本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种水稻镉积累相关基因oshma3的基因内分子标记caps7及其应用。
背景技术：
稻田镉(cadmium，cd)污染导致的稻米镉超标，严重影响我国的食品安全和粮食安全。因此，为了避免镉污染对人体的伤害，急需降低水稻籽粒中积累的镉。对于水稻品种稻米镉积累的遗传特征研究发现，籼稻品种往往比粳稻品种在籽粒中积累更多的镉。而在我国南方稻米主产区，单一的籼稻种植结构，偏酸性的土壤背景和较高的镉污染程度，加重了籼稻品种稻米镉含量超标的风险。那么，在彻底根治稻田镉污染之前，种植稻米镉低积累的籼稻品种是目前避免镉污染风险最经济有效的方法。但是由于稻米镉积累性状不能被育种家在实际的品种选育过程中直接观察，因此低镉水稻品种的选育需要鉴别、利用优异的基因资源及相对应的分子辅助手段(markerassistedselection,mas)。能有效鉴别水稻镉积累性状的分子辅助手段仍处于待开发阶段。
技术实现要素：
针对以上技术问题，本发明提供了一种水稻镉积累相关基因oshma3的基因内分子标记caps7及其应用，可以有效的鉴别水稻品种镉积累性状并加快籼稻低镉积累品种的选育过程。
目前，对于水稻籽粒镉积累性状，科研人员已经鉴定出一系列控制水稻镉吸收、转运及分配的关键数量性状位点及相关基因，其中位于水稻第七号染色体短臂处的一个控制影响水稻镉转运率的主效qtl已经被分离克隆，命名为oshma3(uenoetal，2010)。该基因主要通过控制影响水稻根系液泡对根系吸收的镉进行隔离，减少了向地上部位转运的镉，从而影响水稻镉转运率。发明人利用连锁分析及关联分析对稻米镉积累进行研究，发现基因oshma3能影响水稻从土壤吸收的镉在稻米中的积累；同时发现该基因在自然群体内主要存在两种重要的等位基因型hma3-1和hma3-2，hma3-2核苷酸序列见seqidno:1所示，这两种等位基因型占自然群体内的85％以上，含有hma3-1的水稻品种的稻米镉含量显著低于含有hma3-2的水稻品种(p<0.01)；发明人进一步分析发现hma3-1和hma3-2存在明显的籼-粳分化的特征，即粳稻品种往往含有hma3-1，而籼稻品种则大部分含有hma3-2而少部分含有hma3-1。
本发明的遗传学背景的重点在于：1)大部分籼稻品种的稻米镉含量往往处于一个较高的水平(相同相似的土壤环境下，籼稻往往积累更多)，这一原因很可能是由于oshma3的等位基因型为高镉积累基因型hma3-2；2)通过分子辅助手段可以将镉低积累等位基因型hma3-1导入高积累品种(替换oshma3的高积累等位基因型hma3-2)，为改良籼稻品种的镉积累特征提供重要的遗传学手段及相关品种、品系。
本发明的技术方案为：提供了一种水稻镉积累相关基因oshma3的基因内分子标记caps7，基因oshma3包含等位基因hma3-1和等位基因hma3-2，所述分子标记caps7能区分等位基因hma3-1和等位基因hma3-2的序列差异。
进一步的，所述分子标记caps7的pcr扩增引物对为：
正向引物f(seqidno:4)：ctcgtcagcggcctcaagg；
反向引物r(seqidno:5)：gcacgacgaggaggcacg；
所述分子标记caps7表现为：利用所述引物对进行pcr扩增时，等位基因hma3-1的扩增产物具有seqidno:2所示核苷酸序列，等位基因hma3-2的扩增产物具有seqidno:3所示核苷酸序列；所述等位基因hma3-1表现为低镉积累，所述等位基因hma3-2的核苷酸序列为seqidno:1所示，表现为高镉积累。
本发明还提供一种利用上述分子标记caps7区分等位基因hma3-1和hma3-2的方法，利用前面所述引物对对待测水稻基因组dna进行pcr扩增；对pcr产物用asci内切酶酶切，琼脂糖电泳检测酶切后的扩增产物，若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，则待测水稻具有等位基因hma3-1；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，则待测水稻具有等位基因hma3-2，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，则待测水稻的基因oshma3为杂合状态。
