本发明属于含有机有效成分的医药配制品技术领域，尤其涉及一种低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：胰腺癌恶性程度较高，5年生存率低于5％，大多数患者的预后并不十分满意。2015年的中国癌症统计中显示，胰腺癌的致死率在所有癌症中排名第六。胰腺癌每年发生率都在逐渐增加，在不久的将来有可能成为致死率第二的疾病。因此，进一步阐明胰腺癌发生、发展的分子机制对其早期诊断和开发新的治疗位点具有重要意义。肿瘤缺氧微环境是人类恶性实体肿瘤的基本特征之一，肿瘤缺氧与其恶性生物学行为密切相关，临床研究显示：胰腺癌在ct增强扫描下呈无血管的外观特征，瘤体内呈低氧气张力，表明胰腺癌处于低氧环境，具有缺血缺氧的病理生理特点。缺氧与胰腺癌的发生、发展、侵袭转移、复发及化疗抵抗等恶性生物学特性密切相关。微rna(mir)是一类广泛存在于真核生物中的小分子，长度约为19-23个核苷酸。高度保守并且不直接编码蛋白而通过与目的基因3'-非翻译区域的mrna结合，进而降解mir和(或)抑制其翻译。越来越多的证据显示mirnas在调控细胞生物行为上有重要的作用。但mirna在胰腺癌中的功能尚不完全清楚，其与自噬条件的关系尚不明确。然而mirna以及自噬可能在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用，因此明确mirna与胰腺癌自噬条件的关系将有助于对胰腺癌的诊断和治疗。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前关于mirna与胰腺癌自噬条件的研究尚知之甚少，mirna在胰腺癌中的功能尚不完全清楚，其与自噬条件的关系尚不明确。
解决上述技术问题的难度和意义：本发明通过检测胰腺癌在低氧条件下mirnas的差异性表达以及相关生物学效应检测探讨了其在胰腺癌发生发展中的作用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法，通过检测胰腺癌在低氧条件下mirnas的差异性表达以及相关生物学效应检测探讨了其在胰腺癌发生发展中的作用。最终选择差异最为显著的基因mirna-138-5p做为分析对象，明确其抑制胰腺癌发生发展的生物学作用。
本发明是这样实现的，一种低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法，所述低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法包括以下步骤：
步骤一，利用基因芯片对常氧及低氧状态下胰腺癌细胞进行差异mirna筛选，将胰腺癌panc-1细胞系分为两组：mir-138-5pmimics转染组、对照组；
步骤二，分析mir-138-5p在低氧条件下对人胰腺癌细胞系panc1的自噬以及凋亡的影响；
步骤三，双荧光素酶报告基因分型系统验证mir-138-5p与sirt13'端非编码区域的互补结合，证实sirt1是mir-138-5p下游作用靶点。
进一步，所述步骤二中利用流式细胞仪、共聚焦显微镜及westernblot技术，分析mir-138-5p在低氧条件下对人胰腺癌细胞系panc1的自噬以及凋亡的影响。
本发明的另一目的在于提供一种由所述低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法得到的抑制胰腺癌细胞增殖药物。
本发明的另一目的在于提供一种由所述低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法得到的胰腺癌高肝转移细胞系。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：mirna芯片显示，与常氧状态下胰腺癌细胞系相比，胰腺癌癌组织中筛选到83条差异表达mirna，其中73条高表达，10条低表达，差异有统计学意义(p<0.05)。mir-138-5pmimics上调后，westernblot检测实验组自噬相关蛋白被抑制；共聚焦显微镜观察实验组胰腺肿瘤细胞自噬小体增多。凋亡细胞百分率加坏死细胞百分率且各组之间差异均有显著意义(p<0.05)，westernblot检测实验组凋亡相关蛋白表达上调。mir-138-5p与sirt13’utr区域互补结合，抑制sirt1表达减少。mir-138-5p在胰腺癌细胞低氧条件下自噬流中有着重要的作用，通过直接靶向调控sirt1的表达而抑制低氧诱导的自噬，同时促进panc-1胰腺癌细胞的凋亡。这可能是发挥其抑制胰腺癌细胞生存的机制之一。
附图说明
