本发明涉及动物检验检疫技术领域，特别是涉及一种准确、快速的诊断进出口熊蜂和蜜蜂上短膜虫的方法。
背景技术：
短膜虫(crithidia)属于动鞭毛虫纲(zoomastigophorea)、动质目(kinetoplastida)、锥虫亚目(rrypanosomatina)、短膜虫属(crithidia)。短膜虫属主要是无脊椎动物的寄生虫，全部寄生于昆虫，为昆虫肠道寄生原虫。寄生在蜂上的短膜虫有熊蜂短膜虫和蜜蜂短膜虫，这些短膜虫可交叉感染，国外研究报告熊蜂短膜虫是危害熊蜂的肠道寄生虫之一，据近期研究报道在智利外来进口熊蜂传播熊蜂短膜虫，造成当地的一种熊蜂种群数量减少的主要原因之一。随着商品熊蜂群和蜜蜂群的应用规模越来越大，商品化蜂群在不同国家间的进出口也越来越频繁，如果预防不好，不可避免会传播一些病虫害，其中寄生虫是影响熊蜂和蜜蜂生态分布和商业化发展的主要因素之一，因此，短膜虫成为熊蜂和蜜蜂进出口检验检疫的重要病原物之一，但目前仍没有一套完善的关于短膜虫的检验鉴定方法。
短膜虫感染的熊蜂和蜜蜂没有任何明显的外部症状，极易与微孢子虫病混淆，但是其外部形态与微孢子虫差别很大，短膜虫活着状态下在显微镜下可以看到其尾部有一条不停游动的小鞭毛。因此可以采用镜检法初步检验样品是否被感染，镜检法是将被检样品研磨后，滴加蒸馏水，取1-2滴在载玻片上，于光学显微镜下观察，但是镜检只能确定是否被感染短膜虫，不能确定其是否是熊蜂短膜虫，需采用分子方法进一步确定其种类。
现有技术中采用分子方法对寄生在熊蜂和蜜蜂身上的短膜虫进行检测鉴定，只能检测鉴定出熊蜂短膜虫，对于寄生在不同寄主上的蜜蜂短膜虫以及其他种类的短膜虫无法鉴定(jilianli,haoranqin,jiewu,benm.sadd,xiuhongwang,jayd.evans,wenjunpeng,yanpingchen.theprevalenceofparasitesandpathogensinasianhoneybeesapisceranainchina.plosone)，而其他种类的短膜虫也会感染蜜蜂或熊蜂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的方法及试剂盒，不仅可以检测出感染宿主蜂的熊蜂短膜虫，还可以鉴定出蜜蜂短膜虫及其他种类的短膜虫。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的方法，包括以下步骤：提取待检验蜂样品的肠道dna，用seqidno.1和seqidno.2所示特异性引物序列进行pcr扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若能够扩增出417bp的基因片段，则待检验蜂群中感染了短膜虫。
本发明中所述短膜虫优选为熊蜂短膜虫和蜜蜂短膜虫。
优选的，所述pcr的反应体系优选为25μl反应体系，所述25μlpcr的反应体系中含有5μlbuffer，1.5μl25mm的mgcl2，2.0μl200μm的dntps，10μm序列为seqidno.1和seqidno.2的引物各1μl，0.625u/管的dna聚合酶，5μl5ng/μl的模板dna，余量的ddh2o。
优选的，所述pcr的反应条件为：95℃预变性4min后进入循环：95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min。
优选的，所述用于琼脂糖凝胶电泳的扩增产物体积为5～10μl。
优选的，本发明所述蜂群为熊蜂或蜜蜂。
更优选的，所述蜜蜂为中华蜜蜂。
本发明还提供了一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的试剂盒，所述试剂盒中含有pcrbuffer，20～30mm的mgcl2，150～250μm的dntps，8～15μm序列为seqidno.1和seqidno.2的引物，0.5～0.8u的dna聚合酶，ddh2o。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的方法，提取待检验蜂样品的肠道dna，用seqidno.1和seqidno.2所示特异性引物序列进行pcr扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若能够扩增出417bp的基因片段，则待检验蜂群中感染了短膜虫。采用特异性引物对待检测样品肠道dna进行pcr扩增，根据扩增产物的长度即可判断待检验检疫样品中是否感染了短膜虫。本发明的方法不仅可以检测出感染宿主蜂的熊蜂短膜虫，还可以鉴定出蜜蜂短膜虫及其他种类的短膜虫，扩大了检验检疫对象的应用范围。本发明的方法能够准确、灵敏、快速的检验检疫进出口熊蜂和蜜蜂上的短膜虫，而且费用较适中，使用的大部分检测试剂对人无害，适宜于大规模应用。
本发明提供的检验检疫蜂群中感染短膜虫的试剂盒，只需要进行一次pcr扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可准确检验检疫蜂群中是否感染了短膜虫，方便、准确、快速。
附图说明
图1：短膜虫在显微镜下的外部形态；
图2：实施例1中不同熊蜂寄主来源的短膜虫pcr产物的琼脂糖凝胶电泳条带；其中m：dnamarker；n：阴性对照(未感染短膜虫的熊蜂基因组dna)；泳道1-3：bombusfriseanus；泳道4：bombusladakhensis；泳道5：bombusflavescens，泳道6：bombusfestivus，泳道7：bombusavanus，泳道8：bombuslepidus，泳道9：bombusterrestris(瑞士)；
图3：实施例2中不同地区中华蜜蜂寄主来源的短膜虫pcr产物的琼脂糖凝胶电泳条带，其中m：dnamarker；n：阴性对照(未感染短膜虫的熊蜂基因组dna)；泳道1-10分别表示来自北京、四川、陕西、安徽、江西、浙江、海南、湖北、福建、云南。
具体实施方式
本发明提供了一种准确、灵敏、快速的检验检疫蜂群中感染短膜虫的方法，包括以下步骤：提取待检验蜂样品的肠道dna，用seqidno.1和seqidno.2所示特异性引物序列进行pcr扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若能够扩增出417bp的基因片段，则待检验蜂群中感染了短膜虫。
本发明所述蜂群优选为熊蜂或蜜蜂。本发明对熊蜂和蜜蜂的种类和地区没有限定，任意地区的不同熊蜂和蜜蜂感染短膜虫都可以用本发明的方法进行检验检疫。
