本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及对多形拟杆菌bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482来源的α-l-鼠李糖苷酶btrha基因的表达、纯化、定性及酶法制备淫羊藿苷的方法。
背景技术：
α-l-鼠李糖苷酶(α-l-rhamnosidase，ec3.2.1.40)广泛存在于动物、植物和微生物中，能够特异性地水解多种糖苷键，如α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键，在许多天然的植物提取组分中就含有这些糖苷键，如芦丁、橘皮苷、柚皮苷、朝霍定c、淫羊藿苷等糖苷类物质末端都有α-l-鼠李糖基，通过水解这些末端的鼠李糖基，提高其生物利用度，可用于食品、医药等领域。主要的功能和作用包括：
(1)脱苦作用：黄烷酮糖苷类物质是柑桔中的主要苦味物质，α-l-鼠李糖苷酶可以作用于黄烷酮糖苷类物质，脱去一个鼠李糖分子之后，转化为单糖苷，其苦味为原来的三分之一。
(2)增香作用：葡萄糖中存在大量键合态芳香物质，键合态芳香物质本身并没有呈香功能，但可以在糖苷酶的作用下裂解糖苷键释放糖苷配基，产生游离态芳香物质。许多品种葡萄键合态芳香物质含量多于游离态芳香物质，因为键合态芳香物质构成了葡萄中重要的、潜在的芳香成分，6-o-α-l-鼠李吡喃-β-d-葡萄吡喃糖苷是葡萄中主要的键合态芳香物质。利用α-l-鼠李糖苷酶可以有效释放这些香气物质。
(3)生物转化：α-l-鼠李糖苷酶还可用于黄酮类物质的生物转化。不同的糖链决定了黄酮类物质的不同生理功能，α-l-鼠李糖苷酶可以专一性的水解黄酮类物质糖链中的鼠李糖苷，如α-l-鼠李糖苷酶可以转化芦丁生产药用价值更高的异斛皮素。
现有文献报道的和专利授权的α-l-鼠李糖苷酶主要是切除α-1,6糖苷键，如专利α-l-鼠李糖苷酶rha1及其表达基因和应用(授权专利号zl201410504753.6)报道的α-l-鼠李糖苷酶主要降解芦丁；一种α-l-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用(专利号：cn106191084a)报道的α-l-鼠李糖苷酶主要降解柚皮苷。但天然产物中α-l-鼠李糖残基的糖苷键类型除了α-1,6糖苷键，还有一些α-1,2糖苷键，由于酶分子对降解的糖苷键类型具有极强的特异性，因此目前报道的α-l-鼠李糖苷酶还无法降解鼠李糖之间的α-1,2糖苷键。
淫羊藿苷、朝霍定c、朝霍定a、朝霍定b是淫羊藿总黄酮提取物中多组分黄酮类化合物，已被证实淫羊藿苷的在防治肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等方面的生物活性显著高于朝藿定c等其它多组分类黄酮类化合物。与淫羊藿苷结构相比，朝霍定c在3位多一个鼠李糖，且是通过α-1,2糖苷键连接的鼠李糖。如果能将朝霍定c的3位上通过α-1,2糖苷键连接的鼠李糖特异性切除，就可以将朝霍定c转化成淫羊藿苷。由此可见，筛选获得能特异性降解鼠李糖连接的α-1,2糖苷键，对生物催化朝霍定c及其它含有通过α-1,2糖苷键连接的鼠李糖的天然产物具有重要意义。
本实验室在进行α-l-鼠李糖苷酶大量筛选过程中，获得了多形拟杆菌bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482来源的一种α-l-鼠李糖苷酶btrha具有降解鼠李糖连接的α-1,2糖苷键的能力，在此基础上，对其进行了克隆、表达、酶学特性的研究，并建立了催化转化朝霍定c制备淫羊藿苷的工艺。
技术实现要素：
解决的技术问题：针对目前报道的α-l-鼠李糖苷酶还无法有效降解天然产物鼠李糖连接的α-1,2糖苷键，本发明提供了一种能特异性降解鼠李糖之间α-1,2糖苷键的α-l-鼠李糖苷酶btrha及其表达基因和应用。该酶能高效特异性降解朝霍定c的α-1,2糖苷键，生成淫羊藿苷。
技术方案：一种α-l-鼠李糖苷酶btrha，氨基酸序列如seqidno.2所示。
编码所述α-l-鼠李糖苷酶btrha的基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。
含有seqidno.1所示α-l-鼠李糖苷酶btrha基因的重组质粒pet-28a-btrha。
上述重组质粒的制备方法，根据多形拟杆菌bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482的基因组分析设计引物p1和p2，以购买dsmz公司(https://www.dsmz.de/)的多形拟杆菌bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482的基因组为模板，以p1和p2为引物进行pcr扩增，将所得的pcr扩增产物和pet28a分别用ncoi和xholi双酶切，并分别割胶回收，16℃连接4h；将连接产物转化大肠杆菌top10f’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有α-l-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pet28a-btrha。
所述引物为：
p1：5’-cccccatgggcatacttttgggtgccttgtc-3’；下划线表示ncoi位点；
p2：5’-cccctcgagcaaacgataggtaacaatcc-3’；下划线表示xholi位点；
包含上述重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。
