本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种特异性识别并诱导β-淀粉样蛋白(aβ42)的寡聚体及原纤维解聚的单链抗体、编码这种单链抗体的基因及其在制备抗神经毒性aβ42药物或在制备抗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是一种神经退行性疾病，其主要的和始发的病理特征是渐进性的aβ42的聚集与沉积。对于ad的发病机理有多种观点，其中普遍认同的是aβ42毒性学说。现已证明，由aβ42单体聚集形成的aβ42寡聚体及原纤维具有神经毒性，是引起ad的主要致病因子。然而，目前国际上报道的抗毒性aβ42的抗体大多是针对aβ42的一级序列的，这些抗体与aβ42的单体、寡聚体、原纤维或纤维均能结合，无法特异地(或专一地)结合aβ42寡聚体或原纤维并抑制它们的毒性，因而在ad的治疗中易引起较大的副作用。另外，已报道的特异性靶向aβ42寡聚体或原纤维的抗体虽然可特异性识别并结合特定的aβ42聚集体，但不能同时有效地诱导aβ42寡聚体及原纤维的解聚，无法长效抑制或有效根除aβ42寡聚体及原纤维的毒性。
有关ad的被动免疫治疗报道中，很多是采用人源化的单克隆抗体，但这些抗体因分子大不易穿过血脑屏障或特异性差易引起副作用而限制了在临床上的应用。为克服这些限制，从构建小分子的人源性单链抗体出发，筛选特异性识别和结合神经毒性aβ42寡聚体及原纤维的单链抗体成为目前诊断或治疗ad的热点。
单链抗体(singlechainfv,scfv)是一种小分子的基因工程抗体，它是在dna水平上利用基因工程方法将天然抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过一段链接肽(linker)连接而成的小分子重组抗体。与完整抗体分子相比，它具有以下特点：含有完整的抗体可变区，具有较完整的抗原结合位点；不含有抗体分子的fc段，因而免疫原性弱，用于人体不易产生免疫反应；分子量小，穿透力强，易穿过血脑屏障，适用于ad的诊断或治疗；体内循环半衰期短，易从血循环中排除；不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，所以利于进行基因工程操作和可以利于原核表达系统大量生产。因此，单链抗体是目前报道最多、也最有发展前景的抗ad的基因工程抗体。
虽然目前国际上已有抗aβ42寡聚体的单链抗体的报道(sebollelaa等,2017,jneurochem.doi:10.1111/jnc.14118；yoshiharat等，2008，jbiochem,143，475-486；zameera等，jmolbiol,384，917-928；robertr等，2009,proteinengdessel.22，199-208)，但这些单链抗体对aβ42寡聚体及原纤维的特异性不高或亲和性也有限，而且未显示出明显的可诱导aβ42寡聚体及原纤维解聚的功效。迄今为止，国内尚未见有特异性结合aβ42寡聚体及原纤维，并可有效诱导aβ42寡聚体及原纤维解聚的单链抗体的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种特异性识别并结合aβ42寡聚体及原纤维，并可有效诱导aβ42寡聚体及原纤维解聚的单链抗体以及编码这种单链抗体的基因。
本发明不但解决了现有抗aβ42抗体无特异性地与包括aβ42单体在内的所有aβ42形式均可结合的技术问题，而且解决了现有抗aβ42寡聚体的单链抗体对aβ42原纤维特异性差，同时无诱导aβ42寡聚体及原纤维解聚功效的技术问题。本发明利用基因工程抗体技术成功筛选出特异性与aβ42寡聚体及原纤维结合，而不与aβ42单体及纤维结合，并同时可诱导aβ42寡聚体及原纤维解聚的单链抗体。本发明所述的单链抗体与aβ42寡聚体及原纤维特异性结合的特性与aβ42的一级结构无关，而是基于aβ42寡聚体及原纤维所特有的构象，是构象依赖型的单链抗体。
本发明所述的aβ42寡聚体及原纤维是由2个到几十个不等的aβ42单体聚集形成的，分子间主要以氢键、疏水键和范德华力相结合，分子量从9kda至100kda不等。
