表达，至此甲胎蛋白作为一种被业界认可的特异性癌标志物，广泛应用于肝细胞肝癌和卵黄囊肿瘤的临床普查，还对肝癌起到监测疗效判断及预测复发等作用，敏感度一般达到60％以上，特异性能稳定在75％-95％，如果能配合高尔基体蛋白73、甲胎蛋白异质体3％三者联合检测对原发性肝癌（原发性肝癌主要分为肝细胞癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型）的诊断具有重要价值。
大约80%的肝病患者血清中甲胎蛋白都会升高，一般认为，甲胎蛋白参考范围为0~200µg/l，当≥200µg/l时需要发出做深度检测的预警。afp在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善。
除此之外，妊娠妇女也会出现甲胎蛋白的一时性升高，妊娠期会明显升高，在产后3周后逐渐恢复正常水平，另外肝损伤、充血性肝肿大、毛细血管扩张症、先天性酪氨酸病、睾丸或卵巢胚胎性肿瘤（如精原细胞瘤、恶性畸胎瘤、卵巢癌等）也常伴随增高，可作为辅助判断依据。
甲胎蛋白的检测一般通过以下方法：
1、琼脂免疫扩散法测定。
2、放射免疫测定法（ria）测定。
3、化学发光法测定。
4、酶联免疫吸附测定（elisa）。
技术实现要素：
本发明提供了一种能检测甲胎蛋白的基因工程抗体,该抗体具有亲和力高、特异性好的特性，效价高。
本发明采用的技术方案为：
一种甲胎蛋白检测用抗体igm，包括一个重链和一个轻链；所述重链的可变区氨基酸序列如seqidno：1所示；所述轻链的可变区氨基酸序列如seqidno：2所示。
所述重链的可变区核苷酸序列如seqidno：3所示。
所述轻链的可变区核苷酸序列如seqidno：4所示。
所述重链可变区的cdr1，cdr2，cdr3的序列如seqidno：5，seqidno：6，seqidno：7所示。
所述轻链可变区的cdr1，cdr2，cdr3的序列如seqidno：8，seqidno：9，seqidno：10所示。
所述抗体igm在制备检测甲胎蛋白的诊断试剂或治疗药物中的用途。
有益效果：本发明制备了与现有抗体不同的鼠抗甲胎蛋白igm的抗体，并且效价优于现有的鼠抗。本发明抗体特异性识别了人肝癌细胞，抗体具有很好的hafp特异性，无交叉反应。亲和力高、特异性好。本发明抗体的检测范围宽、灵敏度高，检测hafp浓度在2~400ng/ml范围内,检测下限为2ng/ml。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。应理解，这些具体描述的实施方案不应构成对本发明范围的限制。
本发明的甲胎蛋白检测用抗体igm单链抗体具有如上文所述的重链可变区部分、轻链可变区部分(vh--vl)。
在一个方案的具体实施中，甲胎蛋白检测用抗体单链抗体由本发明所述的重链可变区部分、轻链可变区部分和连接肽组成，所述连接肽由甘氨酸（gly）和丝氨酸（ser）构成的一段亲水性的柔性多肽（g4s）3，其中所述重链可变区部分连接于所述连接肽的n-端或c-端，而轻链可变区部分相应地连接于所述连接肽的另一端。优选地，所述重链可变区部分连接于所述连接肽的n-端。在本发明单链抗体的一个实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示。
实施例1.抗原免疫过程
1、抗原准备过程：取afp稀释至1mg/ml，首次免疫取50μl抗原溶液、50μl0.01mpbs与150μl弗氏完全佐剂；后续免疫取25μl抗原溶液、75μl0.01mpbs与100μl弗氏不完全佐剂。用两只2ml注射器分别吸取抗原溶液与佐剂，尽可能排掉注射器中的空气并用三通链接，将抗原推入佐剂中，在反复推动连接好的注射器约20min--40min，直至乳化后的抗原在水中不扩散为止。
2、免疫小鼠过程：选择健康6至8周龄的，体表无明显外伤的，活泼积极进食的老鼠。采用腹腔注射方法，每14天免疫一次，当免疫两次以后，之后每次免疫的第7天断尾取血检测效价，当效价达到要求后停止免疫。
实施例2.细胞融合过程
步骤如下：
2.1准备工作
2.1.1配制hat培养基，分装dmem及peg。
2.1.2手术器械、50ml塑料离心管、50ml玻璃离心管灭菌。
2.1.3提前一周复苏sp2/0细胞，培养并使之处于良好的生长状态。
2.1.4提前一天用hat培养基采饲养细胞并铺板，融合一只老鼠需要铺5块饲养细胞板。
2.2融合
2.2.1处理sp2/0：吹散，转移至50ml塑料离心管，1000r离心5min，弃上清，加dmem，吹散，1000r离心5min，加dmem至10ml左右，吹散，计数，备用。
2.2.2提取脾细胞
2.2.2.1小鼠眼窝取血，脱颈处死，血样留作阳性对照。
2.2.2.2分离出小鼠脾脏，先用dmem冲洗脾脏外部，再dmem冲洗脾脏内部，收集冲洗液并转移至10ml玻璃离心管，计数。
2.2.2.31000r离心5min，弃上清，加dmem吹散并转移至50ml玻璃离心管，将之前处理的sp2/0同时转移至50ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，研磨均匀。
2.2.2.437℃温水浴，1min内加入1mlpeg，边加边摇，静置90s。
2.2.2.51min内加1mldmem，30s内加1mldmem，逐渐加速，加dmem至40~50ml，37℃静置10min，800r离心6min，弃上清，加hat铺板。
2.2.2.63天之后半换液，一周之后全换液，换hat培养基培养。
实施例3.亚克隆挑选过程
3.1观察细胞状态，当96孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行整板检测，挑选阳性较高的孔进行亚克隆，一个阳性孔一块板。
3.2当6孔内有肉眼可观察到的细胞团后，进行亚克隆挑拣，每块板选择12个单个细胞团的孔进行亚克隆挑拣，选择阳性高，细胞状态好的细胞进行下一步亚克隆，至少进行三次亚克隆，最后挑选出阳性高、细胞状态好单克隆细胞团定株。
3.3将挑出来的细胞团转移至24孔培养，待24孔细胞长好后转移至小方瓶培养。
3.4待小方瓶内细胞长好之后，进行冻存及制备腹水。
实施例4.腹水制备过程
4.1提前一周给老鼠注射石蜡，每只老鼠0.5ml。
