本发明涉及基因工程领域，具体地涉及烟粉虱med隐种高温耐受相关基因基因btdnmt3及其应用。
背景技术：
烟粉虱(bemisiatabaci(gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，又称棉粉虱或甘薯粉虱。
烟粉虱的最适发育温度为26～30℃，发育临界温度在10.8～12.5℃之间，致死高温区在37～42℃之间。17℃和35℃是烟粉虱正常生长发育的最低和最高的温度极限。较强的温度逆境适应能力是烟粉虱在世界范围内广泛分布的原因。随着温室效应的增加，全球气温正逐年增高，烟粉虱较强的温度逆境适应能力使其能逐渐扩大保护地面积，这为其抵御温度逆境、延续种群提供给了场所。
随着全球温度的变化，烟粉虱med隐种在不同地理环境下的成功适应，已经广泛引起了人们对其入侵机制的理论探讨，对于其温度适应性的分子机制更是近几年来的研究热点之一。对烟粉虱进行热激选择的实验中发现，2代内其存活率显著提高，表明存活能力的快速提高是其在恶劣环境生存的重要策略。这种短期内生物体对环境变异产生的响应机制与表观遗传有关。表观遗传过程会增加有机体对非温度胁迫和其它环境挑战的进化潜能的响应，这与全球环境变暖的背景是高度相关的。
rna干扰(rnainterference,rnai)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mrna存在同源互补序列的双链rna(doublestrandrna,dsrna)导入细胞后能特异性地降解该mrna，从而产生相应的功能表型缺失。rnai广泛存在于生物界，通过rnai技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。由于烟粉虱个体体积小，注射dsrna不易操作、费时等限制，而饲喂dsrna具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3。
本发明的再一目的是提供上述烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3的应用。
根据本发明的烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3，该基因cdna全长核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。
根据本发明的具体实施方式，首次克隆出烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3，实验分析证实：btdnmt3基因定位在细胞核内，编码蛋白的氨基酸的数目为653个。meme分析发现，btdnmt3有6个保守的motif。对得到的motif进一步分析，发现有6个motif注释为dna甲基转移酶高度保守位点，分别为motifⅰ、ⅳ、ⅵ、ⅷ、ⅸ、ⅹ。
对btdnmt3进行不同组织的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在头部、胸部和腹部中均有表达，且在腹部显著高表达。
对btdnmt3进行不同发育阶段的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在卵期、一龄、二龄、三龄、四龄、伪蛹、成虫中具有表达。成虫之前，在卵期高表达，后表达量逐渐降低，到成虫再次高表达。
本发明提供了上述烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3的应用。对烟粉虱med隐种进行rnai，结果显示，饲喂dsbtdnmt3的med隐种成虫的高温耐击倒时间显著降低。说明btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中的温度耐受性中起关键作用。上述烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3可用于破坏烟粉虱温度耐受性，进而用于防治烟粉虱的应用。
本发明首次从烟粉虱med隐种中克隆出高温耐受相关基因btdnmt3。明确了高温耐受相关基因在烟粉虱med隐种中的表达的时间与空间特征。该基因的表达直接降低了med隐种对高温耐受性的能力。所获得的结果为明确高温耐受相关基因在烟粉虱med温度耐受性中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱med隐种的温度耐受性机理与dna甲基化机制的关系和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
附图说明
图1显示了btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中组织特异性分析；
图2显示了btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中不同发育历期分析；
图3显示了btdnmt3基因的dsrna处理对烟粉虱med隐种成虫耐热性的影响：比较饲喂btdnmt3基因dsrna、dsegfp和饲喂10％蔗糖溶液3h后烟粉虱med隐种成虫高温击倒时间。
具体实施方式
实施例1：烟粉虱med隐种btdnmt3基因全长cdna序列克隆
1、总rna提取及cdna合成
(1)从烟粉虱成虫提取总rna
分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱成虫200头放入1.5ml的离心管，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后提取rna，-80℃保存以备用。
(2)根据transgen公司的反转录试剂盒(superscriptfirst-strandsynthesissystem)说明，反转录合成cdna：
2、pcr扩增烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段
(1)设计pcr扩增烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段引物：
btdnmt3-f：ctactgctaaactccattcgc
btdnmt3-r：ctctgaaacacggtagtccc
(2)以cdna为模板，利用(1)所设引物，pcr扩增烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段。
(3)回收目的片段，并测序；
3、烟粉虱med隐种btdnmt3基因5’race和3’race获得
(1)根据步骤2所获得的烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段序列，设计5’race和3’race特异性引物，pcr扩增btdnmt3基因的5’和3’端序列：
5’raceinnerprimer:ggaacctctgaaacacggtagtccccaa
5’raceouterprimer:ttgtgacacgcagtgacttcagtgataggt
3’raceinnerprimer:taaccaccaatccaaattccttgcggc
3’raceouterprimer:tggtttggggactaccgtgtttcagagg
(2)采用smartertmracecdnaamplificationkit(clonetch)试剂盒，获得btdnmt3基因的cdna序列全长,得到btdnmt3基因4512bp序列，所得的基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，包含653个核苷酸，该基因所编码的酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。
