一种高产γ-氨基丁酸的方法与流程

文档序号：15306640发布日期：2018-08-31 21:06阅读：484来源：国知局

本发明涉及一种高产γ-氨基丁酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸(4-aminobutanoicacid，gaba)，广泛存在于自然界，是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、改善更年期综合症等多种功效，被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。

gaba的合成方法有化学合成法和生物合成法，化学法合成gaba需要用到强酸或强碱等腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，原料毒性大，生产成本高，实际工业生产中,主要用生物法合成gaba。生物合成法包括植物富集法和微生物法。植物富集法主要用于含gaba的功能性食品开发，虽条件比较温和，纯化难度大，尚无法满足药用和医用。微生物法包括传统的微生物发酵法和微生物转化法，早期生产gaba主要采用直接发酵法，以大肠杆菌、乳酸菌、植物乳杆菌等为生产菌，利用菌体内的谷氨酸脱羧酶的作用，将发酵液中的l-谷氨酸转化为gaba，从发酵液中分离纯化制得gaba。传统的直接发酵法得到的发酵液是一个复杂的体系，含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，gaba的下游分离纯化复杂化。微生物转化法的原理是利用谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,gad,ec4.1.1.15)能专一地催化l-谷氨酸裂解为gaba和co2的作用，以发酵培养的全细胞或酶液作为催化剂转化生产gaba，所需设备简单，条件容易控制，转化体系杂质含量少，收率高，环境友好。谷氨酸脱羧酶的辅酶为5’-磷酸吡哆醛(plp)，细胞内的plp含量无法满足重组谷氨酸脱羧酶催化反应的需要，所以经常在转化体系中添加一定量辅酶促进生产。目前研究主要是将大肠杆菌或短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌中表达，利用全细胞转化法产gaba，转化12～24h，产量分别能达到280～385g/l。提高gaba的生产能力，缩短转化周期，减少细胞和辅酶的添加量可以降低gaba的生产成本，筛选具有高活力的l-谷氨酸脱羧酶的微生物并通过分子生物学技术高效表达l-谷氨酸脱羧酶并优化酶制备工艺得到越来越多的关注。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种通过蛋白质工程改造得到高酶活力谷氨酸脱羧酶的方法，并应用基因工程菌株全细胞转化生产γ-氨基丁酸的方法，该方法湿菌体用量少、生产强度大、转化效率高，适用于工业化生产gaba。

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列含有如seqidno:4所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述谷氨酸脱羧酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达本发明的谷氨酸脱羧酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌构建的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pet系列的质粒为载体构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pet24a为载体，将seqidno:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌e.colibl21(de3)中重组表达seqidno:4所示谷氨酸脱羧酶。

本发明的第五个目的是提供应用本发明的基因工程菌生产谷氨酸脱羧酶的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌按照5％接种量接种于发酵培养基，空气量0.8～1.5vvm，温度37℃，搅拌600rpm培养至od600在3.0～4.0，将温度下降至25℃，加入5g/l乳糖诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当od600达到11.0～13.0时，溶氧突然上升，每升发酵液开始以4～5ml/h的速率补加补料培养基，发酵培养18h后结束发酵。

本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：甘油5g/l，酵母粉20g/l，胰蛋白胨15g/l，k2hpo4·12h2o3.0g/l，kh2po418.0g/l。

本发明的一种实施方式中，所述补料培养基的成分为：甘油500g/l，mgso4·7h2o30g/l。

本发明的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是以谷氨酸为底物，应用所述基因工程菌转化底物生产γ-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，转化初始底物谷氨酸浓度为100～150g/l，转化过程中转化液ph上升，通过补加50g/次谷氨酸控制ph在5.0～6.5，转化温度37℃，转化6～8h。

在本发明的一种实施方式中，用所述基因工程菌的湿细胞进行转化，湿细胞添加量为7～10g/l，所述转化体系共计补加700～800g/l谷氨酸。

本发明还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明是使用来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸，经过蛋白质工程改造后，该酶在大肠杆菌内表达酶活力提高了1.2倍。

(2)该酶经过改造后，具有较宽的ph稳定范围，在ph5.0～6.5稳定性佳，转化体系以水为介质，不需要添加任何缓冲剂，湿细胞添加量7.0g/l，转化7～8h，转化率达到99％，产量可以达到425.0g/l，每克湿菌体生产γ-氨基丁酸达到59.5g，生产强度高，下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。

附图说明

图1：重组菌株发酵罐发酵生产谷氨酸脱羧酶的过程曲线；其中■，原酶重组菌e.colibl21-gad；●，蛋白质工程改造后e.colibl21-gad*；

图2：不同ph对谷氨酸脱羧酶酶活力的影响；

图3：转化产物的hplc分析图谱；(a)：gaba标准品；(b)：反应结束时的转化液。

具体实施方式

都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得

样品预处理：取转化液12000rpm离心5min收集上清液，并以gaba作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定gaba。

γ-氨基丁酸含量的测定：高效液相色谱法，以邻苯二甲醛(opa)为衍生化试剂，色谱柱:zorbaxsb-c18，流动相a为10mmol/lkh2po4(4mol/lkoh调节ph5.3)，流动相b为乙腈：甲醇：a相＝5:3:1(冰醋酸调ph5.3)梯度洗脱，流速1ml/min，荧光检测器，检测波长330，460nm，柱温30℃。

谷氨酸脱羧酶酶活检测：取40μl超声破碎的粗酶液加入360μl底物(底物体系：采用50mmol/lph4.8na2hpo4-柠檬酸缓冲液溶解0.1mmol/lplp和50mmol/l谷氨酸)，于37℃恒温水浴反应8min，然后用1mnaoh溶液终止反应。样品稀释25倍，采用hplc-opa柱前衍生法测量gaba生成量。酶活单位定义为1min内能转化生成1μmolgaba的酶量。

