本发明涉及桃垂枝的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术：
桃[prunuspersica(l.)batsch]是原产我国的重要落叶果树，已有3000多年的栽培历史；在我国，桃是第三大落叶果树，广泛栽培于全国各地，是农业生产的一个重要组成部分。
桃树生长型有多种，并可稳定的遗传，如矮生型（dw，dwdw）、半矮生型（sd，semi-dwarf）、柱型（pi，brbr）、紧凑型（ct，ct）和垂枝型（we，plpl），新树型的开发和应用是我国育种工作的重要组成部分。其中矮生、柱形、紧凑等树形对于改良桃树栽培生产模式意义重大，而垂枝型因其枝条下垂具有较好的观赏价值，是观赏桃主要的育种方向。
垂枝桃（prunus.persicavar.pendula）作为桃的一个变种，枝条下垂如柳，具有极高的观赏价值。yamazakik.（1987）、bassid（2000）和dennisj（2005）通过对桃树的柱形、垂枝、正常树形等杂交发现，垂枝性状受一个单隐性基因（pl）控制。dirlewangere（1994）发现了垂枝性状（pl）的rapd标记，遗传距离为11.4cm（centimorgan）和17.2cm，但遗传距离太大，不足以说明是一个精确的标记，难以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定。
因此，亟需开发并获得与桃垂枝性状紧密连锁的标记，以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定，为提高育种效率奠定基础。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用。选择垂枝桃性状分离后代为试材，通过确定与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记可以实现早期对目标性状进行分子鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
筛选一种与桃垂枝基因紧密连锁的snp分子标记，命名为wesnp-20.83和/或wesnp-20.99；
所述wesnp-20.83位于桃基因组pp03的20.839mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列为：
gtctctgctcggtaattattcctctttgcttgtttgtgttcattggaaagttgggaaagttggsaaagttggcaaagttttgcatagatggaattggtagggcacaaaagttttagataattgt；
所述wesnp-20.99位于桃基因组pp03的20.998mb处，该位点及其侧翼的核苷酸序列为：
acagaaaactcatcaagtttctggaatttattgaacaaaataaaccaaaataacaaactaaaataacgctgtcaaaaagaaaaaccaaccgyactgctattaatcttcctttgaaacatgacatagagaacgtcacttaattgttcttatttttatacaaacgatatttaaaataaaataaaaa，
所述序列中s为g或c，y为c或t。
优选的，垂枝基因型s为c，y为t。
设计一种检测与桃垂枝基因紧密连锁的snp分子标记的引物对，其核苷酸序列为：
ccacatccctctcagcctca和gatcctgagcaatgccaccc，和/或
tctataatcccctcaaccgcca和gtttaagggatcaagggccgt。
发现一种与垂枝基因紧密连锁的indel标记，命名为weindel-21.61，其序列的引物为：
ggggcccaaggaaaggattt，和/或
gtaacccaatgcttgcaaagtca。
所述与桃垂枝基因紧密连锁的snp分子标记在桃垂枝分子标记辅助选择中的应用。
优选的，用于检测杂交后代单株的引物对为：
ctctccaacttcgcgattgtga和tgggctgggaaaactgatcaaa。
所述与桃垂枝基因紧密连锁的snp分子标记在优良桃种质资源选育中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明采用基于snp的第三代分子标记技术，结合构建的分离自交群体，采用图位克隆的方法，对桃垂枝的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发出稳定的、共显性和多态性的snp标记，获得了与桃垂枝基因紧密连锁的snp分子标记，分别命名为wesnp-20.83和wesnp-20.99。由于研究的对象具有垂枝性状的种质，可依据获得的紧密连锁标记克隆目标性状的基因，应用于分子辅助选育优良观赏桃品种。
2.本发明不仅为桃垂枝基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有桃垂枝基因的桃树新品种提供了高效途径。
3.本发明基于开发的分子标记引物提供用于辅助筛选具有特定桃垂枝的桃树新品种的方法。
4.通过本发明提供的分子标记，可以实现早期对桃垂枝性状进行分子鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
5.本发明方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。
附图说明
图1为垂枝表型图；
图2为垂枝与普通表型对比图；
图3为与垂枝基因连锁的indel标记weindel-21.61的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图4为与垂枝基因完全连锁的snp标记wesnp-20.99的测序峰图和snp位点示意图；
图5为与垂枝基因紧密连锁的snp标记weyz-snp的测序峰图和snp位点示意图；
