可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片及其检测方法与流程

本发明属于微流控分析技术领域，具体涉及一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片及其检测方法。

背景技术

目前，水中金属离子的检测主要基于原子吸收、原子发射光谱和电感耦合等离子体质谱，这些仪器可同时检测多种金属离子，检测灵敏度高，检出限低。但是仪器昂贵，对操作者技术要求高，限制了现场检测和资源匮乏地区的应用。

为了简化操作和降低成本，基于金属特异性响应的dna的可视化的检测方法被设计出来用于金属离子的检测。通过体外筛选可以产生一系列针对金属离子的特异性dna，被用于多种金属离子的检测。基于dna分子设计的金属离子传感器的特点：dna分子可以重复变形和复性，不丧失活性。其次dna分子容易修饰和标记，从而更加合理的设计金属离子传感器。dna可以通过化学合成得到，成本低廉。然而这些基于dna的可视化检测往往只能给出定性或半定量的检测结果，方法检出限无法满足国标要求，仍需要借助仪器方法。而且这些方法检测金属离子的数量过少，限制了实际应用。因此，发明一种用于多种金属离子可视化定量检测的方法很有实际意义。

技术实现要素：

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片及其检测方法，本发明使用多元体积柱芯片通过双氧水分解产生的氧气推动墨水柱移动，将检测结果呈现在芯片上，不需要借助昂贵的仪器和复杂的数据处理过程就能实现可视化定量检测水中铜、铅、汞三种金属离子的检测方法。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：

一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片，包括第一玻璃芯片和第二玻璃芯片，所述第一玻璃芯片和第二玻璃芯片均呈长方形且尺寸相同，所述第一玻璃芯片的内侧与第二玻璃芯片的内侧贴合并滑动接触，所述第一玻璃芯片内侧设有墨水移动通道组、墨水指示通道和样品槽组，所述墨水移动通道组位于第一玻璃芯片的上部，包括第一墨水移动通道、第二墨水移动通道和第三墨水移动通道，所述第一墨水移动通道、第二墨水移动通道和第三墨水移动通道自第一玻璃芯片的左侧至右侧依次平行设置，所述样品槽组位于第一玻璃芯片的下部，包括第一样品槽、第二样品槽和第三样品槽，所述第一样品槽位于第一墨水移动通道下方，所述第二样品槽位于第二墨水移动通道下方，所述第三样品槽位于第三墨水移动通道下方，所述墨水指示通道位于墨水移动通道组和样品槽组之间并平行于第一玻璃芯片的上、下边，所述第二玻璃芯片内侧设有试剂槽组，所述试剂槽组包括第一试剂槽、第二试剂槽和第三试剂槽，在所述第一玻璃芯片和第二玻璃芯片完全重合时，所述样品槽组与试剂槽组无重合部分，在所述第一玻璃芯片和第二玻璃芯片保持上、下边对齐而部分重合并且第一样品槽和第一试剂槽重合时，所述第二样品槽和第二试剂槽、第三样品槽和第三试剂槽也重合，并且墨水移动通道组、墨水指示通道和试剂槽组相通，所述墨水指示通道设有墨水进水孔和墨水出水孔，所述第一样品槽、第二样品槽和第三样品槽均设有样品注入孔和样品流出孔，所述第一试剂槽、第二试剂槽和第三试剂槽均设有试剂注入孔和试剂流出孔，所述墨水进水孔、墨水出水孔、样品注入孔、样品流出孔、试剂注入孔和试剂流出孔均位于所述第一玻璃芯片上，所述墨水柱指示通道内注满墨水。

作为进一步改进的技术方案，所述第一墨水移动通道用于定量检测铜离子，所述第二墨水移动通道用于定量检测铅离子，所述第三墨水移动通道用于定量检测汞离子，所述第一墨水移动通道、第二墨水移动通道和第三墨水移动通道均呈连续的“s”型，并平行于第一玻璃芯片的左、右侧边，所述第一玻璃芯片上还设有墨水移动距离标尺，所述墨水移动距离标尺位于墨水移动通道组的上端和左右两侧端。

