本发明属于活性成分提取
技术领域：
，具体涉及一种plackett-burman设计和响应面法联用优化提取羊肚菌多糖的方法。
背景技术：
：羊肚菌(morchellaesculenta)是一种珍惜的野生食、药用蕈茵。由于肉质脆嫩，美味可口，含有人体所需的必需氨基酸，受到国内外消费者的喜爱。羊肚菌药用价值在我国的《新华本草纲要》和《本草纲目》等典籍均有报道。据记载，羊肚菌有助消化、益肠胃、化痰理气的功效，主要用于消化不良，痰多咳嗽等病症。现代发现，羊肚菌多糖有抗疲劳、抗肿瘤、抗菌活性等诸多作用。关于羊肚菌多糖提取工艺的报道主要集中在热水浸提法、酸提法、碱提法、微波萃取法、和超声波萃取法。文献《云南野生羊肚菌多糖的分离纯化与性质研究[d]:杨虎等，西南大学,2007.》用水提羊肚菌多糖发现，料液比1:50，提取时间2h，提取次数为3次,温度95℃时多糖的得率达到4.96%。据目前国内外文献报道，羊肚菌菌丝体的多糖提取通常采用热水浸提和酶法浸提。热水浸提提取率较低，而加酶提取不仅生产成本高，同时也给产物的分离带来困难。有研究表明，食用菌菌丝胞壁是由几丁质小纤维构成的网状结构赋予细胞壁以硬性，活性多糖存在于菌丝胞壁的基质内。菌丝胞壁的网状结构使多糖的提取时间过长或提取不完全。超声波的高频率及其产生的“空化效应”，使菌丝胞壁的网状结构被破坏，从而加快了多糖从胞壁中的释放。超声波提取具有时间短、效率高、提取率高等特点，同时可防止提取物在长时间和高温条件下发生降解、褪色等变化。技术实现要素：本发明为了解决目前羊肚菌多糖提取率较低，或者生产成本高，产物分离困难等问题，提供了一种plackett-burman设计和响应面法联用优化提取羊肚菌多糖的方法。本发明由如下技术方案实现的：一种plackett-burman设计和响应面法联用优化提取羊肚菌多糖的方法，利用minitab17软件，根据plackett-burman实验设计提取羊肚菌多糖的料液比、酶用量、酶解ph值、酶解时间、酶解温度，超声功率、超声温度，超声时间，在单因素实验的基础上，以羊肚菌多糖得率作为响应值，对料液比、酶用量、酶解时间、酶解ph值、超声时间5个影响因素进行评价，筛选出主效应因子，将主效应因子作为响应面设计的因素，建立响应值与各因素之间的数学模型，依据模型预测羊肚菌多糖的理论得率，然后确定羊肚菌多糖提取的最佳工艺参数，用超声波辅助提取羊肚菌多糖。具体包括以下步骤：（1）原料处理：挑选羊肚菌子实体，清洗、干燥粉碎后过80目筛；（2）单因素实验：控制酶解温度为50℃、超声功率240w、超声温度50℃，以羊肚菌多糖得率为响应值，利用minitab17软件，根据plackett-burman实验设计提取羊肚菌多糖的料液比、酶用量、酶解ph值、酶解时间和超声时间，分别考察料液比为1:10、1:15、1:20、1:25g/ml，酶用量为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%，酶解ph为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8，酶解时间为20、40、60、80、100min，超声时间为10、20、30、40、50min条件下对羊肚菌多糖提取效果的影响；（3）plackett-burman实验：在单因素实验的基础上，以羊肚菌多糖得率作为响应值，对5个影响因素进行评价，筛选出主效应因子；（4）响应面实验设计：依据plackett-burman实验结果，选主效应因子作为响应面设计的因素，建立响应值与各因素之间的数学模型，依据模型预测羊肚菌多糖的理论得率，确定羊肚菌多糖提取的最佳工艺参数；（5）根据优化的最佳工艺参数条件，采用纤维素酶解与超声波辅助提取羊肚菌多糖。纤维素酶酶解温度为50℃，过筛后的羊肚菌子实体粉末与蒸馏水按照料液比为1:10-1:25g/ml混合，酶用量为羊肚菌子实体粉末质量的0.2-1.0%，酶解ph值为3.2-4.8，酶解时间为20-100min。超声波提取的超声波功率为240w，超声温度为50℃，超声时间为10-50min。超声处理后进行灭酶处理：90℃灭酶30min后4500r/min离心15min，提取上清液，用体积为上清液体积3倍的95%乙醇醇沉过夜，然后4500r/min离心15min，沉淀用蒸馏水复溶，定容至100ml,稀释25倍，测定吸光度，计算羊肚菌多糖得率。最优工艺参数为：料液比为1∶22g/ml，酶用量为0.8%、酶解ph为4.0、超声时间19min。