本发明对样品肠道dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域中的常规dna提取方法即可。
本发明所述引物如下：
cri-f：5’-cttttggtcggtggagtgat-3’；(如seqidno.1所示)
cri-r：5’-ggacgtaatcggcacagttt-3’；(如seqidno.2所示)。
采用上述引物对蜂样品的肠道dna进行pcr扩增。本发明中，所述pcr的反应体系优选为25μl反应体系，所述25μlpcr的反应体系优选含有5μlbuffer，1.5μl25mm的mgcl2，2.0μl200μm的dntps，10μm序列为seqidno.1和seqidno.2的引物各1μl，0.625u/管的dna聚合酶，5μl5ng/μl的模板dna，余量的ddh2o。
本发明中，所述pcr的反应条件优选为：95℃预变性4min后进入循环：95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min。
本发明将扩增出的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，优选利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。本发明对琼脂糖凝胶电泳的操作方法没有特殊限定，采用本领域中的常规操作方法即可。本发明中，优选将5～10μl的扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳的检测，更优选扩增产物体积为6～8μl。
根据琼脂糖凝胶电泳进行判断，若能够扩增出大小为417bp的基因片段，则待检验蜂群中感染了短膜虫。
本发明的方法不仅可以检测出感染宿主蜂的熊蜂短膜虫，还可以鉴定出感染宿主蜂的蜜蜂短膜虫及其他种类的短膜虫，扩大了检验检疫对象的应用范围。且该方法准确、灵敏、快速，费用较适中，使用的大部分检测试剂对人无害，适宜于大规模应用。
本发明还提供了一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的试剂盒，所述试剂盒中含有pcrbuffer，20～30mm的mgcl2，150～250μm的dntps，8～15μm序列为seqidno.1和seqidno.2的引物，0.5～0.8u的dna聚合酶，ddh2o；优选含有pcrbuffer，25mm的mgcl2，200μm的dntps，10μm序列为seqidno.1的引物和10μm序列为seqidno.2的引物，0.625u的dna聚合酶，ddh2o；更优选含有50μlpcrbuffer，150μl25mm的mgcl2，20μl200μm的dntps，10μl10μm序列为seqidno.1的引物和10μl10μm序列为seqidno.2的引物，2.5μl0.625u的dna聚合酶，50μlddh2o。本发明对上述试剂盒的制备方法没有特殊限定，采用本领域中的常规制备方法即可，所用组分均可采用本领域中的常规市售产品。
本发明提供的检验检疫蜂群中感染短膜虫的试剂盒，只需要进行一次pcr扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可准确检验检疫蜂群中是否感染了短膜虫，方便、准确、快速。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
国内外熊蜂中短膜虫的检验
采用本发明方法，对来自瑞士的5只熊蜂bombusterrestris和国内的1只熊蜂bombusladakhensis、3只bombusfestivus、1只bombusfriseanus进行短膜虫的检验。
提取熊蜂蜂群的肠道dna样本，采用本发明的下述引物进行扩增，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
引物序列为：
cri-f：5’-cttttggtcggtggagtgat-3’；(如seqidno.1所示)
cri-r：5’-ggacgtaatcggcacagttt-3’；(如seqidno.2所示)。
pcr反应体系：
25μl反应体系中加入5μl的5×gotaqbuffer、1.5μl的mgcl2(25mm)(promega)，2.0μl的dntps(200μm)(takara)，ssurrna-f1、ssurrna-r1b引物各1μl(10μm)，0.625u/管的gotaqdna聚合酶，5μl的模板dna(约5ng/μl)，9.375μl的ddh2o。
pcr反应条件为：反应体系95℃预变性4min后进入循环：95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min。取5μl扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果见图2pcr产物的琼脂糖凝胶电泳条带。
不同熊蜂寄主来源的短膜虫用引物cri-f/cri-r扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果表明均扩增出了417bp的基因片段，表明使用本发明的方法可用于检验不同寄主来源的短膜虫的检验检疫。
实施例2
我国不同地区中华蜜蜂短膜虫的检验
采用本发明方法，对来自我国不同省区(北京、四川、陕西、安徽、江西、浙江、海南、湖北、福建、云南)的中华蜜蜂进行短膜虫的检验。
pcr反应方法、体系与条件均同实施例1，pcr扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。图3为来自我国不同地区中华蜜蜂短膜虫pcr产物的琼脂糖凝胶电泳条带。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测发现均扩增出了417bp的基因片段，说明来自10个省区的中华蜜蜂都感染了短膜虫。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国农业科学院蜜蜂研究所
<120>一种检验检疫蜂群中感染短膜虫的方法及试剂盒
<130>gw2018i0600
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cttttggtcggtggagtgat20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ggacgtaatcggcacagttt20