作为进一步改进的技术方案，所述第一玻璃芯片和第二玻璃芯片采用标准光刻和湿法刻蚀制备，并且第一玻璃芯片和第二玻璃芯片各自的内侧均经过疏水化处理，所述第一玻璃芯片内侧和第二玻璃芯片内侧通过二甲基硅油贴合。

作为进一步改进的技术方案，所述标准光刻所采用的光刻胶为spr220-7，显影液为az400k，所述湿法刻蚀所采用刻蚀液为hf、nh4f和hno3混合溶液，所述hf、nh4f和hno3的摩尔比为1:0.5:0.75，所述疏水化处理所采用的疏水试剂采用全氟辛基三氯硅烷。

一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片的检测方法，包括以下步骤：

s1、准备多元体积柱芯片：取如权利要求1或2所述的可视化定量检测水中铜、铅、汞三种重金属离子的多元体积柱芯片；

s2、制备核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针：分别制备用于检测铜离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针、用于检测铅离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针和用于检测汞离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针；

s3、制备dna修饰的铂纳米探针：采用抗坏血酸还原氯铂酸制备铂纳米粒子，再将巯基修饰的用于检测铜离子的dna、用于检测铅离子的dna和用于检测汞离子的dna分别共价结合到铂纳米粒子表面，得到用于检测铜离子的dna修饰的铂纳米探针、用于检测铅离子的dna修饰的铂纳米探针和用于检测汞离子的dna修饰的铂纳米探针；s4、制备复合探针溶液：将所述步骤s2中的用于检测铜离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针与所述步骤s3中的用于检测铜离子的dna修饰的铂纳米探针进行孵育，通过dna双链互补形成用于检测铜离子的复合探针，之后再将用于检测铜离子的复合探针分散于缓冲溶液中，制得用于检测铜离子的复合探针溶液，将所述步骤s2中的用于检测铅离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针与所述步骤s3中的用于检测铅离子的dna修饰的铂纳米探针进行孵育，通过dna双链互补形成用于检测铅离子的复合探针，之后再将用于检测铅离子的复合探针分散于缓冲溶液中，制得用于检测铅离子的复合探针溶液，将所述步骤s2中的用于检测汞离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针与所述步骤s3中的用于检测汞离子的dna修饰的铂纳米探针进行孵育，通过dna双链互补形成用于检测汞离子的复合探针，之后再将用于检测汞离子的复合探针分散于缓冲溶液中，制得用于检测汞离子的复合探针溶液；

s5、建立标准曲线：在所述步骤s4中的用于检测铜离子的复合探针溶液、用于检测铅离子的复合探针溶液和用于检测汞离子的复合探针溶液中分别加入不同浓度的铜、铅、汞分析物进行避光震荡反应，之后再进行磁铁分离，分别得到不同浓度的铜、铅、汞分析物的待测清液，取所述待测清液分别加入步骤s1中的多元体积柱芯片的第一样品槽、第二样品槽和第三样品槽中，并在所述试剂槽组中加入h2o2溶液，在所述铜离子待测清液、铅离子待测清液和汞离子待测清液与h2o2溶液混合后，记录下所述多元体积柱芯片内墨水柱前进的距离，拟合出标准曲线方程，建立起标准曲线；

s6、样品检测：采集待测的样品进行过滤，得到待测水样，而后将所述待测水样分别加入步骤s4中的用于检测铜离子的复合探针溶液、用于检测铅离子的复合探针溶液和用于检测汞离子的复合探针溶液中进行避光震荡反应，之后再进行磁铁分离，得到待测清液，取所述清液加入所述步骤s1中的多元体积柱芯片的样品槽中，并在所述试剂槽中加入h2o2溶液，所述多元体积柱芯片的墨水柱指示通道内注满墨水，在所述待测清液与h2o2溶液混合后，记录下多元体积柱芯片内墨水柱前进的距离，最后利用所述步骤s5中的标准曲线分析得到待测水样中铜、铅、汞三种重金属离子的浓度。