本发明通过单因素实验、plackett－burman实验设计以及在此基础上三因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素之间的数学模型，依此模型预测了羊肚菌多糖的理论得率，并结合实际操作，确定羊肚菌多糖提取的最佳工艺参数：料液比1∶22(g/ml)、酶解ph4.0、超声时间19min。在此条件下多糖理论得率为7.83%、实际得率为7.79%、误差为0.5%，表明plackett－burman设计与响应面分析方法(rsm)相结合可以快速、有效地从众多影响羊肚菌多糖得率的因素中筛选出比较重要的影响因素并实现其水平优化，优化结果与实际多糖得率吻合较好。同时也表明超声波辅助纤维素酶提取方法简单、效率高，可作为羊肚菌多糖的提取工艺。本发明首次将超声波法与酶法结合，利用响应面分析法对羊肚菌多糖提取工艺进行优化，并建立了二次多项回归模型。酶法提取反应条件温和、时间短、试剂消耗少，适于工业化大规模生产。为羊肚菌多糖抗相关性质的研究奠定一定的基础。采用plackett-burman实验设计和响应面分析法对羊肚菌多糖的超声协同酶法提取工艺进行优化，提高羊肚菌子实体多糖的得率，为羊肚菌资源的开发利用提供一定的理论依据。附图说明图1为料液比对羊肚菌多糖得率的影响结果图；图2为酶用量对羊肚菌多糖得率的影响结果图；图3为酶解时间对羊肚菌多糖得率的影响结果图；图4为酶解ph值对羊肚菌多糖得率的影响结果图；图5为超声时间对羊肚菌多糖得率的影响结果图；图6为各因子交互作用的响应面分析图，图中：a为料液比与酶解ph值之间交互作用响应面分析图；b为料液比与超声时间之间交互作用响应面分析图；c为超声时间与酶解ph值之间交互作用响应面分析图。具体实施方式实施例1：一种plackett-burman设计和响应面法联用优化提取羊肚菌多糖的方法，利用minitab17软件，根据plackett-burman实验设计提取羊肚菌多糖的料液比、酶用量、酶解ph值、酶解时间、酶解温度，超声功率、超声温度，超声时间，在单因素实验的基础上，以羊肚菌多糖得率作为响应值，对料液比、酶用量、酶解时间、酶解ph值、超声时间5个影响因素进行评价，筛选出主效应因子，将主效应因子作为响应面设计的因素，建立响应值与各因素之间的数学模型，依据模型预测羊肚菌多糖的理论得率，然后确定羊肚菌多糖提取的最佳工艺参数，用超声波辅助提取羊肚菌多糖。材料与仪器：羊肚菌：购于山西省安泽县，野生菌；纤维素酶(酶活力3u/mg)，购于sigma公司；葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、柠檬酸钠等均为分析纯。js30-230型多功能搅拌机：浙江苏泊尔股份有限公司；al204型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；sb-5200dt型超声波清洗仪：宁波生物科技股份有限公司；hrhs24电热恒温水浴锅：青岛海尔医用低温科技有限公司；shb-iii循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；sp-2000uv型紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；sc-3614低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；hhs21-4电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。具体包括以下步骤：（1）原料处理：挑选羊肚菌子实体，清洗、干燥粉碎后过80目筛；（2）单因素实验：准确称取1.00g羊肚菌子实体粉末，固定提取条件为：酶解温度50℃、超声功率240w、超声温度50℃，以羊肚菌多糖得率为响应值，利用minitab17软件，根据plackett-burman实验设计提取羊肚菌多糖的料液比、酶用量、酶解ph值、酶解时间和超声时间，分别考察料液比为1:10、1:15、1:20、1:25g/ml，酶用量为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%，酶解ph为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8，酶解时间为20、40、60、80、100min，超声时间为10、20、30、40、50min条件下对羊肚菌多糖提取效果的影响。