上述α-l-鼠李糖苷酶btrha在降解鼠李糖之间α-1,2糖苷键中的应用。
上述α-l-鼠李糖苷酶btrha在生物催化转化朝霍定c制备淫羊藿苷中的应用。
上述生物催化转化的条件为：朝霍定c与α-l-鼠李糖苷酶btrha于温度40℃-60℃，ph5.0-7.5条件下反应1h-10h；朝霍定c的浓度为0.2-2g/l；α-l-鼠李糖苷酶btrha的用量为0.1u/ml-10u/ml。
有益效果：本发明首次克隆并重组表达能特异性降解α-1,2糖苷键的α-l-鼠李糖苷酶btrha，弥补了α-l-鼠李糖苷酶水解鼠李糖与鼠李糖之间的α-1,2糖苷键的空白；该酶能高效特异性降解朝霍定c转化为淫羊藿苷，在酶用量2.5u/ml，ph5.5，55℃的条件下水解1g/l的朝霍定c240min,摩尔转化率高达90.5％以上。
附图说明
图1为重组α-l-鼠李糖苷酶电泳图；图1中m：mark；a：空载质粒粗酶液b：pet-28a-btrha粗酶液；c：纯化后酶液。
图2为重组α-l-鼠李糖苷酶btrha水解朝霍定c的hplc图谱。其中，(1)图谱为使用灭活的α-l-鼠李糖苷酶水解朝霍定c的hplc图谱，(2)图谱为加α-l-鼠李糖苷酶水解朝霍定c的hplc图谱。第一个峰为朝霍定c(保留时间为28.676)，第二峰为淫羊藿苷(保留时间为30.6)。
图3为重组α-l-鼠李糖苷酶水解朝霍定c条件的优化结果图。其中，图a为ph对朝霍定c水解率的影响，图b为温度对朝霍定c水解率的影响，图c为时间对朝霍定c水解率的影响，图d为酶用量对朝霍定c水解率的影响。
图4为四种鼠李糖苷酶对底物朝霍定c的水解得率图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(escherichiacoli)top10f’；限制性内切酶、连接酶等(购自takara公司)；pet28avector(购自invitrogen公司)、p-npr购自sigma公司。
实施例1
1.α-l-鼠李糖苷酶btrha基因的克隆及表达载体的构建
以购买dsmz公司(https://www.dsmz.de/)的多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482)基因组为模板，根据ncbi上细菌鼠李糖苷酶的氨基酸序列来设计简并引物p1,p2,为上下游引物扩增btrha基因片段，使用extaq聚合酶(购自takara公司)以推荐比例配制50μl反应液进行片段扩增，pcr反应条件是95℃，5min；35次循环(95℃，30s；52℃，30s；72℃，2min20s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对pcr扩增产物进行纯化。得到多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482)α-l-鼠李糖苷酶btrha基因，将所得的pcr扩增产物和pet28a分别用ncoi和xholi双酶切，回收的片段与pet-28a载体连接，产物转化到大肠杆菌e.colitop10f’中，转化产物涂布于lb平板，37℃过夜培养，接种单菌落到lb(添加卡那霉素至终浓度50mg/l)液体培养基中培养8-10h后，提取质粒进行序列测定，如seqidno.1所示，得到重组质粒pet-28a-btrha。
2.α-l-鼠李糖苷酶btrha的表达及纯化
取重组质粒将重组质粒pet28a-btrha1μl加入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中混匀冰上放置10min，通过42℃的水浴锅孵育2min后放置在冰上5min，向其中加入1mlsoc培养基，在37℃培养1h后涂布于含有卡那霉素的lb平板(卡那霉素的终浓度为50mg/l)上来筛选出转化子，挑取几个单菌落到lb(添加卡那霉素至终浓度50mg/l)液体培养基中培养8-10小时后，取1ml菌液测序，确定含有pet28a-btrha重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)菌株。
将重组大肠杆菌bl21(de3)划线于lb平板上(卡那霉素的终浓度为50mg/l)进行活化，37℃培养12h，至长出单菌落后接种于50mllb液体培养基中，于37℃，180rpm摇床培养3-4h，至od600＝0.4-0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导，在28℃表达7-8个小时。同时将含有空质粒pet28a的大肠杆菌bl21(de3)作为阴性对照(control)。吸出1ml的菌液5000r/min离心3min收集菌体，弃上清，用1mlpbs缓冲液洗涤菌体两次后用500μl的pbs重新悬浮菌体后进行超声裂解，工作条件为：超声3s，间隔5s，共50次。12000r/min离心10min，吸出15μl上清备用，剩下的粗酶液经过0.22μm滤膜，再用ni亲和柱纯化得到纯化后的α-l-鼠李糖苷酶btrha，将取不含btrha基因的空转化子表达粗酶液，含btrha基因的转化子表达粗酶液以及纯化后的α-l-鼠李糖苷酶btrha各15μl，加入15μl5×sds上样缓冲液混匀，煮沸5min后，各取10μl进行sds-page电泳鉴定表达蛋白，如图1。
3.重组α-l-鼠李糖苷酶的酶学性质
3.1酶活测定方法