本发明提供了一种包括重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)的人源性抗aβ42寡聚体及原纤维的单链抗体ht7，其氨基酸序列如seqidno.3所示，其中vh具有seqidno.1所示的氨基酸序列，vl具有seqidno.2所示的氨基酸序列，ht7的分子量约为29kda。
本发明还提供了一种编码前面所述的人源性抗aβ42寡聚体及原纤维的单链抗体ht7的基因，其核苷酸序列如seqidno.4所示。
进一步，本发明所述的单链抗体ht7能够有效抑制aβ42单体的聚集，还能够使aβ42寡聚体及原纤维解聚，并能明显降低aβ42寡聚体及原纤维对神经细胞的毒性，在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。
再进一步，本发明所述的编码一种人源性抗aβ42寡聚体及原纤维的单链抗体ht7的基因可与pet-28a、pet-41b、pma5或ppzw103重组，构建成单链抗体ht7的基因工程表达载体，该ht7基因及该ht7基因工程表达载体在制备抗阿尔茨海默氏病的药物中具有广泛应用。
本发明所述的单链抗体ht7(scfvht7)能够特异性识别并结合aβ42寡聚体及原纤维，作为检测aβ42寡聚体及原纤维的临床诊断制剂和ad治疗的免疫制剂具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：pet28a-ht7重组表达载体的测序谱图；
图2：纯化的单链抗体ht7的sds-page谱图，其中m：蛋白质marker；1：对照组；2:表达的ht7；3：纯化后的ht7；
图3：单链抗体ht7与不同形态aβ42识别的dot-blot分析谱图；
图4：单链抗体ht7与不同分子量aβ42聚集体识别的westernblot分析谱图；
图5：elisa法测定ht7与aβ42寡聚体亲和力的曲线图；
图6：tht-f法分析单链抗体ht7抑制aβ42聚集及诱导aβ42聚集体解聚的谱图；其中，m：单体，o：寡聚体，p：原纤维，f：纤维；**p＜0.01，*p＜0.05。
图7：mtt法测定单链抗体ht7浓度依赖性抑制aβ42细胞毒性的曲线图。
具体实施方式
实施例1aβ42寡聚体、原纤维和aβ42纤维的制备
aβ42单体(购自美国sigma公司)用冰预冷的六氟异丙醇(hfip)溶解至浓度为1mg/ml，冰水浴超声10min，真空干燥，-20℃冻存。使用时，先将上述得到的aβ42单体用二甲基亚砜(dmso)溶解至浓度为1mg/ml，再将aβ42稀释到浓度为10μm的磷酸盐缓冲液(ph7.4，50mm)中，aβ42的终浓度为10μm，在37℃分别孵育3～12h形成aβ42寡聚体，孵育12～24小时形成aβ42原纤维，孵育36～37小时形成aβ42成熟纤维的聚集状态。所有aβ42聚集状态均通过电镜确认。由于aβ42形成聚集体的不可逆性，aβ42的各种聚集体均为现用现制备。
实施例2阳性克隆的筛选
(1)外周血淋巴细胞rna提取及反转录合成cdna
外周血淋巴细胞分离提取：用乙二胺四乙酸二钾(edta-2k)抗凝管采集阿尔茨海默病人外周血血样10ml，用无钙、镁离子的平衡盐缓冲液(d’hanks)(购自碧云天生物技术研究所)以1：1体积稀释，以稀释血样与淋巴细胞分离液＝2：1(体积比)的比例加入聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(购自美国sigma公司)。室温下，以2000rpm/min离心20min。离心后，吸取单个核细胞层。用d’hanks洗涤细胞，1000rpm/min离心10min，获得外周血淋巴细胞。
外周血淋巴细胞rna提取：在1×107个外周血淋巴细胞中加入1ml苯酚-异硫氰酸胍总rna抽提试剂(
反转录合成cdna：在反转录酶的作用下用上述提取的rna合成cdna的方法如下，取上述制备的rna溶液4μl(1000μg/μl)加入到0.1ml离心管中，加入寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸引物(oligodtprimer)1μl和脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dntp)1μl，最后以无rna酶去离子水补充至10μl，65℃保温5min后，于冰浴中迅速冷却。在上述离心管中加入反转录缓冲液(primerscriptⅱbuffer)4μl、rna酶抑制剂(rnaseinhibitor)0.5μl、反转录酶(primerscriptⅱrtase)1μl，最后以无rna酶的去离子水补充到20μl，缓慢混匀。以42℃45min，95℃5min的条件进行反转录反应后，冰上冷却。