羊肚菌多糖的测定：标准曲线的制备：采用苯酚-硫酸法：以葡萄糖(0.1mg/ml)作为标准品绘制标准曲线(该实验测定时的最大吸收波长为490nm，标准曲线方程:c=0.0733a-0.0014，式中c为葡萄糖浓度，a为吸光度，r2=0.9944。样品多糖含量的测定：吸取稀释后的样品2ml于比色管中，以2ml蒸馏水作为对照，用苯酚-硫酸法490nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算多糖含量，从而得各实验组羊肚菌多糖得率。w(%)=(c×v×n×10-3/m)×100；式中，w为多糖得率(%)；c为多糖浓度(mg/ml)；v为定容体积(ml)；n为稀释倍数；m为样品质量(g)；10-3为换算单位。纤维素酶作用的最适温度为45-65℃，预实验做45、50、55、60、65℃温度梯度，预实验检测结果显示50℃时多糖得率高，但与其他温度相差不多，因此酶解温度不作为影响因素考虑，控制酶解温度为50℃。sb-5200dt型超声波清洗仪的超声功率为240w，在该超声波清洗仪中超声处理，超声过程中温度控制为酶解温度。料液比对多糖得率的影响：如图1所示，多糖得率随着料液比的增加而先增加后降低。当料液比小于1：20(g/ml)时，多糖得率增加，超过1:20(g/ml)时，多糖得率降低。这可能是由于料液比较小时，物料中的多糖粘度大，不能充分溶出，当达到适当的料液比时，多糖几乎完全溶出，而继续增加料液比，会使多糖得率下降。因此，选择1∶20(g/ml)为最佳料液比。酶用量对多糖得率的影响：如图2所示，酶用量对多糖得率有显著影响。当酶用量从0.2%增至0.8%时，多糖得率增加，这可能是由于增大酶量有利于酶与底物接触，细胞壁被破坏，溶解出大量多糖。此后再增加酶用量，多糖得率增幅不明显，这可能是由于多糖发生降解。因此选择0.8%为最佳酶用量。酶解时间对多糖得率的影响：如图3所示，随酶解时间的增加，多糖得率先增加后降低。这可能是因为酶解时间过长会导致多糖结构发生变化，从提高生产效率的角度看，选择60min为最佳酶解时间。酶解ph对多糖得率的影响：如图4所示，多糖得率随ph的增加先升高后下降。在ph为4.0时，多糖得率达到最大值6.74%。这可能是因为酸碱度影响酶的催化速度与酶分子的稳定性。因此ph值只有在特定酸碱度值的时候，酶的活性才能达到最大，在此范围内纤维素具有较强的活力，可加速羊肚菌细胞壁中纤维素的降解，使多糖溶出、得率增加。因此选择4.0为最适酶解ph。超声时间对多糖得率的影响：如图5所示，羊肚菌多糖得率随着超声时间的延长而增加，当超声时间大于20min时，多糖得率下降。这说明多糖提取过程与超声波处理时间密切相关，超声波处理时间短，多糖溶出的不充分；超声时间太长可能会使多糖降解。因此，选择20min为最佳超声时间。（3）plackett-burman实验：plackett-burman试验设计是一种两水平的试验设计方法，用于从多个影响因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。在单因素实验的基础上，以羊肚菌多糖得率作为响应值，对5个影响因素进行评价，筛选出主效应因子，每个因素选两个水平，共12组实验。实验因素及水平取值见表1。表1plackett-burman实验因素及水平plackett-burman实验选用n=12的pb实验设计模块，对料液比（x1）、酶用量（x2）、酶解时间（x3）、酶解ph（x4）、超声时间（x5）5个因素进行评价，筛选出对羊肚菌多糖得率影响较为显著的几个因素。实验设计及结果见表2，经minitab17软件处理得到显著性检验结果见表3。可以看出，料液比、酶解ph、超声时间3个因素为极显著影响因素(p＜0.01)，作为主效应因素进行后续的响应面优化。表2plackett-burman实验设计及结果表3plackett-burman实验统计分析注:*在0.05水平显著;**在0.01水平显著；表6同。（4）响应面实验设计：依据plackett-burman实验结果，选取料液比(a)、酶解ph(b)和超声时间(c)为自变量，以多糖得率(y)为响应值，利用design-expert8.0.6软件根据box-behnken原理进行响应面设计，优化羊肚菌多糖提取工艺，以-1、0、1分别代表自变量的三个水平，实验因素及水平编码如表4所示。