实施例2：btdnmt3基因的表达特性分析
一、在烟粉虱med隐种中组织特异性分析
1、提取不同组织部位rna及cdna合成：
选取初羽化的med隐种成虫，在显微镜下进行解剖，分别搜集头部、胸部、腹部的组织。总共需要成虫800头。将搜集的样本于液氮中冷冻3分钟后-80℃保存。按照实例1的方法提取rna并反转录成cdna。
2、荧光定量pcr检测不同组织表达量：
(1)设计荧光定量pcr的btdnmt3基因和β-tublin内参基因的引物：
qbtdnmt3-f:ggactaccgtgtttcagag
qbtdnmt3-r:catgtgcaaaggaatactagata
qβ-tublin-f：ttcatggttgataacgaagc
qβ-tublin-r：gcaccaagttagtctggaat
(2)反应体系为20μl：2×transstarttmgreenqpcr10.0μl、roa0.4μl、cdna模板1.0μl、primer-f0.3μl、primer-r0.3μl、ddh2o8.0μl。
反应条件：94℃30s；95℃5s,53℃30s,72℃30s,0个循环。
3、数据分析
用2-δδct方法(livak&schmittgen,2001)计算基因相对表达量。采用spss16.0统计软件分析。表达量的比较采用fisher’sleastsignificantdifference(平均数±标准误(means±se)表示数据，p<0.05。
如图1显示，对btdnmt3进行不同组织的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在头部、胸部和腹部中均有表达，且在腹部显著高表达。
二、btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中不同发育历期分析
1、提取不同发育历期rna及cdna合成：
在显微镜分别搜集不同发育历期的虫态，收集量如下：卵(>1500粒)、一龄和二龄(>1000头)、三龄和四龄(>600粒)、伪蛹(>400头)和成虫(>200头)。将搜集的样本于液氮中冷冻3分钟后-80℃保存。按照实例1的方法提取rna并反转录成cdna。
2、荧光定量pcr检测不同发育历期的表达量
如图2显示，对btdnmt3进行不同发育阶段的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在卵期、一龄、二龄、三龄、四龄、伪蛹、成虫中具有表达。成虫之前，在卵期高表达，后表达量逐渐降低，到成虫再次高表达。
三、btdnmt3基因的dsrna处理对烟粉虱med隐种耐热性的影响
1、dsrna模板的制备：
(1)设计合成加上t7启动子(下划线所示序列)的引物序列：
t7+btdnmt3-f：
5’-taatacgactcactatagggagaggactaccgtgtttcagag-3’
btdnmt3-r：5’-catgtgcaaaggaatactagata-3’。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(2)总rna提取及cdna合成：同实施例1。
(3)t7引物pcr扩增、产物纯化，纯化所得的pcr产物即为合成dsrna的模板。
2、dsrna的合成与纯化
使用
3、dsrna饲喂
parafilm膜预先用depc水处理以去除rna酶。在浓度为10％的蔗糖液中加入dsrna，浓度为0.3～0.5μg/μl。根据实验需求，对parafilm膜夹营养液法做了相应的改进：取初羽化烟粉虱成虫约200头，放入两端通透的玻璃管中，用双层parafilm覆盖玻璃管上端，在两膜之间加入浓度为10％的蔗糖溶液200μl，并加入dsrna，并使其终浓度为0.3-0.5μg/μl，玻璃管下端用纱布覆上，保持通风透气。玻璃管周围及下端用黑色塑料包裹，使烟粉虱向顶端paraflim膜聚集更好的取食dsrna，将装置放入人工气候箱，温度26±0.5℃，24h光照，相对湿度为60-70％，饲喂3hbtdnmt3基因的dsrna后，将烟粉虱收集于指型管中，放入预热的高温水浴锅进行热击倒，并开始记录至烟粉虱不能直立站立的时间，处理温度为45℃。以饲喂dsegfp且灭菌处理过的10％的蔗糖溶液的烟粉虱作为阳性对照，和不含dsrna且灭菌处理过的10％的蔗糖溶液的烟粉虱作为阴性对照，每组3个重复。
利用spss16.0统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱med隐种高温击倒时间，结果如图3所示，饲喂btdnmt3基因dsrna的烟粉虱med隐种的击倒时间显著低于饲喂dsegfp组和蔗糖组的击倒时间(p<0.05)；同时在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)blast显示，所饲喂的靶序列片度为btdnmt3基因特有的序列，由此确保了干扰效果为烟粉虱med隐种的目的btdnmt3基因所产生，因此，本发明说明btdnmt3基因在烟粉虱med隐种v性中起着关键作用。
本发明从烟粉虱med隐种中克隆到btdnmt3基因的cdna，荧光定量pcr显示btdnmt3基因在med隐种不同发育历期均有表达，且在成虫期显著高表达，成虫中主要在腹部高表达；最后通过饲喂btdnmt3基因dsrna，进而导致烟粉虱med隐种成虫的高温击倒时间显著减少。根据本发明的具体实施方式，试验结果明确了btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中的表达时间与空间特征及该基因在med隐种中温度耐受性起关键作用。本发明为进一步明确btdnmt3基因在烟粉虱med隐种中温度耐受性的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱med隐种的温度适应机理与dna甲基化机制的关系和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3及其应用
<150>2017103873075
<151>2017-05-27
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4512
<212>dna
<213>烟粉虱(bemisiatabaci)
<400>1
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tcaacgcagagtacatgggattgttgatgttgcacttttcagtctttagtgtgaaaaggt180
gaggtttctgaacgatttgcccttaattaatgtgtttaaaattagtttttacgcaattat240
gaagtattagaatcactcttgagtccgttattttaccctttttcctttttatccttccgt300
tttctgaaatttactcttcaagtatggccatctggctaatttgagaagctgcacagtggc360
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ttatttttactgctttaacagtttcaaatttctctaacttaggtagaaaaaaaaaaaaaa4500
aaaaaaaaaaaa4512
<210>2
<211>653
<212>prt
<213>烟粉虱(bemisiatabaci)
<400>2
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