图1是本发明实施例提供的低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的胰腺癌细胞系常氧条件(n)与低氧条件(h)差异微rna表达聚类图。
图3是本发明实施例提供的低氧条件下，过表达mir-138-5p抑制自噬起始复合物mtor的去磷酸化示意图。
图4是本发明实施例提供的a低氧培养条件下，过表达mir-138-5p对胰腺肿瘤细胞自噬的抑制作用，随转染浓度增加逐渐明显示意图。
图5是本发明实施例提供的激光共聚焦显示转染pre-mir-138-5p的胰腺癌细胞自噬溶酶体生成被抑制a低氧条件下，转染lc3双标腺病毒后，过表达mir-138-5p细胞红色游离斑点减少(自噬溶酶体)，黄色斑点增加(自噬体)b各组两种斑点统计直方图，比较各组差异具体统计学差异示意图。
图6是本发明实施例提供的低氧培养条件下，过表达mir-138-5p后细胞凋亡比率a实验组对照组的直方点图，从图中可见随着mir-138-5p表达上调，实验组凋亡细胞明显增多；b各组凋亡比率直方图，比较各组差异具体统计学意义；c过表达mir-138-5p后细胞凋亡相关蛋白细胞色素c、剪切体-caspase3表达上调。
图7是本发明实施例提供的mir-138-5p靶点预测及验证a：targetscan软件预测sirt13'utr区域的mir-138-5p结合位点；b：双荧光素梅实验；c：westernblot实验显示上调panc1细胞mir-138-5p的表达sirt1蛋白的表达减少。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明检测人胰腺癌中在低氧条件下差异性微rna(mir)的表达，探讨其对胰腺癌在低氧诱导自噬中的影响。
如图1所示，本发明实施例提供的低氧下微rna-138-5p对人胰腺癌细胞凋亡影响的检测方法包括以下步骤：
s101：利用基因芯片对常氧及低氧状态下胰腺癌细胞进行差异mirna筛选，将胰腺癌panc-1细胞系分为两组：mir-138-5pmimics转染组、对照组；
s102：利用流式细胞仪、共聚焦显微镜及westernblot等技术，分析mir-138-5p在低氧条件下对人胰腺癌细胞系panc1的自噬以及凋亡的影响；
s103：双荧光素酶报告基因分型系统验证mir-138-5p与sirt13'端非编码区域(3'utr)的互补结合，以证实sirt1是mir-138-5p下游作用靶点。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1:材料来源:人胰腺癌细胞系panc1为华中科技大学同济医学院秦仁义教授惠赠。高糖dmem培养液、特级胎牛血清、双抗溶液及opti-mem购于美国gibco公司。mir-138-5pmimics，非特异性的nc由广州锐博生物公司设计并合成。gapdh一抗购于武汉三鹰生物技术公司，mtor，lc3ii，p62，cleavecasepase3购于美国cst公司。二抗购于武汉博士德生物工程有限公司。lip02000试剂购于美国invitrogen公司。细胞凋亡检测试剂盒购于凯基公司。mrfp-gfp-lc3双荧光自噬指示病毒购于上海汉恒生物公司。mir-138-5p腺病毒购于山东维真生物公司。
1.2细胞培养：panc1细胞用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、链霉素的高糖dmem，常氧下置于37℃、5％co2的胞核湿度培养箱培养。低氧下置于37℃、5％co2、1％o2的胞核湿度培养箱培养。0.25％胰蛋白酶溶液硝化、传代、选用对数生长期的细胞进行实验。
1.3mir芯片数据分析：采用聚类法对3对常氧及低氧状态下胰腺肿瘤细胞进行差异性mirna进行分析。每条信号分布曲线基本重合为有意义。将待比较的两个标准化信号比值作为比较数据(foldchange＝signala/signalb，fc)，计算显著性p值。p<0.05则视为差异有统计学意义。
1.4westernblotting检测蛋白的表达：取呈对数生长的胰腺肿瘤细胞提取蛋白，取20ug细胞总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚亚乙烯双氧化物(pvdf)膜上，振荡封闭，加入一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，37℃孵育2h，洗膜后加入发光试剂，电化学发光试剂盒发光后曝光，以gapdh为内参照。