反应体系100μl，20μl5mmol/l对硝基苯α-l-鼠李糖苷酶(pnpr)中加入75μl100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.5)，在55℃孵育5min，再加入5μl酶液反应10min，显色后再加入1mol/l的碳酸钠溶液300μl终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(u)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmolp-硝基苯酚所用的酶量为1个酶活力单位。
3.2最适反应温度的测定
在35-65℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲液为100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.5)，发现重组α-l-鼠李糖苷酶的最适反应温度为55℃。
3.3最适反应ph
在不同的ph(4.0-8.0，100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)条件下，55℃分别测定酶活，发现重组α-l-鼠李糖苷酶的最适反应ph为6.5。
3.4温度稳定性
在不同的温度(45℃-55℃)条件下温育4h，分别在不同时间段测定酶活，鼠李糖苷酶btrha在45℃下的温度稳性较好，4h后仍有56％的酶活力。
3.5ph稳定性
在不同的ph(4.0-8.0，100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)，45℃温育4h，55℃分别测定酶活，鼠李糖苷酶btrha在ph5.0-8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中4h仍有70％以上的酶活力。
4.重组α-l-鼠李糖苷酶对朝霍定c的水解
4.1重组α-l-鼠李糖苷酶对朝霍定c的水解
取纯化后的α-l-鼠李糖苷酶0.5u，加入100μl100mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10μl20mg/ml的朝霍定c(epimedinc，甲醇溶解)，添加去离子水至200μl，在55℃条件下孵育30min，取出12000rpm离心2min，加入600μl甲醇(分析纯)混匀，经0.22μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用hplc分析，分析条件为：柱温，25℃；流速，1.0ml/min；进样量，5μl；检测波长，270nm；流动相，0-35min乙腈:甲酸水＝20:80-28：72(v:v)，25-36min乙腈:甲酸水＝28:72-20:80(v:v)。结果如图2。
4.2重组α-l-鼠李糖苷酶水解朝霍定c条件的优化
为了获得α-l-鼠李糖苷酶对朝霍定c水解的最适温度、最适ph、最适反应时间及最适用酶量，以灭活的α-l-鼠李糖苷酶处理的朝霍定c的含量为100％，结果如图3。图3(a)可以看出水解的最适ph为5.5，在ph5.0、ph6.0条件下重组α-l-鼠李糖苷酶对朝霍定c的水解得率影响较小；图3(b)可以看出水解的最适温度为55℃，在50℃、60℃条件下重组α-l-鼠李糖苷酶对朝霍定c的水解得率都明显减小；图3(c)可以看出水解150min、180min、210min、240min的水解效果相差不大，水解时间可以控制在180min-240min；图3(d)可以看出，α-l-鼠李糖苷酶适宜酶用量2.5u/ml。结果表明在ph5.5、55℃、酶用量2.5u/ml的条件下水解1.0g/l的朝霍定c240min，水解效率高达90.5％以上。
4.3不同来源α-l-鼠李糖苷酶水解朝霍定c能力比较
选择了本发明的α-l-鼠李糖苷酶btrha、bacteroidesthetaiotaomicronvpi-5482来源的另一种a-l-鼠李糖苷酶bt145、aspergillusterreusccf3059来源的a-l-鼠李糖苷酶atrha和thermotogapetrophila来源的a-l-鼠李糖苷酶tperha等四种a-l-鼠李糖苷酶，比较它们朝霍定c的水解得率。结果表明，a-l-鼠李糖苷酶bt145和tperha不能水解朝霍定c，a-l-鼠李糖苷酶btrha和atrha可以水解朝霍定c，但atrha水解朝霍定c不能得到单纯淫羊藿苷，会有淫羊次苷ⅰ生成，且得率远远没有a-l-鼠李糖苷酶btrha高(图4)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>南京林业大学
<120>一种α-l-鼠李糖苷酶及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2190
<212>dna
<213>α-l-鼠李糖苷酶btrha的基因(α-l-rhamnosidase)
<400>1
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<210>2
<211>729
<212>prt
<213>α-l-鼠李糖苷酶btrha(α-l-rhamnosidase)
<400>2
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725
<210>3
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<210>4
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
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