图6为检测杂交后代单株的snp标记weyz-snp在亲本‘新乡144’重测序突变位点示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：杂交分离群体垂枝表型的鉴定
根据桃树枝条的直立与垂枝程度，进行表型评价，其中枝条新稍下垂似垂柳状为垂枝型，如图1所示；枝条新稍负地向上生长为普通型，如图2所示。
以“新乡144”为亲本自交，获得自交后代152株实生苗，定植后于2016年4月进行表型评价。
通过对后代单株进行表型评价，发现其中普通96株，垂枝56株，二者比例接近3：1，p值为0.700，符合孟德尔遗传规律，垂枝性状为隐形单基因控制。
实施例二：基因组dna的提取
采用ctab法提取桃叶片基因组dna，具体步骤如下：
（1）取桃幼嫩叶片约30mg，放入1.2ml八联排离心管，每孔各加入1个5mm钢珠，放入96孔底座，液氮充分冷冻；
（2）手动摇晃数次，保证钢珠充分打碎样品，dna自动研磨仪（上海领成生物科技有限公司）进行研磨，频率30hz，时间90s；
（3）用300ml量程8通道移液器加入配制好的ctab液600μl，放入60℃电热恒温鼓风干燥箱加热30min，其间约每10min轻摇匀；
（4）放入冷冻离心机（eppendorf5810r）4℃条件下，4000rpm瞬时离心；加入氯仿和异戊醇混合液，体积比为24：1，直至1.2ml的八联排离心管满载线，后缓慢颠倒混匀5min，放入冷冻离心机（eppendorf5810r）4℃条件下，4000rpm，离心10min；
（5）分别吸取上清液150µl于两个96孔pcr板中，其中一板加入等体积的无水乙醇，于-20℃冰箱1小时，之后，4℃条件下，4000rpm，离心10min，弃上清液；另一板放入4℃冰箱，保存备用；
（6）在带有沉淀的96孔pcr板中加入150μl的70%的乙醇，4000rpm瞬时离心，洗涤沉淀2次，加入无水乙醇洗涤沉淀一次，用100μl的8通道移液器（eppendorf）吸除离心管底部剩余无水乙醇，后自然晾干；
（7）在室温下自然风干沉淀后，加入150μl体积的0.1×te溶解沉淀dna，同时加入0.5μl的rnase，37℃放置1h，祛除rna污染，以用于后续试验。
实施例三：snp开发的引物设计
参考桃基因组序列（genomedatabaseforrosaceaepeachversion2.0），采用primer3input（version4.0）（http://primer3.ut.ee/）设计引物，引物参数为退火温度在60～62℃之间，引物长度20～25bp，开发基于sanger测序的snp标记，选择约每1mb设计1对引物，扩增片段长度约为700～1600bp。
详细引物信息如表1所示：
表1采用紧密连锁snp标记的引物信息
实施例四：pcr反应体系以及snp标记的获得
pcr扩增体系总体积为30μl，具体组分如表2所示：
表2pcr反应体系
混匀后，在离心机（5810r，eppendorf）离心，并在pcr仪（eppendorf）上进行扩增。pcr扩增程序为95℃3min；95℃30s，56.5℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。
对亲本、后代各4个单株进行pcr扩增，pcr扩增成功后，产物送上海生工生物工程有限公司进行sanger测序，将测序结果在contig软件中打开，序列对齐后寻找与目标性状连锁的多态性snp标记。
实施例五：基于sanger测序的基因分型
在获得亲本基因型和表型一致的snp后，对剩余的自交后代pcr扩增后送上海生工进行sanger测序，将测序结果在contig软件中打开，寻找与目标性状连锁snp标记，对f1群体单株进行基因分型。
实施例六：目标性状紧密连锁标记的开发及应用
基于sanger测序结果，寻找紧密连锁的snp标记，表现为“新乡144”亲本基因型为aa，子代普通表型基因型为aa、aa，垂枝表型基因型为aa。
首先，在4个子代中获得紧密连锁的snp标记，然后扩大至子代各20个单株测序分析，进而扩大至全部后代单株样品，确定紧密连锁的snp标记后，继续开发snp标记，逐步缩小定位区间，最终实现精细定位。在精细定位区间依据亲本的基因型和表型开发更多的snp标记，用于区分不同自交后代单株，确立紧密连锁的snp标记。
indel标记进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果如图3所示，a基因扩增片段长度约为270bp，a基因扩增片段长度约为250bp，而aa基因型有片段大小不同的两条带270bp、250bp，具有明显的多态性。基于基因型与表型相一致，确定交换单株进而对目的基因进行精细定位。
与垂枝基因紧密连锁的snp标记wesnp-20.99的测序峰图和snp位点示意图分别如图4所示，wesnp-20.99在垂枝单株扩增位点的基因型为t/t（aa），在普通生长型中的扩增位点为c/t（aa）、cc（aa），基因型与表型紧密连锁。
用于检测杂交后代单株的snp标记weyz-snp测序峰图和snp位点示意图分别如图5所示，weyz-snp在垂枝单株扩增位点的基因型为c/c（aa），在普通生长型中的扩增位点为c/t（aa）、t/t（aa），基因型与表型紧密连锁。
用于检测杂交后代单株的snp标记weyz-snp的igv数据如图6所示，其在亲本‘新乡144’中扩增位点为c/t，在子代垂枝植株中扩增位点为c/c，普通表型植株中扩增位点为c/t或者t/t。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
sequencelisting
<110>中国农业科学院郑州果树研究所
<120>与桃垂枝基因紧密连锁的分子标记及其应用
<130>2018
<160>12
<170>patentinversion3.2
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<212>dna
<213>prunuspersica
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