作为进一步改进的技术方案，所述步骤s2具体包括以下步骤：

(a)采用共沉淀法制备磁性fe3o4纳米粒子；

(b)采用反相微乳液法用所述步骤(a)中的磁性fe3o4纳米粒子制备磁性二氧化硅纳米粒子；

(c)利用席夫碱反应，以戊二醛作为交联剂，将氨基修饰的用于检测铜离子的核酸、用于检测铅离子的核酸和用于检测汞离子的核酸分别共价结合到磁性二氧化硅纳米粒子的表面，得到用于检测铜离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针、用于检测铅离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针和用于检测汞离子的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针。

作为进一步改进的技术方案，所述步骤s3中巯基修饰dna时所采用的tecp和dna的摩尔比为5:1；所述巯基修饰的用于检测铜离子的dna的序列为sh-(ch2)6-5'ggtaagcctgggcctctttctttttaagaaagaac3'、所述巯基修饰的用于检测铅离子的dna的序列为sh-(ch2)6-5'tgagtgataaagctggccgagcctcttctctac3、所述巯基修饰的用于检测汞离子的dna的序列为sh-(ch2)6-5'acaaacatga3'。

作为进一步改进的技术方案，所述步骤s4中的缓冲溶液为含有150mm的nano3的ph值为8.2的tris-乙酸，反应温度为20-25℃，反应时间为4h。

作为进一步改进的技术方案，所述步骤s5和s6中的避光震荡反应时间均为30min，并且均通过滑动所述多元体积柱芯片使得待测清液与h2o2溶液混合，所述待测清液与h2o2溶液混合好之后等待10min，记录下检测结果。

10.根据权利要求6所述的可视化定量检测水中铜、铅、汞三种重金属离子的多元体积柱芯片的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中反相微乳液体系的组分包括4.42g的tritonx-100、18.8ml的环己烷和4ml的正己醇，利用戊二醛活化氨基修饰磁性二氧化硅纳米粒子过程所采用的缓冲溶液为ph值为7.4的pb缓冲溶液，反应时间为24h，所述氨基修饰的用于检测铜离子的核酸序列为

nh2-(ch2)6-5'aaaaaaaaagcttctttctaatacggcttacc3'、

氨基修饰的用于检测铅离子的核酸序列为

nh2-(ch2)6-5'aaaaaaaaagtagagaaggratatcactca3'、

氨基修饰的用于检测汞离子的核酸序列为

nh2-(ch2)6-5'tcatgtttgtttgttggccccccttctttctta3'，所述氨基修饰的核酸用量均为1μl1μm，所述氨基修饰核酸共价结合到磁性纳米二氧化硅粒子表面的反应过程所采用的缓冲溶液为含有150mmnano3的25mmph8.2的tris-醋酸缓冲溶液，反应温度为20℃，反应时间12h。

本发明的有益效果为：

本发明是将滑动芯片，纳米技术和生物技术三者相结合，利用dna对金属离子的特异性识别原理，在特定金属离子存在下，解离核酸修饰的磁性纳米粒子和铂纳米粒子组装成的复合探针，通过滑动芯片，解离的铂纳米探针接触双氧水产生的氧气推动墨水柱移动，检测结果以类似于柱状图形式呈现在芯片上，不需要昂贵的仪器和复杂的数据处理过程直接读取结果，适合原位，实时分析。