进一步的，若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，序列长度为337bp，则待测水稻具有等位基因hma3-1，表现为低镉积累；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，序列长度分别为196bp、141bp，则待测水稻具有等位基因hma3-2，表现为高镉积累，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，序列长度分别为337bp、196bp和141bp，且序列长度为337bp的条带最亮，则待测水稻的基因oshma3为杂合状态。
进一步的，所述pcr体系为：模板dna10～50ng，正向引物和反向引物各0.25um，taqdna聚合酶1u，四种脱氧核糖核苷酸datp、dttp、dctp、dgtp各0.1mm，2×gcbufferi10ul，其余部分用去离子水补齐至20ul；
所述pcr反应程序为：首先在94℃预变性4min，之后进入pcr循环扩增，循环扩增包括94℃变性30sec，60℃或62℃退火30sec，72℃延伸1min，共三步，循环运行30～34次，最后在72℃延伸10min后，25℃保温4min得到扩增产物；
所述酶切体系为10ul体系，将以下各组分混合：pcr扩增产物100～200ng，asci内切酶buffer(10x)1ul，asci内切酶2u，其余用去离子水补齐；酶切程序：将混合好的酶切体系放置于37℃恒温箱中反应8～12h以上进行酶切。
本发明还提供了前面所述分子标记caps7及其pcr扩增引物对在鉴定水稻镉积累性状中的用途。
本发明还提供了前面所述分子标记caps7及其pcr扩增引物对在低镉积累籼稻品种选育中的用途。
本发明还提供了前面所述区分等位基因hma3-1和hma3-2的方法在低镉积累籼稻品种选育中的用途。
本发明还提供了一种鉴定水稻镉积累性状的方法，利用前面所述的引物对对待测水稻的基因组dna进行分子标记caps7的pcr扩增，并用asci内切酶酶切，琼脂糖电泳检测pcr产物的长度，确定水稻镉积累性状；
若琼脂糖电泳检测显示为一条条带，序列长度为337bp，则待测水稻具有等位基因hma3-1，表现为低镉积累；若琼脂糖电泳检测显示为两条条带，序列长度分别为196bp、141bp，则待测水稻具有等位基因hma3-2，表现为高镉积累，若琼脂糖电泳检测显示为三条条带，序列长度分别为337bp、196bp和141bp，且序列长度为337bp的条带最亮，则待测水稻的基因oshma3为杂合状态。
本发明还提供了一种低镉积累籼稻辅助育种方法，所述方法包括：通过前面所述的方法，检测分子标记caps7，以确定待测籼稻镉积累性状。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明通过对控制影响稻米镉积累的主效qtl基因oshma3的自然变异研究，开发出一个能有效区分低镉积累等位基因型hma3-1和高镉积累等位基因型hma3-2的基因内分子标记caps7。
2、本发明的基因内分子标记caps7可以有效的鉴别水稻为镉积累性状，并为选育低镉积累籼稻品种提供新的技术手段，加快了选育过程。
3、本发明实施例3获得的近等基因系材料nil(93-11)为低镉积累籼稻品种选育提供了良好的供体材料。
附图说明
图1为oshma3的自然变异及单倍型分析图，其中a为oshma3的自然变异分析及单倍型分析，其中深灰色的表明籼稻基因型，浅灰色的表明为粳稻基因型，右侧格子内的数字为该基因型在自然群体内出现的品种数目；b为hma3-1和hma3-2在105份水稻品种中稻米镉积累的比较，p<0.01水平表明差异极其显著；c为频率分布直方图表明hma3-1和hma3-2在300份籼稻品种的分布，黑色表明为hma3-2等位基因型，浅灰色为hma3-1等位基因型；d为hma3-1和hma3-2在300份材料中稻米镉含量的差异，p<0.01水平表明差异极其显著；
图2为hma3-2为oshma3基因的弱功能等位基因分析图，其中，a为oshma3等位基因hma3-1和hma3-2在酵母中的表达差异，glucose为葡萄糖，作为抑制表达的碳源，galactose为半乳糖，作为诱导表达的碳源，酵母生长于sc-ura(尿嘧啶)营养缺陷培养基上，镉胁迫浓度为10um；b为镉胁迫下酵母生长曲线，培养基为sc-ura(尿嘧啶)液体培养基；c为gfp-hma3融合蛋白的酵母细胞表达定位，hma3ckk表示oshma3的无功能等位基因型；
图3为利用所开发的oshma3基因内标记caps7对hma3-1和hma3-2的pcr鉴定电泳图，琼脂糖凝胶的浓度为2％；9311和nip为对照品种，其中9311含有hma3-2，而nip含有hma3-1。hma3-1/hma3-2表示为杂合状态；