(2)编码vh与vl的dna片段扩增
依据vh和vl的保守序列，设计并合成了扩增编码vh和vl的dna片段的引物，其序列如下：
vhs15′ggaattccatatgcaggtgcagctggtg3′
5′cctgagccacctccgccagaaccgcctccacctgaagagacggtvha1
gaccgttgtcc3′
5′tggcggaggtggctcaggcggtggaggatcggatatccagatgavls1
ctcagtctcc3′
vla15′ataagaatgcggccgcacgtttgatctccactttggtcc3′
vhs1中5’的下划线部分catatg序列是内切酶ndeⅰ识别位点，vla1中3’端的下划线部分gcggccgc序列是内切酶notⅰ识别位点。
扩增过程如下：
上述步骤(1)中制备的cdna用无rna酶的去离子水稀释50倍后，取1μl分别加入如下扩增编码vh、vl的dna片段的pcr体系中，编码vh的dna片段扩增体系：vhs1(25μmol/l)0.4μl，vha1(25μmol/l)0.4μl；编码vl的dna片段扩增体系：vls1(25μmol/l)0.4μl，vla1(25μmol/l)0.4μl；两体系再各加入dna聚合酶(r-taq)0.1μl，dntps0.8μl，10×buffer1μl，无rna酶的去离子水6.3μl，分别进行目的片段的扩增：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min作用30个循环，72℃10min。最后分别用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收编码vh、vl的dna片段。
(3)编码scfv的dna片段的拼接和扩增
拼接体系如下：编码vh的dna片段2μl[来自步骤(2)]、编码vl的dna片段1μl[来自步骤(2)]，dntps0.8μl，10×buffer1μl，r-taqdna聚合酶0.1μl，无rna酶的去离子水5.1μl，在如下条件下实现编码scfv的dna片段的拼接：94℃5min，94℃50s，55℃50s，72℃1min，作用30个循环，72℃10min，4℃保存。
编码scfv的dna片段的扩增：将拼接后的编码scfv的dna片段稀释50倍，取5μl加入如下扩增体系中：vhs12.5μl，vla12.5μl，r-taqdna聚合酶0.5μl，dntps4μl，10×buffer5μl，无rna酶的去离子水30.5μl，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，作用30个循环，72℃10min。取1μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收(购自上海生工生物工程有限公司)。
(4)阳性克隆的筛选
引物中所设计的ndeⅰ和notⅰ酶切位点与本发明所用的原核表达载体pet28a(通用的大肠杆菌表达载体，含有t7强启动子、c-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，novagen、invitrogen等公司有售)的ndeⅰ和notⅰ相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。利用ndeⅰ和notⅰ切割位点将此人源scfv基因片段克隆进表达载体pet28a中ndeⅰ和notⅰ酶切位点之间，连接便得到重组表达载体。
上述表达载体的构建步骤具体如下：
双酶切反应：将1.0μgpet28a载体和上述获得的scfv基因片段分别与适量去离子水混匀，使其总体积分别为18μl，各加入2-3单位的限制性内切酶ndeⅰ和2-3单位的notⅰ及2μl相应的10×h缓冲液，混匀，置37℃水浴保温2-3小时后，分别采用凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的dna(购自上海生工生物工程有限公司)。