(1)多元体积柱芯片具有定量检测和较高通量，适合多种金属离子平行分析。三通道的多元体积柱芯片可以用于现场环境水样中铜、铅、汞金属离子同时检测，也可以同时检测三个水样中金属离子的含量，检测时间仅需10min，相比现有技术中的半定量可视化检测，本发明的检出限：铜为1.0nm、铅为1.0nm、汞为1.8nm，均低于国标中饮用水铜、铅、汞的检测标准，精度高，测试范围大，且考察常见的ca²⁺、mn²⁺、cd²⁺、mg²⁺、co²⁺、ni²⁺和zn²⁺7种金属离子均不会影响本方法的选择性。

(2)本发明所需要的芯片有两块普通玻璃制备而成，样品和试剂用量较少，检测成本低，可以用于低成本定量检测，多元体积柱芯片操作简便，可反复使用，同时还可以与手机智能终端结合，将分析结果在第一时间反馈给监测部门。

(3)通过替换其它对金属有特异性响应的dna，利用本发明中复合物探针制备方法以及多元体积柱芯片，按需设计芯片通量，可以推广到更多金属离子的可视化定量检测。

(4)本发明为环境、食品安全、医疗和司法鉴定中重金属检测提供了一种新的分析手段。

附图说明

图1为本发明的多元体积柱芯片的第一玻璃芯片和第二玻璃芯片完全重合时的结构示意图；

图2为本发明的多元体积柱芯片的样品槽组和试剂槽组重合时的结构示意图；

图3为本发明的多元体积柱芯片掩模图案和芯片图案；

图4为本发明的多元体积柱芯片实际样品的检测图。

附图标记说明：1、第一玻璃芯片；2、第二玻璃芯片；3、墨水指示通道；4、第一墨水移动通道；5、第二墨水移动通道；6、第三墨水移动通道；7、第一样品槽；8、第二样品槽；9、第三样品槽；10、第一试剂槽；11、第二试剂槽；12、第三试剂槽；13、墨水进水孔；14、墨水出水孔；15、样品注入孔；16、样品流出孔；17、试剂注入孔；18、试剂流出孔；19、墨水移动距离标尺。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例

如图1-3所示，一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片，包括第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2，所述第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2均呈长方形且尺寸相同，所述第一玻璃芯片1的内侧与第二玻璃芯片2的内侧贴合并滑动接触，所述第一玻璃芯片1内侧设有墨水移动通道组、墨水指示通道3和样品槽组，所述墨水移动通道组位于第一玻璃芯片1的上部，包括第一墨水移动通道4、第二墨水移动通道5和第三墨水移动通道6，所述第一墨水移动通道4、第二墨水移动通道5和第三墨水移动通道6自第一玻璃芯片1的左侧至右侧依次平行设置，所述样品槽组位于第一玻璃芯片1的下部，包括第一样品槽7、第二样品槽8和第三样品槽9，所述第一样品槽7位于第一墨水移动通道4下方，所述第二样品槽8位于第二墨水移动通道5下方，所述第三样品槽9位于第三墨水移动通道6下方，所述墨水指示通道3位于墨水移动通道组和样品槽组之间并平行于第一玻璃芯片1的上、下边，所述第二玻璃芯片2内侧设有试剂槽组，所述试剂槽组包括第一试剂槽10、第二试剂槽11和第三试剂槽12，在所述第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2完全重合时，所述样品槽组与试剂槽组无重合部分，在所述第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2保持上、下边对齐而部分重合并且第一样品槽7和第一试剂槽10重合时，所述第二样品槽8和第二试剂槽11、第三样品槽9和第三试剂槽12也重合，并且墨水移动通道组、墨水指示通道3和样品槽组相通，所述墨水指示通道3设有墨水进水孔13和墨水出水孔14，所述第一样品槽7、第二样品槽8和第三样品槽9均设有样品注入孔15和样品流出孔16，所述第一试剂槽10、第二试剂槽11和第三试剂槽12均设有试剂注入孔17和试剂流出孔18，所述墨水进水孔13、墨水出水孔14、样品注入孔15、样品流出孔16、试剂注入孔17和试剂流出孔18均位于第一玻璃芯片1上，所述墨水指示通道3内注满墨水。