1.5annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测细胞凋亡：收集不同处理组细胞于离心管，离心后加入4℃预冷pbs清洗细胞3次，800r/min离心5min，弃上清。用200μlbindingbuffer悬浮细胞。每管依次加入3μlannexinv-fitc、5μlpi，混匀；室温避光反应20min；流式细胞仪上机检测，记录结果。luc-sirt1和luc-sirt1突变体通过dna测序确定。应用lipofectamine3000向panc1细胞分别转染sirt13'utr野生型和突变型重组载体，每个载体设置空白组、转染mir-138-5pmimic，模拟物阴性对照、mir-138-5pinhibitor、抑制物阴性对照组，继续培养24h，按照prgmega公司双荧光素没检测试剂盒说明书操作，每组设3个复孔，检测24孔板中各孔细胞的荧光强度。每孔的荧光测定比值为萤火虫荧光素酶活性(f)/海肾荧光素酶活性值(r)，并以△活性背书分析各组双荧光测定比值，△活性倍数＝(r/f)样品/(r/f)对照。
1.6双荧光素酶报告载体的构建pcr扩增这个位点的区域，分别构建sirt1野生型和突变型载体插入到荧光素酶报告基因载体(pmir-report，riobo，china)，与检测：targetscan预测人sirt1基因3'非编码区mir-138-5p的结合位点，
1.7统计学处理：应用spss22.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用t检验，计数资料采用x2检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1常氧及低氧状态下胰腺癌细胞mirna芯片筛选：利用mir芯片(agilentv13.0)对3对不同条件培养的胰腺癌细胞进行检测。结果共筛选出差异性mir83条，其中包括mir-138-5p在内的10条低表达的mirnas。对这些差异基因进行聚类分析后初步明确mir-138-5p可能在胰腺癌细胞的恶性生物学行为中发挥重要作用(图2)。
2.2过表达mir-138-5p抑制胰腺癌细胞系panc1mtor向pmtor的转化，并且同时抑制lc3ii的表达，蛋白表达差异有统计学意义(p<0.05，图3)。胰腺癌细胞系panc1随着mir-138-5p转染浓度的增加，lc3ii表达抑制逐渐明显，在100nm时候达到高峰。(图4)
2.3激光共聚焦显微镜检测：采用40倍油镜观察样品，图像处理后输出。结果如图(6)。lc3聚集成斑状意味着自噬体(绿色)的形成，红色游离斑点代表自噬溶酶体的形成。结果如图，和对照组相比，pre-mir-138-5p处理组细胞中的红色斑点阳性细胞数目明显减少，黄色斑明显增加。经统计学分析表明，两组差异具有统计学意义(p<0.05，图5)。
2.4过表达mir-138-5p促使低氧状态下胰腺癌细胞的凋亡:流式细胞分析显示转染mir-138-5p的panc1细胞在低氧条件下，凋亡增加。westernblot检测凋亡蛋白剪切体casepase3及细胞色素c发现实验组较对照组显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05，图6)。
2.5sirt1是mir-138-5p的直接靶点：应用生物信息学软件对mir-138-5p可能靶点进行预测，可见targetscan，miranda2个生物信息学软件都能预测sirt1是mir-138-5p直接靶点(图7a)，通过双荧光素酶实验验证在胰腺癌细胞中sirt1位mir-138-5p直接靶点(图7b)。同时，wsternblot也验证上调mir-138-5p的表达能抑制sirt1的表达(图7c)，可见在胰腺癌中sirt1是mir-138-5p的直接靶点。
本发明结果显示，上调胰腺癌细胞的mir138-5p表达时，蛋白印迹检测发现其明显抑制胰腺细胞低氧状态下发生自噬，通过电子透射显微镜及共聚焦荧光显微镜进一步观察细胞形态变化显示，mir138-5p可以抑制肿瘤细胞自噬溶酶体的生成并且导致细胞内肿胀、破裂的线粒体释放凋亡蛋白，从而引起胰腺肿瘤细胞凋亡。上调mir-138-5p的同时，发现sirt1表达明显降低，进一步通过双荧光素酶报告基因分析系统，证实sirt1是mir-138-5p的下游分子靶点，至少能部分通过调控sirt1的表达抑制肿瘤细胞的自噬状态，在肿瘤的发生发展中，尤其mir-138-5p的低表达在胰腺癌生存方面有着重要的作用。mir-138-5p可能作为胰腺癌恶性行为的重要标记，并且可能在胰腺癌化疗敏感性方面作为生物靶向治疗提供实验依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。