编码scfv的dna片段与pet28a载体的连接：取0.5μg上述步骤回收的pet28a载体dna，加入2-10倍摩尔量的上述步骤得到的编码scfv基因片段、2μl10×t4dna连接酶缓冲液，加入去离子水定容置20μl，最后加入1单位的t4dna连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置16℃水浴过夜，得到连接好的重组表达载体pet28a-scfv。
重组表达载体pet28a-scfv转化e.colibl21(de3)感受态细胞【e.colibl21(de3)感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”(第二版，科学出版社)49页】中，冰浴30分钟后置入42℃水浴保温1分钟，立即取出并置冰浴中冷却2分钟。加入200μl37℃预热的lb液体培养基，37℃150rpm振摇培养60分钟后，取出100μl培养液涂布于含卡那霉素(kan)的lb琼脂培养平板上，37℃培养12h后，出现转化菌落。
挑取单克隆到96孔细菌培养板上(购自美国corning公司)，每孔加入lb液体培养基200μl，培养基中含有100μg/ml卡那霉素(kan)。37℃200rpm振摇培养过夜。每孔吸取2μl菌液，加入到另外一块新的96孔细菌培养板中，每孔添加lb培养基200μl，培养基含有100μg/mlkan，37℃200rpm振摇培养至od600＝0.8～1.0。再向第一块板加入一定体积的甘油，甘油终浓度为15％，-80℃保存。向第二块96孔板中每孔加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)(购自美国sigma公司)至终浓度为0.05mm，20℃，160rpm振荡诱导12h后，用96孔板离心机以4000rpm离心10分钟，弃去培养基收集菌体。再向96孔板中加入菌体裂解液冰浴裂解1小时，4000rpm离心10分钟，收集裂解后的总蛋白。
用10μg/ml的aβ42寡聚体(来自实施例1)以100μl/孔包被96孔酶标板(购自美国corning公司)，4℃，16-18h。弃抗原液，每孔加入100μl1％(体积比)的牛血清白蛋白(bsa)，于37℃封闭1h。磷酸盐缓冲液(pbs)[含有0.1％(体积比)tween-20]洗板三次，每孔加入100μl上述收集到的总蛋白，37℃孵育2h。阳性对照孔加商品化aβ抗体b4(购自美国santacruz公司)，阴性对照孔加bsa。pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗板六次。加入100μl1:2000(体积比)稀释的anti-his单抗(购自美国santacruz公司)，37℃孵育1h。pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗板六次。加入100μl1:4000(体积比)稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔igg抗体(购自中国博士德公司)，37℃孵育1h。pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗板六次。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)(购自美国amresco公司)50μl/孔，室温避光反应15min，每孔加30μl2mol/lh2so4终止反应，酶标仪测od值(波长为450nm)。结果判定：以od值超过阴性对照3倍为阳性，空白对照的od值应小于0.2。经结果鉴定，筛选出一株与抗原结合力强的单克隆菌株ht7进行后续实验。
实施例3单链抗体ht7基因的dna序列测定
提取质粒pet28a-ht7，交由上海生工测序部进行序列测定，结果如图1(pet28a-ht7载体测序谱图，其中编码ht7的基因为核苷酸120～869号)所示。将所测得的ht7基因序列与genebank中的免疫球蛋白基因序列进行比对分析，结果证明：所获得的ht7克隆为一编码scfv的dna序列，起始密码子为atg，终止密码子为tga，其核苷酸序列如seqidno.4所示，它包含了编码抗体重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)的dna序列，推导得到的相应氨基酸序列(seqidno.1、seqidno.2)具有典型的抗体可变区结构。