本实施例中，所述第一墨水移动通道4用于定量测量铜离子，所述第二墨水移动通道5用于定量测试铅离子，所述第三墨水移动通道6用于定量测量汞离子，所述第一墨水移动通道4、第二墨水移动通道5和第三墨水移动通道6均呈连续的“s”型，并平行于第一玻璃芯片1的左、右侧边，所述第一玻璃芯片1上还设有墨水移动距离标尺19，所述墨水移动距离标尺19位于墨水移动通道组的上端和左右两侧端。

本实施例中，所述第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2采用标准光刻和湿法刻蚀制备，并且第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2各自的内侧均经过疏水化处理，所述第一玻璃芯片1内侧和第二玻璃芯片2内侧通过二甲基硅油贴合。

本实施例中，所述标准光刻所采用的光刻胶为spr220-7，显影液为az400k，所述湿法刻蚀所采用刻蚀液为hf、nh4f和hno3混合溶液，所述hf、nh4f和hno3的摩尔比为1:0.5:0.75，所述疏水化处理所采用的疏水试剂采用全氟辛基三氯硅烷。

一种可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片的检测方法，包括以下步骤：

s1、准备多元体积柱芯片：取本实施例中的可视化定量检测水中铜、铅、汞三种重金属离子的多元体积柱芯片；

s2、制备核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针，具体依次包括以下步骤：

(a)制备磁性fe3o4纳米粒子，具体依次包括以下步骤：

(a1)称5.2g的fecl3和2.0g的fecl2，共同溶解到25ml的脱氧水中；

(a2)配置250ml1.5m的naoh溶液；

(a3)在磁力搅拌下将溶液步骤滴加到步骤(a1)中的脱氧水中，产生黑色fe3o4沉淀后，用磁铁将fe3o4吸住，弃去清液，用脱氧水清洗沉淀3次；

(a4)配置500ml0.01m的hcl溶液并将其加入到步骤(a3)中的fe3o4沉淀中，不断搅拌中和残留的naoh；

(a5)将步骤(a4)中得到的沉淀经二次去离子水清洗几次，得到磁性fe3o4胶体纳米粒子。

(b)合成磁性二氧化硅纳米粒子，具体依次包括以下步骤：

(b1)取4.42g的tritonx-100，18.8ml的环己烷和4ml的正己醇于50ml的锥形瓶中，搅拌10min，溶液混合均匀；

(b2)加入1ml的高纯水和12.5mg的步骤(b1)制备的fe3o4纳米粒子，再进行超声分散；

(b3)将步骤(b2)中分散好的fe3o4纳米粒子快速加入步骤(b1)的溶液中；

(b4)加入300μl正硅酸乙酯到步骤(b3)最后得到的溶液中，并搅拌40min；

(b5)加入200μl氨水到步骤(b4)最后得到的溶液中反应18h；

(b6)加入100μl3-氨丙基三乙氧基硅烷于步骤(b5)最后得到的溶液中，继续反应10h；

(b7)用磁铁分离步骤(b6)最后得到的溶液中的沉淀，用20ml无水乙醇清洗多次，再用20ml去离子水清洗多次，得到磁性二氧化硅纳米粒子

(c)制备磁性二氧化硅纳米探针，具体依次包括以下步骤：

(c1)将实施例3中制备的磁性二氧化硅纳米粒子在20ml25mmph值为7.4的pb缓冲溶液超声分散30min；

(c2)加入1ml50％戊二醛于步骤(c1)最后得到的溶液中，在20℃搅拌反应24h，得到醛基活化的磁性二氧化硅纳米粒子；

(c3)用磁铁分离出醛基活化的磁性二氧化硅纳米粒子，用含有150mmnano3的25mmph8.2的tris-醋酸缓冲溶液清洗几遍，分散在10ml上述tris-醋酸缓冲溶液中；