4.2待小方瓶内细胞长好之后，吹散，转移至10ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，加1mldmem，计数，按每只老鼠注射0.8×106个细胞，每只老鼠注射0.5ml的量进行稀释，然后给老鼠腹腔注射细胞。
4.3观察老鼠状态，待小鼠腹部明显涨大即可开始抽取腹水并收集。
实施例5.抗体纯化过程
用proteina-sepharosecl-4b亲和层析法纯化单克隆抗体，aktaexplorer100进行监测。取腹水，在4℃，12000r条件下离心15min，以除去较大的凝块。将1.5gproteina-sepharosecl-4b干粉用6～7ml三蒸水溶解，再用0.02mph7.4的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡15min，然后装入层析柱中。用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min，ph试纸测试流出液体的ph为7.4。取预处理过的腹水5ml，用上样缓冲液稀释至50ml，用0.45μm的滤膜过滤上样，流速为1ml/min。用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。随后用0.02mph4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用aktaexplorer100进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，每收集3ml后，立即用1mph9.0的tris-hcl缓冲液调整ph值至7.0。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5～10倍柱床体积，流速调至1ml/min，再用三蒸水平衡10倍柱床体积。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/l和50g/l，每槽加样10μl，考马斯亮蓝r250染色。具体操作见参考文献(美)e.哈洛(edharlow)(美)d.莱恩(davidlane)《抗体技术实验指南》出版社：科学出版社出版日期：2002-09；萨姆布鲁克j，弗里奇ef，曼尼阿蒂斯t，等著.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.《分子克隆实验指南》[m].第2版.北京科学出版社，1992，1713-1720.。应用elisa法测定效价。
实施例6.抗体测序过程
将细胞样品反转录后获得cdna，扩增并获得重链和轻链可变区，克隆至pmd18-t载体，测序，使用imgt/v-quest进行测序结果比对，进一步分析，之后得到全部序列，所述重链的可变区氨基酸序列如seqidno：1所示，轻链的可变区氨基酸序列如seqidno：2所示；重链的可变区核苷酸序列如seqidno：3所示；所述轻链的可变区核苷酸序列如seqidno：4所示；重链可变区的cdr1，cdr2，cdr3的序列如seqidno：5，seqidno：6，seqidno：7所示；轻链可变区的cdr1，cdr2，cdr3的序列如seqidno：8，seqidno：9，seqidno：10所示。
实施例7抗体的功能活性鉴定
用间接elisa法测定筛选所得抗体的腹水效价及与has的交叉反应，结果显示：抗体的腹水效价高达1:3×107。
对hepg2人肝癌细胞进行免疫荧光染色（fitc和dapi双染，400倍显微镜下观察），鉴定抗体与天然hafp分子特异性结合能力，结果显示，在实验中，hepg2细胞均呈现明显绿色荧光，而无关抗体对照组细胞未观察到绿色荧光，说明本发明抗体特异性识别了人肝癌细胞，抗体具有很好的hafp特异性，无交叉反应。
综上可见，本发明的抗体具有亲和力高、特异性好的特性。
采用本发明抗体与目前商业化检测试剂盒相比，检测曲线非常接近，但是本发明抗体的检测范围和灵敏度要更有优势，本发明检测hafp浓度在2~400ng/ml范围内,检测下限为2ng/ml。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。
其中：重链可变区的氨基酸序列seqidno.1：
evqlqqsgselvrpgasvrlsckasgytftsywmhwvkqrhgqglewlgqiypgsgstiydekfkdkgtltvdtssstafmhlssltsedpavyycsrsghyfdywgqgttltvssesqsfpnvfplvscesplsdknlvamgclardflpstisftwnyqnnteviqgirtfptlrtggkylatsevllspksvlepsdeylvckvhyggknrdlhvpipavaemnpnvnvfvpprdgfsgraprkstlicealnftpkpitvswlkdgklvesgfttdgvtierkgltpqtykhistltiseidwlnlnvytcrvdhraltflknvsstcaasrptdiltftippsfadiflsksanltclvsnlttyetlniswasqsgepleakikimeshsngtfsakpvasvcveqwnnrkesvctvshrdlmspqkkfiskpnevskhppavyllpparralnlresatvtalvkgfspadisvqwlergqllpqepyvtsapmpepgapgfyfthsilevteerwnsgetypcvvghealphlvtertvtkstgkptl；
轻链可变区的氨基酸序列seqidno.2：
divmtqttsslsaslgdrvtiscrssqdisnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlqsgvpsrftgsgsgtdysltisnleqediatrfcqqgntlpftfgsgtkleikradqaptarifpprsetltsggaqvvcflnnfypkdinvkrkidgsegqngilnswtqqdskdstdsmsstleltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnecalta；
重链的可变区核苷酸序列seqidno：3：
