本发明涉及猪瘟病毒检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
背景技术：
猪瘟(classicalswinefever，csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一种高发病率和高死亡率的烈性传染病，感染过程可分为急性、亚急性、慢性、迟发性等多种。csf急性病例多见于流行初期，主要表现为突然发病，皮肤、粘膜发绀，全身痉挛；初便秘，后腹泻。后期出现步态不稳，随后麻痹，倒地死亡。毒力较低的csfv毒株可引起亚急性csf或温和性csf，症状比较轻。妊娠母猪感染后出现“带毒母猪综合征”，发生流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪死亡，耐过的猪终身带毒。猪瘟在世界范围内流行，是动物卫生组织要求申报的动物传染病之一。
csfv为黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)成员，是有囊膜的单股正链rna病毒，基因组大小约1.23×104kb，仅含有一个大的开放读码框架(orf)。整个orf编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒npro蛋白和细胞的蛋白酶裂解，形成4个结构蛋白(c、e0、e1、e2)以及至少7个非结构蛋白(npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)。结构蛋白组装成熟的病毒粒子与病毒的感染和诱导机体的免疫应答反应有密切关系，而非结构蛋白则对病毒基因组复制、病毒粒子的组装成熟起调控作用。目前常用于检测猪瘟病毒的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和rt-pcr、荧光定量pcr。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较复杂；而rt-pcr、荧光定量pcr技术需要特殊的仪器设备(如pcr仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，对于在基层和现场检测有局限性。因此建立一种快速，敏感，特异的检测猪瘟病毒的方法是十分必要的。鉴于此，如何提供一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测是否感染猪瘟病毒的引物组和试剂盒是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中猪瘟病毒无法准确、及时、灵敏的进行甄别的技术问题，而提出一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：设计一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的环介导等温扩增引物组包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；所述的第一引物组包括引物p1和引物p2，所述的第二引物组包括引物p3和引物p4，所述的第二引物组引物p5和引物p6。
优选的，所述的引物p1的dna序列为：5’-atgcacgtagtcaatcgatc-3’；所述的引物p2的dna序列为：5’-attgcacagtcgcctacgta-3’；引物p3的dna序列为：5’-tcgaacgccctacgactgac-3’；引物p4的dna序列为：5’-actcgtacgatcgtaccgta-3’；引物p5的dna序列为：5’-ttacgactgccaatgcaggc-3’；引物p6的dna序列为：5’-ccgtacgtacaatgctgcaat-3’。
优选的，所述的试剂盒包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶，所述的反应浓缩液包括dna聚合酶,buffer,dntp,mgso4,betaine,荧光染料evagreen。
优选的，所述的试剂盒还包括阳性对照物和阴性对照物。
优选的，所述的阳性对照物为含有目的基因的大肠杆菌质粒dna片段的反应液；所述阴性对照物为不含有目的基因的大肠杆菌质粒dna片段的反应液。
优选的，所述的引物p1和引物p2的浓度为40nmol，引物p3和引物p4的浓度为5nmol、引物p5和引物p6的浓度为20nmol。
优选的，所述的环介导等温扩增引物组的体积为6μl，所述反应浓缩液的体积为15μl。
优选的，所述的环介导等温扩增引物组中引物p1、引物p2、引物p3、引物p4、引物p5和引物p6的体积均为1μl。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量pcr仪或恒温金属浴配合使用。
本发明提出的一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，有益效果在于：
(1)本发明提供了一种能够快速、准确地检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组，能够特异性识别dna序列上的6个独立区域，利用特异性聚合酶启动循环链置换反应，在基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状的dna混合物，用于后续的定性和定量分析；
(2)本发明还公开了一种含有所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒适合在实验室或其他地点进行快速筛查和检测，扩大了适用范围；
(3)本发明提出的试剂盒，简化了检测过程，降低了对操作人员的专业要求，使得非专业人员可以顺利完成检测工作；
(4)本发明试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在等温扩增荧光检测仪和定量pcr仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。
附图说明
图1为本发明实施例二的扩增曲线
图2为本发明实施例二的溶解曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明的一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的环介导等温扩增引物组包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；所述的第一引物组包括引物p1和引物p2，所述的第二引物组包括引物p3和引物p4，所述的第二引物组引物p5和引物p6。
优选的，所述的引物p1的dna序列为：5’-atgcacgtagtcaatcgatc-3’；所述的引物p2的dna序列为：5’-attgcacagtcgcctacgta-3’；引物p3的dna序列为：5’-tcgaacgccctacgactgac-3’；引物p4的dna序列为：5’-actcgtacgatcgtaccgta-3’；引物p5的dna序列为：5’-ttacgactgccaatgcaggc-3’；引物p6的dna序列为：5’-ccgtacgtacaatgctgcaat-3’。
优选的，所述的试剂盒包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶，所述的反应浓缩液包括dna聚合酶,buffer,dntp,mgso4,betaine,荧光染料evagreen。
优选的，所述的试剂盒还包括阳性对照物和阴性对照物。
优选的，所述的阳性对照物为含有目的基因的大肠杆菌质粒dna片段的反应液；所述阴性对照物为不含有目的基因的大肠杆菌质粒dna片段的反应液。
优选的，所述的引物p1和引物p2的浓度为40nmol，引物p3和引物p4的浓度为5nmol、引物p5和引物p6的浓度为20nmol。
优选的，所述的环介导等温扩增引物组的体积为6μl，所述反应浓缩液的体积为15μl。
优选的，所述的环介导等温扩增引物组中引物p1、引物p2、引物p3、引物p4、引物p5和引物p6的体积均为1μl。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量pcr仪或恒温金属浴配合使用。
实施例二
本实施例为实施例1所得到的试剂盒的准确性验证。
使用实施例1所得到的试剂盒，用感染猪瘟病毒的大肠杆菌作为样品、未感染猪瘟病毒的大肠杆菌作为阴性对照组、感染猪瘟病毒的幽门螺旋杆菌作为阳性对照组利用定量pcr仪分别检测。
参阅附图1所示，阴性对照组的扩增曲线没有出现明显s型曲线，则判定为阴性结果，样品和阳性对照组的扩增曲线为明显的s型曲线，判定为阳性结果。参阅附图2所示，样品和阳性对照组的溶解曲线峰型单一且较为尖锐，阴性对照组的溶解曲线峰型为平缓曲线，说明所述试剂盒能够检测猪瘟病毒。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。