(c4)取0.1ml步骤(c3)中最后得到的纳米溶液，针对铜、铅、汞的检测，在制备时加入氨基修饰的用于检测铜离子的核酸、氨基修饰的用于检测铅离子的核酸和氨基修饰的用于检测汞离子的核酸，利用席夫碱反应将核酸共价结合到磁性二氧化硅纳米粒子表面，不同的氨基化核酸的加入量分别是：1μm检测铜离子的核酸，1μm检测铅离子的核酸，1μm检测汞离子的核酸，再加入4ml含有150mmnano3的25mmph8.2的tris-醋酸缓冲溶液，反应12h后，用磁铁分离出核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针，用上述缓冲溶液清洗掉游离的核酸，分散上述tris-醋酸缓冲溶液，4℃的温度条件下避光保存。

s3、制备dna修饰的铂纳米探针，具体依次包括以下步骤：

(d1)取100mm氯铂酸溶液500μl，加入45ml超纯水，在80℃加热40min后，快速加入9ml0.2m抗坏血酸，在85℃继续加热30min，5000rpm5min用超纯水离心清洗几次，得到1mg/ml铂纳米粒子水溶液，4℃的温度条件下避光保存；

(d2)巯基化dna二硫键还原：tcep现用现配，针对铜、铅、汞不同体系，在还原时加入巯基修饰的用于检测铜离子的dna、巯基修饰的用于检测铅离子的dna和巯基修饰的用于检测汞离子的dna，加入量分别是：10μm检测铜离子的dna，1μm检测铅离子的dna，1μm检测汞离子的dna，按照摩尔比tcep:dna＝5：1，加入不同量的tcep溶液，再加入10mmph5.5醋酸缓冲溶液，在室温下避光反应1h；

(d3)对步骤(d1)中制备好的铂纳米粒子在85℃下加热10min，然后取0.1ml铂纳米粒子溶液，加入4ml超纯水，在铜、铅、汞不同体系加入步骤(d2)中还原后的dna，在4℃温度反应条件下反应10h后，在5000rpm离心5min，重复清洗几次dna修饰的铂纳米探针，配置在超纯水中，4℃的温度条件下避光保存。

s4、制备复合探针溶液，具体依次包括以下步骤：

取30μldna修饰的铂纳米探针溶液，加入0.1ml制备的核酸修饰的磁性二氧化硅纳米探针，加入4ml含有150mmnano3的25mmph8.2的tris-醋酸缓冲溶液。室温下摇床孵育4h后，用磁铁分离复合探针，再用缓冲溶液清洗多次复合探针，将制备好的复合探针分散在30μl上述缓冲溶液，4℃的温度条件下避光保存。

s5、实际样品检测方法，具体依次包括以下步骤：

(e1)建立标准曲线，在所述步骤s4中制备的30μl复合探针溶液中，加入不同浓度的分析物，在混匀仪上避光震荡30min。经磁铁分离后，移液枪取2μl清液，加入芯片的样品槽中，在试剂槽中加入2μl30％h2o2溶液。芯片上墨水柱指示通道内注满墨水。滑动芯片，使样品与h2o2溶液混合。10min后记录墨水柱前进的距离，分析物的浓度与墨水柱前进的距离呈一定曲线关系，利用orign软件拟合出标准曲线方程；

(e2)采集江水样，用20μm膜过滤。加入20μl水样，加入复合探针溶液中，在混匀仪上避光震荡30min。按照步骤(e1)操作，10min后记录墨水柱前进距离，在标准曲线上得到分析物的浓度。