实验设计方案及结果见表5。表4响应面设计的因素和水平表5响应面实验设计及结果实验号abcy得率(%)11-106.822-10-14.4530-1-14.6740007.5150-114.0560007.7770008.0880007.8190007.381010-16.4711-1014.6412-1-105.65130114.2114-1105.85151105.881601-15.88171014.87回归模型的建立及方差分析：每个组合重复试验3次，取其平均值作为羊肚菌多糖得率的结果。对表5试验结果进行多元回归拟合，得羊肚菌多糖得率的二次多项式回归模型：多糖得率=7.71+0.43a+0.079b-0.46c-0.29ab-0.45ac-0.26bc-0.63a2-1.03b2-1.97c2。回归模型方差分析结果见表6。回归模型极显著(p＜0.01)，模型失拟项不显著(p=0.1276＞0.05)；回归方程总决定系数r2=97.46%，表明该模型对实验拟合度较好，可用该模型对实验结果进行预测。从回归模型系数显著性检验结果可得知：a、c、a2、b2、c2的p值均小于0.01，说明对提取羊肚菌多糖得率的影响极显著。对提取羊肚菌多糖得率的影响的主次因素依次为超声时间>料液比>酶解ph。表6回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验响应面的曲面分析：图6直观地给出了各个因子交互作用的响应面分析图。从响应面中可以确定最佳因素的水平范围。响应面的坡度体现因素对多糖得率影响的强弱水平，等高线图的形状反映两个变量间的交互作用是否显著，坡度越大说明该因素对多糖得率影响越强，等高线图为椭圆形说明两因素之间交互作用显著，圆形说明交互作用不显著。由图可以看出在实验因素水平范围内，存在羊肚菌多糖的最大得率。由图6a可知，酶解ph和料液比的交互作用对羊肚菌多糖得率影响显著，酶解ph3.6~4.4、料液比1:15~1:25g/ml范围内，多糖得率先增大后减小。ph4.0、料液比1:20g/ml附近值对羊肚菌多糖得率有重要影响。由图6b可以看出，料液比和超声时间对羊肚菌多糖得率影响显著，料液比1:15~1:25g/ml、超声时间10~30min，多糖得率先增大后减小。料液比1:20g/ml、超声时间20min附近值对羊肚菌多糖得率有重要影响。由图6c可得，酶解ph和超声时间的交互作用羊肚菌多糖得率影响显著，酶解ph3.6~4.4、超声时间10~30min时，多糖得率先增大后减小。ph4.0、超声时间20min附近值多糖得率最大。确定最优值和回归模型的验证实验：通过对回归模型的分析，可以确定羊肚菌多糖提取的最佳条件为：料液比1∶22.01(g/ml)、酶解ph3.97、超声时间18.96min、此时羊肚菌多糖得率为7.83%。考虑到实际操作的方便性，将羊肚菌多糖的浸提工艺条件修正为：固液比1∶22(g/ml)、酶解ph4.0、超声时间19min。在此条件下，羊肚菌多糖得率为7.79%，表明响应面分析的优化结果与实际值相吻合，具有一定的实用价值。通过单因素实验、plackett－burman实验设计以及在此基础上三因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素之间的数学模型，依此模型预测了羊肚菌多糖的理论得率，并结合实际操作，确定羊肚菌多糖提取的最佳工艺参数：料液比1∶22(g/ml)、酶解ph4.0、超声时间19min。在此条件下多糖理论得率为7.83%、实际得率为7.79%、误差为0.5%，表明plackett－burman设计与响应面分析方法(rsm)相结合可以快速、有效地从众多影响羊肚菌多糖得率的因素中筛选出比较重要的影响因素并实现其水平优化，优化结果与实际多糖得率吻合较好。同时也表明超声波辅助纤维素酶提取方法简单、效率高，可作为羊肚菌多糖的提取工艺。（5）根据优化的最佳工艺参数条件，采用纤维素酶解与超声波辅助提取羊肚菌多糖。控制料液比为1∶22g/ml，酶用量为0.8%、酶解ph为4.0、超声时间19min。本发明首次将超声波法与酶法结合，利用响应面分析法对羊肚菌多糖提取工艺进行优化，并建立了二次多项回归模型。酶法提取反应条件温和、时间短、试剂消耗少，适于工业化大规模生产。本试验将为羊肚菌多糖抗相关性质的研究奠定一定的基础。当前第1页12