图4为caps7对两种近等基因系nil(hma3-1)和nil(hma3-2)的pcr鉴定胶图，琼脂糖凝胶的浓度为3％；其中nil(hma3-1)含有hma3-1，其胶图为单一的一条带，而nil(hma3-2)含有hma3-2，其胶图为两条带。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。
实施例1：hma3在水稻籼稻亚群和粳稻亚群中等位基因功能差异的发掘
(1)基因hma3的自然变异
针对水稻镉积累相关qtl基因oshma3，对105份种质资源材料(本室收集)中oshma3基因的序列，进行了序列分析。通过mega序列分析软件和structure软件进行了单倍型分析，发现该基因在自然界共存在9种基因型，依次记为hma3-1～hma3-9；其中hma3-2～hma3-6统一属于籼稻基因型，而hma3-1，hma3-7～hma3-9则属于粳稻基因型，见图1a。hma3-1和hma3-2为两种主要的等位基因基因，它们共占全部材料的83.8％；进一步分析发现，hma3-1大部分出现于粳稻品种少部分出现于籼稻品种，而hma3-2则主要出现在籼稻品种，oshma3的单倍型分析发现该基因存在较为明显的籼-粳分化现象。结合稻米镉含量表型，发现含有hma3-1基因型的水稻平均积累的稻米镉显著低于含hma3-2等位基因型的水稻品种，见图1b。在籼稻品种中，oshma3基因同样存在hma3-1和hma3-2间的分布，但是在籼稻品种中hma3-1所占的品种数目较少，见图1c，在籼稻内部，同样发现含有hma3-1基因型的水稻平均积累的稻米镉显著低于含hma3-2等位基因型的水稻品种，见图1d。
(2)hma3-2是oshma3的弱功能等位基因型
利用野生型酵母by4741进行功能差异分析。在10umcdso4胁迫培养下，含有hma3-1和hma3-2的酵母菌株相比于空载体和无功能等位基因型hma3ckk均生长较少，同时含有hma3-2酵母菌株死亡比含有hma3-1的酵母菌株更多，见图2b，同时酵母生长试验表明含有hma3-2的酵母生长速率显著低于含有hma3-1的酵母菌株，见图2b；通过gfp融合蛋白的酵母亚细胞定位，发现无论hma3-1还是hma3-2均主要定位在液泡膜上(其他质膜也有少量分布)，见图2c。上述结果说明hma3-2和hma3-1一样带有将酵母外界的镉转运至酵母体内的功能；由于hma3具有将细胞体内的镉截留于液泡内的能力，而hma3-1作为oshma3强功能的等位基因，其在向液泡内转运能力较强于hma3-2，因此含有hma3-2的酵母菌株在镉胁迫环境的生长要弱于含有hma3-1的酵母菌株，因此hma3-2是oshma3的弱功能等位基因。
实施例2：分子标记caps7的开发及基因型鉴定方法
(1)分子标记caps7的开发
本发明的分子标记caps7，标记设计的原则是：利用生物信息学网站ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中blast工具对hma3-1和hma3-2的序列进行序列比对，找到差异位点，该差异位点形成两种基因型，其中来源于粳稻基因型hma3-1的不能被限制性内切酶asci切割，通过pcr扩增后的asci酶消化后，通过琼脂糖电泳检测为单一条带，pcr产物大小为337bp；籼稻基因型hma3-2则能被限制性内切酶asci切割，通过琼脂糖电泳检测为两个条带，pcr产物大小为196bp和141bp，见图3。
(2)基因型鉴定方法
pcr程序参见萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法，并按照中国科学院亚热带农业生态研究所的条件和要求，做了修改。
正向引物(f)：ctcgtcagcggcctcaagg；
反向引物(r)：gcacgacgaggaggcacg。
基因型鉴定的具体步骤：
1)提取水稻植株的基因组dna；
2)pcr扩增，以步骤s1的水稻植株基因组dna为模板，将上述正向引物(f)和反向引物(r)加入到pcr反应体系中，对所述的水稻植株基因组dna进行扩增得到扩增产物；
所述pcr体系为20ul的体系：水稻植株的基因组dna10～50ng，正向引物(f)和反向引物(r)各0.25um，taqdna聚合酶1u，四种脱氧核糖核苷酸datp、dttp、dctp、dgtp各0.1mm，2×gcbufferi10ul，其余部分用去离子水补齐至20ul。所述2×gcbufferi由takara宝生物工程有限公司生产；