如图1-3所示，一种可视化定量检测水中铜、铅、汞三种重金属离子的多元体积柱芯片的制备步骤如下：

(1)如图3(a)、图3(b)所示,利用autocad分别设计绘制玻璃芯片的上下层掩模；

(2)单个玻璃芯片的尺寸为75mm×50mm×1.5mm，用异丙醇和去离子水擦洗干净玻璃芯片，并用氮气吹干；

(3)氧等离子体处理玻璃片表面3min；

(4)将玻璃片放入玻璃存放盒，取1ml1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷于小烧杯内，与玻璃片同放在密闭的盒子，静置30min，挥发性的试剂将键合到玻璃芯片表面；

(5)将修饰好1ml1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷的玻璃芯片置于匀胶机上，避光条件下旋涂光刻胶spr220-7，低速300rpm/min，转5s；高速1000rpm/min，转40s；

(6)将旋涂好光刻胶的玻璃片放置在加热台上，在70℃烘胶3min，然后温度升高到100℃继续烘8min，自然冷却到室温；

(7)将掩模覆盖在烘胶过的玻璃片上，四角用胶带纸固定好，在光刻机上，紫外灯曝光100s后，去掉掩模。

(8)az400k显影液倒入结晶皿中，将曝光后的玻璃片放入显影液中，不停晃动显影液，芯片曝光的区域逐渐显影出来；

(9)用透明胶带缠住玻璃片边缘和背面，将芯片放到hf、nh4f和hno3混合溶液中，hf、nh4f和hno3的摩尔比为1:0.5:0.75，所述疏水化处理所采用的疏水试剂采用全氟辛基三氯硅烷，室温下刻蚀40min；

(10)刻蚀后，用去离子水清洗表面残留的刻蚀液，依次用丙酮，异丙醇，去离子水洗去残留的光刻胶，用氮气吹干；

(11)用胶将第一玻璃芯片1固定在玻璃芯片衬片上，用打孔机对芯片中的墨水进水孔13、墨水出水孔14、样品注入孔15、样品流出孔16、试剂注入孔17和试剂流出孔18的位置，进行打孔。打孔后，加入丙酮超声，洗去胶，将打好孔的芯片取出；

(12)再利用小型精雕机针对第一玻璃芯片1的墨水进水孔13、墨水出水孔14、样品注入孔15、样品流出孔16、试剂注入孔17和试剂流出孔18进行打孔。打完后，将第一玻璃芯片1用氧等离子体清洗3min，加3μl微升的全氟辛基三氯硅烷试剂到芯片上，滑动第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2，将试剂抹匀，在真空盒子内静置12h；

(13)如图3(c)、3(d)所示，用丙酮、异丙醇和去离子水清洗掉第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2表面的硅烷试剂，氮气吹干。取3μl二甲基硅油将第一玻璃芯片1和第二玻璃芯片2面对面组装起来，硅油可以增加芯片润滑，减少氧气泄漏。用移液枪将1％的氢氧化钠溶液加入样品和试剂槽中，增加此区域的亲水性。

本实施例中，可视化检测铜、铅、汞离子的多元体积柱芯片的操作说明：如图1所示，样品槽组用来储存样品，用移液枪从第一样品槽7、第二样品槽8或第三样品槽9的样品注入孔15注入样品，多余的样品会从样品流出孔16流出；试剂槽组用来储存h2o2溶液，用移液枪将试剂从试剂注入孔17注入，多余的h2o2液体会从试剂流出孔18流出；如图4所示，墨水指示通道3用来注满墨水，墨水从墨水进水孔13注入，从墨水出水孔14流出，墨水受产生的o2推动可以在连续的“s”型的墨水移动通道内移动，墨水移动通道上端和左右两侧的墨水移动距离标尺19用来指示墨水移动的距离；待墨水指示通道3、样品槽组和试剂槽组充满后，滑动第一玻璃芯片1，滑动后的多元体积柱芯片结构如图2所示，样品槽组与试剂槽组完全重合，墨水移动通道与试剂槽组连通，待测样品与h2o2混合后产生的o2经过通道可以推动墨水在墨水移动通道内移动，移动的距离可以通过通道上端和两侧的移动距离标尺记录。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。