gaggtccagctgcagcagtcagggtctgagctggtcaggcctggagcttcagtgaggctgtcctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcacggacaaggccttgagtggcttggacaaatttatcctggtagtggtagtactatctacgatgagaagttcaaggacaagggcacactgactgtagacacatcctccagcacagccttcatgcacctcagcagcctgacatctgaggacccggcggtctattactgttcaagatcggggcactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagagagtcagtccttcccaaatgtcttccccctcgtctcctgcgagagccccctgtctgataagaatctggtggccatgggctgcctggcccgggacttcctgcccagcaccatttccttcacctggaactaccagaacaacactgaagtcatccagggtatcagaaccttcccaacactgaggacagggggcaagtacctagccacctcggaggtgttgctgtctcccaagagcgtccttgaaccttcagatgaatacctggtatgcaaagtacactacggaggcaaaaacagagatctgcatgtgcccattccagctgtcgcagagatgaaccccaatgtaaatgtgttcgtcccaccacgggatggcttctctggccgggcaccacgcaagtctacgctcatctgcgaggccctaaacttcactccaaaaccgatcacagtatcctggctaaaggatgggaagctcgtggaatctggcttcaccacagatggggtgaccatcgagcggaaaggactgacaccccaaacctacaagcacataagcacacttaccatctctgaaatcgactggctgaacctgaatgtgtacacctgccgtgtggatcacagggcactcaccttcttgaagaacgtgtcctccacatgtgctgccagtcgcccaacagacatcctaaccttcaccatccccccctcctttgccgacatcttcctcagcaagtccgctaacctgacctgtctggtctcaaacctgacgacctatgaaaccctgaatatctcctgggcttctcagagtggtgaaccactggaagccaaaattaaaatcatggaaagccatagcaatggcaccttcagtgctaagccggtggctagtgtttgtgtggaacagtggaataacaggaaggaaagtgtgtgtactgtgagccacagggatctgatgtcaccacagaagaaattcatctcaaaacccaatgaggtgagcaaacatccacctgctgtgtacctgctgccaccagctcgtcgcgccctgaacctgagggagtcagccacagtcaccgctctggtgaagggcttctctcctgcagacatcagtgtgcagtggcttgagagagggcaactcttgccccaagagccgtatgtgaccagtgccccgatgccagagcctggggccccaggcttctactttacccacagcatcctggaagtgacagaggagcgatggaactccggagagacctatccgtgtgttgtaggccacgaggccctgccacacctggtgaccgagaggaccgtgacgaagtccactggtaaacccacactg；
轻链的可变区核苷酸序列seqidno：4：
gacattgtgatgacacaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcaggagcagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcacggttacagtcaggagtcccatcaaggttcactggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccactcgcttttgccaacagggtaatacgcttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatcaggcaccaactgcacgcatcttcccaccacggagtgagactttaacatctggaggtgcccaagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagcgcaagattgatggcagtgaagggcaaaatggcatcctgaacagttggactcagcaggacagcaaagacagcaccgacagcatgagcagcaccctcgaattgaccaaggacgagtatgaaagacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgtgcgctaaccgca；
重链cdr1的序列seqidno：5：sywmh；
cdr2的序列seqidno：6：mnpnvn；
cdr3的序列seqidno：7：arralnlre；
轻链可变区的cdr1的序列seqidno：8：lsaslg；
轻链可变区的cdr2的序列seqidno：9：tkleikra；
轻链可变区的cdr3的序列seqidno：10：gsegqngi。
序列表
<110>南京京达生物技术有限公司
<120>一种甲胎蛋白检测用抗体igm及应用
<141>2018-03-20
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
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<213>人工序列(artificialsequence)
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15