时空产率的计算：时空产率(g/l/h)＝gaba产量(g/l)/转化时间(h)

实施例1：巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶基因的获取

(1)巨大芽孢杆菌菌种接种于lb培养基，37℃培养12h收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna。

(2)使用引物gad1(5'gggtttcatatgatgcctcaatggcatccgcatcg3'，序列如seqidno:5所示)和gad2(5’ccgctcgagttaatgatgaaatccattgtcgtat3'，序列如seqidno:6所示)从基因组dna中克隆得到谷氨酸脱羧酶的gad基因；

(3)将该基因连接至pmd19simple克隆载体测序，得到基因序列如seqidno:1，对应氨基酸序列如seqidno:3；

(4)用限制性内切酶ndei和xhoi将目的基因和表达载体pet24a37℃酶切2h；

(5)用t4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pet24a16℃连接10h；

(6)将构建好的表达质粒导入e.colibl21(de3)，在含有卡纳霉素的lb平板中培养12h,菌落进行pcr及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，即为表达谷氨酸脱羧酶基因的工程菌e.colibl21-gad。

实施例2：巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶蛋白质工程改造

(1)使用modeller软件对谷氨酸脱羧酶gad进行同源建模(jmb342,119-130(2004))，对gad催化活性中心的loop结构的关键氨基酸f67、v68、m88、i89定点饱和突变为丙氨酸；突变后按照实施例1中的方法构建重组菌株，摇瓶发酵后收集菌体，进行酶活检测，结果如表1，将第67位苯丙氨酸f和第68位缬氨酸v突变为丙氨酸a，gad酶活分别提高了26.8％和49.0％，说明第67位和第68位为影响酶活的关键位点，因此选择两位点进行组合突变。

表1不同突变体酶活测定

(2)对f67和v68进行组合突变，发现当67位苯丙氨酸f和68位缬氨酸v都突变为组氨酸h，得到谷氨酸脱羧酶gad*，其氨基酸序列如seqidno:4，得到gad*基因序列如seqidno:2，得到重组菌株e.colibl21-gad*。摇瓶发酵时，e.colibl21-gad*湿细胞酶活为2277.0u/g，比原谷氨酸脱羧酶提高了1.2倍。

实施例3：重组菌株发酵生产谷氨酸脱羧酶

(1)种子培养基配方：lb培养基，酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l。

发酵培养基配方：甘油5g/l，酵母粉20g/l，胰蛋白胨15g/l，k2hpo4·12h2o3.0g/l，kh2po418.0g/l。

补料培养基的成分为：甘油500g/l，mgso4·7h2o30g/l。

(2)重组菌株e.colibl21-gad和e.colibl21-gad*按照5％接种量接种于发酵培养基，空气量0.8～1.5vvm，温度37℃，搅拌600rpm培养至od600在3.0～4.0，将温度下降至25℃，加入5g/l乳糖诱导谷氨酸脱羧酶的表达，当od600达到11.0～13.0时，溶氧突然上升，每升发酵液开始以4～5ml/h的速率补加补料培养基，发酵培养18h后结束发酵。

(3)发酵过程去分别取样离心菌体，检测谷氨酸脱羧酶酶活，两重组菌株发酵产酶曲线见图1，18h发酵结束时，e.colibl21-gad和e.colibl21-gad*的gad活力分别为1293.0u/g和2845.0u/g湿菌泥，改造后gad酶活提高了1.2倍。

实施例4：ph对谷氨酸脱羧酶的影响

取用实施例3中获得的e.colibl21-gad*湿菌体，在ph3.0～8.0磷酸盐缓冲液之间进行酶活检测(如图2所示)，结果显示，ph5.5是gad*的最适ph，在ph5.0～6.5的范围内，改造后的gad*可以维持85％以上的酶活，说明gad*具有较宽的ph稳定范围，适用于工业化生产。

实施例5：补料方式对全细胞催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸的影响

取用实施例3中获得的e.colibl21-gad*湿菌体，作为细胞催化剂用于转化谷氨酸生产gaba。在1l转化体系中，初始谷氨酸投料分别为50g、100g和150g，加入14g菌体，0.05mmol/l磷酸吡哆醛(plp)，定容至1l，在3.5l发酵罐中进行转化，温度37℃，搅拌转速600rpm，通气量2l/min，转化过程中通过补加50g/次谷氨酸控制ph在5.0～6.5，三组实验中后续补料次数分别为16次、15次和14次，合计添加谷氨酸850g，转化结束使用高效液相色谱法测定上清液中gaba的浓度(图3)，结果如表2，初始添加100g/l和150g/l谷氨酸，转化7h，gaba分别积累416.0g/l和423.0g/l，gaba的时空产率分别为59.4g/l/h和60.4g/l/h，谷氨酸摩尔转化率均达到99.0％以上。

表2补料方式对全细胞催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸的影响

实施例6：湿细胞添加量对全细胞催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸的影响

取用实施例3中获得的e.colibl21-gad*湿菌体，作为细胞催化剂用于转化谷氨酸生产gaba。在1l转化体系中，初始谷氨酸投料150g，0.05mmol/lplp，分别添加6g、10g、14g和18g湿细胞，定容至1l，在3.5l发酵罐中进行转化，温度37℃，搅拌转速600rpm，通气量2l/min，转化过程中通过14次补加50g/次谷氨酸控制ph在5.0～6.5，实验结果如表3，投入850g谷氨酸后，转化体系的体积增大，当湿菌体添加量在10～18g时(实际浓度为7.1～12.8g/l)，gana的产量在420g/l以上，谷氨酸的摩尔转化率在98％以上。

表3湿细胞添加量对全细胞催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸的影响

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

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