所述pcr的反应程序为：首先在94℃预变性4min，之后进入pcr循环扩增，循环扩增包括94℃变性30sec，60℃或62℃退火30sec，72℃延伸1min，共三步，循环运行30～34次，最后在72℃延伸10min后，25℃保温4min得到扩增产物；
3)pcr产物的酶切消化，酶切体系为10ul，将以下各组分混合：pcr扩增产物100～200ng，asci内切酶buffer(10x)1ul，asci内切酶2u，其余用去离子水补齐；将混合好的酶切体系放置于37℃恒温箱中反应8～12h以上；
4)2％的琼脂糖凝胶电泳检测，点样后，在250v直流电压电泳15～30min，溴化乙锭染色1h后置于紫外灯下，读取各样品的pcr带型；根据pcr带型从而判断出oshma3的等位基因型，有两条带的为hma3-2，而含有一条带的则为hma3-1；当稻米镉积累相关基因oshma3为杂合状态时，通过基因内标记caps7进行鉴定后将在琼脂糖检测中产生三条带，pcr产物大小分别为337bp、196bp和141bp，且337bp带型最亮，见图3。9311和nip为对照品种，其中9311含有hma3-2，而nip含有hma3-1。hma3-1/hma3-2表示为杂合状态。
实施例3:
(1)鉴定、筛选300份水稻籼稻材料的稻米镉积累相关基因oshma3的等位基因型及其有效性试验
以整体平均值作为区分稻米镉含量高低的标准，利用本发明的分子标记caps7鉴定300份籼稻材料的oshma3的等位基因型。
300份材料的稻米镉积累表型收集于污染大田试验，大田种植方式以干湿交替的方式进行，使水稻籽粒内最大程度积累镉元素(大田镉浓度为重度污染，浓度为1.9mg/kg，ph值为5.4)。从表1的300份籼稻材料中提取其基因组dna，利用稻米镉积累相关基因oshma3的基因内标记caps7(其pcr扩增引物为seqidno:4和seqidno:5所示)，按照实施例2中所示方法进行等位基因型鉴定。
表1结果表明，有49份水稻籼稻材料的鉴定结果为337bp，表明oshma3的等位基因型为hma3-1，这49份材料中有45份材料其稻米镉含量比整体平均值水平低，占91.8％；有251份材料的鉴定结果为196bp和141bp，表明带有hma3-2等位基因，这251份材料中有151份材料其稻米镉含量高于整体平均值，占60.2％。说明本发明的分子标记caps7是鉴别水稻镉积累品种的分子标记，可以用于水稻镉低积累品种的预测和筛选。
表1300份籼稻材料的oshma3基因型及稻米cd含量表型
(2)低镉积累籼稻品种的选育
根据(1)中筛选的结果，发明人挑选籼稻品种93-11作为改良品种(含有hma3-2等位基因型)，该品种稻米镉含量较高，其籽粒稻米镉含量在3.6～4.5mg/kg。同时选取粳稻品种日本晴作为供体品种(含有hma3-1等位基因型)，利用回交育种的方式改良93-11的稻米高镉积累特性。
经过杂交及后续的三代回交后，获得了在93-11遗传背景下，oshma3等位基因型为hma3-1/hma3-2杂合状态的f1后代，然后f1自交后进行分离。
通过本发明分子标记caps7的鉴定，分别获得在93-11遗传背景hma3-1纯合和hma3-2纯合的两种近等基因系家系，记作nil(hma3-1)和nil(hma3-2)，两种近等基因系的caps7标记鉴定胶图见图4，nil(hma3-1)含有hma3-1，其胶图为单一的一条带，而nil(hma3-2)含有hma3-2，其胶图为两条带。对这两种材料进行产量和稻米镉积累表型考察见表2，发现nil(hma3-1)的稻米镉含量显著低于nil(hma3-2)，约30.7％左右(p<0.01)；在稻米锌、锰积累上无显著差异(p>0.05)；在株高，单株产量等农艺性状上无显著差异(p>0.05)。
上述结果说明本发明的稻米镉积累相关基因oshma3的基因内分子标记caps7是有效的分子标记，且可用于低镉积累籼稻品种的选育。
表2nil(hma3-1)和nil(hma3-2)在稻米镉积累及其它元素(锰、锌)，农艺性状的比较
*和**分别表示p<0.05，p<0.01
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>中国科学院亚热带农业生态研究所
<120>一种水稻镉积累相关基因oshma3的基因内分子标记caps7及其应用
<130>2018
<160>5
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>3015
<212>dna
<213>水稻(oryzasativa)
<400>1
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