实施例4单链抗体ht7的表达和制备
将含有pet28a-ht7质粒的e.colibl21(de3)37℃振摇培养过夜。以1:100的比例接种，37℃振荡培养od600＝0.8～1.0后加入iptg诱导ht7的表达，20℃，160rpm振荡诱导12h后，4℃5000rpm离心5min收集菌体。以pbs(ph7.4)重悬菌体，经超声破碎后离心收集上清。对收集的上清使用ni2+-nta柱纯化本发明的人源性单链抗体ht7：将上清液缓慢流过ni2+-nta柱，然后用8倍柱体积缓冲液(20mm磷酸缓冲液，500mm氯化钠，20mm咪唑)洗柱，最后用洗脱缓冲液(20mm磷酸缓冲液，500mm氯化钠，250mm咪唑)洗脱本发明的人源性单链抗体ht7。图2示出了所制备的人源性单链抗体ht7的sds-page鉴定结果，纯化得到的人源性单链抗体ht7分子量约为29.0kda。
实施例5dot-blot检测单链抗体ht7与aβ42单体与聚集体的结合特异性
将aβ42单体、寡聚体、原纤维及纤维置于硝酸纤维素膜上，以5％(体积比)脱脂奶粉封闭膜，置室温1h。加入单链抗体ht7孵育1h后，用pbs洗膜3次，每次10min。再加入his-tag抗体[1：1000(体积比)]，37℃孵育1h，用pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗涤膜3次，每次10min。将膜加入到hrp标记的rabbitigg[1:5000(体积比)]中，37℃孵育1h。pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗涤膜3次，每次10min。pbs洗膜1次，10min。将膜经底物发光显色试剂盒(ecl)(购自碧云天生物技术研究所)显影，结果如图3所示，只在aβ42寡聚体及原纤维处显示出明显的斑点，而在aβ42单体和纤维形态中几乎不显示斑点。
实施例6westernblot检测单链抗体ht7对aβ42聚集体的识别
aβ42混合物(单体、寡聚体、原纤维、纤维体积比为1：1：1：1)经非变性凝胶电泳分离后，转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，5％(体积比)脱脂牛奶封闭1h。用pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗膜3次，每次10min。将膜置于杂交袋中，加入单链抗体ht7，对照组加入抗aβ42抗体(b4)(购自santacruz公司)[1:1000(体积比)]，室温杂交2h后，pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗膜3次，每次10min。将膜置于杂交袋中，实验组加入抗组氨酸标签抗体(antihis-tag)(购自santacruz公司)[1:1000(体积比)]抗体，室温杂交1h后，pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗膜3次，每次10min。各组分别加入相应的hrp标记的igg[1:5000(体积比)]，室温杂交1h。pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗膜3次，每次10min。加入ecl显色，结果如图4所示：ht7能够特异性识别分子量为18kda～55kda的区域，即aβ42寡聚体及原纤维区域，而对aβ42单体、aβ42成熟纤维形式没有明显的结合。
实施例7单链抗体ht7亲和力的测定
用间接elisa方法测定单链抗体ht7的亲和力，并以抗原抗体复合物的平衡解离常数(kd)表示。用1μg/ml浓度的aβ42寡聚体或原纤维包被酶标板4℃过夜，用1％的bsa于37℃封闭1h，在另外一个酶标板中将单链抗体ht7与10-10～10-4mol/l浓度的aβ42寡聚体或原纤维混合，加入等体积的封闭液室温孵育1h，再将混合液加入抗原包被孔内，37℃孵育2h，pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗涤后，每孔加入100μl1:2000(体积比)稀释的antihis-tag抗体，37℃孵育1h，pbs[含有0.1％(体积比)tween-20]洗涤后加入tmb显色，测定450nm光密度值(od450)，aβ42寡聚体的结果如图5所示，aβ42原纤维的结果与aβ42寡聚体相似(略)。kd为达到最大od450值的50％时aβ42寡聚体或原纤维浓度，由实验数据得知，kd寡聚体与kd原纤维均为3.1×10-6m。
实施例8单链抗体ht7对aβ42聚集的抑制作用
分别将aβ42的单体、寡聚体、原纤维及纤维与单链抗体ht7以等摩尔比例混合，37℃孵育，分别在0h，3h，12h，24h和48h用硫磺素t荧光染色(tht-f)法测定aβ42的聚集程度，结果如图6所示。图6表明：1，单链抗体ht7能显著地aβ42单体和寡聚体的聚集；2，ht7单链抗体可以显著地诱导aβ42寡聚体及原纤维的解聚；3：ht7单链抗体对aβ42纤维的聚集有一定的抑制作用，同时还有一定的诱导aβ42纤维解聚的作用。由以上结果可以得出：单链抗体ht7不仅可以抑制aβ42的聚集，还可以有效诱导已经形成的aβ42寡聚体及原纤维的解聚。
实施例9单链抗体抑制aβ42寡聚体及原纤维对细胞的毒性作用
将sh-sy5y细胞以每孔5000个细胞接种到多孔细胞培养板中，每孔体积100μl，细胞于37℃培养24h后，进行以下17组实验：
以上17组分别在37℃孵育20h后，每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)(购自美国sigma公司)溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，mtt法检测细胞的存活率，结果如图7所示，单链抗体ht7抑制aβ42单体、寡聚体、原纤维及纤维对细胞的毒性作用呈浓度依赖性，而且aβ42寡聚体及原纤维使细胞存活率显著降低，而经单链抗体ht7作用后相应的细胞存活率明显升高。相比之下，单链抗体ht7对aβ42单体及纤维的毒性抑制作用有限。这些结果也说明了，单链抗体ht7与aβ42寡聚体及原纤维的亲和能力较强，而且能够有效地结合aβ42寡聚体及原纤维，并抑制其对细胞的毒性作用。
实施例10体外血脑屏障模型建立及单链抗体穿透血脑屏障的检测
应用人脐静脉血管内皮细胞huvec及胶质瘤细胞c6进行共培养的方法，建立体外血脑屏障模型。
共培养方法如下：人脐静脉血管内皮细胞huvec培养条件：在ham'sf12k培养基中加入终浓度为2mml-谷氨酰胺，1.5g/l碳酸氢钠，0.03mg/ml内皮细胞生长因子支持物(ecgs)，及10％胎牛血清。
胶质瘤细胞c6培养条件：在dmem-f12培养基中加入终浓度为10％胎牛血清。
先将c6细胞以45,000个/孔接种于pet膜的底面，贴壁后将transwell小室正置，受池加入适量培养基，2～3天后在pet正面以30,000个/孔接种huvec细胞，37℃、5％co2及饱和湿度条件下共培养5～7天。
鉴定：
a.光学显微镜下观察
b.试漏实验：使transwell小室内外液面差达0.5cm以上，培养4h后观察液面差的变化。
c.检测跨内皮电阻值(transendothelialelectricalresistance,teer)：使用millicell-ersvoltohmmeter测量huvec与c6细胞共培养双侧电阻值。每天更换新鲜培养基同时测量teer值，直至显微镜下确认细胞已完全融合且teer值达到稳定。
单链抗体穿透血脑屏障的检测：当huvec/c6细胞共培养5～7天，检测teer值达到630ohm/cm2并稳定后，进行单链抗体跨血脑屏障转运检测实验。在小室内加入5μg单链抗体ht7。当5min，15min，30min，60min，90min，及120min时，在小室外侧吸取60μl样品，加入到酶标板中，4℃包被过夜。elisa方法检测单链抗体ht7穿透血脑屏障。结果：单链抗体ht7穿透血脑屏障的效率在60分钟以内随时间增长而增加，并且在60min时其穿透率接近峰值，之后几乎呈现稳定的态势。结果证明，单链抗体ht7能够有效穿透血脑屏障。
<110>吉林大学
<120>一种特异性识别并诱导aβ42的寡聚体及原纤维解聚的单链抗体、单链抗体基因及其应用
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