本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法。
背景技术：
mirna是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参与基因调控。mirna主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的mrna或抑制不完全配对的mrna翻译，具有非常重要的生物学作用。
mirna是在细胞核内dna聚合酶ⅱ作用下由dna转录成为初级mirna(pri-mirna)。mirna在核内酶rnaseⅲ-drosha的作用下加工剪切为六七十个核苷酸序列的发夹结构前体pre-mirna，然后再依赖rna的核转运受体家族成员输出蛋白exportin-5的作用下转运到胞浆。在胞浆rnaseⅲdicer酶作用下二次加工为单链的成熟mirna，与rna诱导沉默复合物结合形成risc，识别靶mrna后抑制其翻译或通过去腺苷酸化和脱帽作用致使mrna降解。对mirna进行tud(toughdecoy)处理得到tudmirna，通常可以提高mirna的抑制效果，但是实际应用中，由于tudmirna的结构较复杂，使表达tudmirna的重组载体构建难度较大。
通过mirna靶基因预测软件查找能与set基因3’-utr互补结合的mirnas，包括mirna-23a，mirna-21,mirna-199b,mirna-20a,mirna-29b，mirna-194,mirna-221,mirna-129等。中国专利申请cn105925613a公开了一种促进肝细胞mir-199b高表达的慢病毒表达载体及其构建方法，通过将含有绿色荧光基因的pri-mirna-199b序列产物与pcdh-cmv-mcs-ef1-puro病毒载体连接得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，可在肝细胞中持续、高效、稳定地提高mirna-199b表达。
通过调节mirna-199b表达，可能在制备治疗mirna-199b表达异常相关疾病药物的开发中起到作用，但现有技术尚可稳定低表达mirna-199b的重组载体。因此，提供一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法，从可能影响set基因表达的众多mirnas中筛选出mirna-199b，通过tud处理得到tudmirna-199b，引进hindiii和bglii特异性酶切位点后与plvx-shrna2表达载体重组得到tudmirna-199b重组质粒，再经hindiii和bamhi限制性内切酶进行双酶切后，与plvx-shrna2-puro病毒载体连接，得到可稳定低表达mir-199b的重组慢病毒表达载体，具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地抑制mirna-199b表达，实现稳定低表达mirna-199b，进而对set基因表达起到调控作用。
本发明提供一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体，包括plvx-shrna2-puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmirna-199b重组质粒；所述多克隆位点序列包括hindiii酶切位点和bamhi酶切位点，所述tudmirna-199b重组质粒正向插入所述多克隆位点序列中。
优选地，所述tudmirna-199b重组质粒包括plvx-shrna2表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmirna-199b序列；所述多克隆位点包括hindiii酶切位点和bglii酶切位点，所述tudmirna-199b序列正向插入所述多克隆位点序列中。
更优选地，所述tudmirna-199b序列为：ggatccggtggcgctaggatcatcaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagtattctggtcacagaatacaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagatgatcctagcgccaccttttttgaattc，即seqidno：1。
同时，本发明还提供一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：
s1：tudmirna-199b序列的设计：通过mirbase库找到与set基因关联的mirna-199b基因的反向互补序列，并引进hindiii和bglii特异性酶切位点，设计tudmirna-199b序列为：ggatccggtggcgctaggatcatcaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagtattctggtcacagaatacaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagatgatcctagcgccaccttttttgaattc，即seqidno：1；
s2：合成得到tudmirna-199b序列；
s3：tudmirna-199b重组质粒的获得：plvx-shrna2表达载体和步骤s2得到的tudmirna-199b序列分别经hindiii和bglii限制性内切酶双酶切后，t4dna连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素lb培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行pcr初步鉴定，将初步鉴定结果说明tudmirna-199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养并抽提，得到含tudmirna-199b序列的tudmirna-199b重组质粒；
s4：肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体的构建：将plvx-shrna2-puro病毒载体、步骤s3获得的含tudmirna-199b序列的tudmirna-199b重组质粒分别用hindiii和bamhi限制性内切酶进行双酶切后，t4dna连接酶连接，得到肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体。
优选地，所述肝细胞为hl-7702细胞，所述感受态大肠杆菌为jm109。
本发明提供的肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体可能在制备治疗set基因或mir-199b基因表达异常相关疾病的药物中起到重要作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明从可能影响set基因表达的众多mirnas中筛选出mirna-199b，通过tud处理得到tudmirna-199b，引进hindiii和bglii特异性酶切位点后与plvx-shrna2表达载体重组得到tudmirna-199b重组质粒，再经hindiii和bamhi限制性内切酶进行双酶切后，与plvx-shrna2-puro病毒载体连接，得到可稳定低表达mir-199b的重组慢病毒表达载体，具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地抑制mirna-199b表达，实现稳定低表达mirna-199b，进而对set基因表达起到调控作用。本发明还提供了肝细胞mirna-199b低表达的慢病毒表达载体的构建方法，稳定性好，效率高且成本较低。
附图说明
图1本发明实施例二中双酶切质粒鉴定凝胶电泳图。
图2plvx-shrna2表达载体的谱图。
图3本发明实施例二中tudmirna-199b重组质粒的部分测序结果图。
图4本发明实施例五中实时荧光定量pcr检测mir-199b的相对表达结果图。
图5本发明实施例五中实时荧光定量pcr检测mir-199b靶基因set的相对表达结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中所用到的材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到，例如：hl-7702细胞购自中国科学院上海细胞库，plvx-shrna2表达载体购自美国clontech公司，plvx-shrna2-puro病毒载体(由plvx-shrna2表达载体改建得到)购自深圳市博奥康生物科技有限公司，endo-freeplasmidmaxikit购自美国omega公司，病毒包装辅助试剂盒购自日本takara公司，t4dna连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例一tudmirna-199b序列
通过mirbase库找到与set基因关联的mirna-199b基因的反向互补序列tudmirna-199b，并引进hindiii和bglii特异性酶切位点，设计tudmirna-199b序列为：ggatccggtggcgctaggatcatcaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagtattctggtcacagaatacaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagatgatcctagcgccaccttttttgaattc，即seqidno：1，序列交由上海生工生物公司合成得到。
实施例二tudmirna-199b重组质粒的获得
将plvx-shrna2表达载体(谱图如图2所示)和实施例一获得的tudmirna-199b序列分别经hindiii和bglii限制性内切酶双酶切后，t4dna连接酶连接得到连接产物。将该连接产物转化到感受态大肠杆菌jm109中，均匀涂布到含氨苄青霉素lb培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行pcr初步鉴定，pcr扩增后的凝胶电泳图如图1所示，结果说明菌落pcr鉴定结果为阳性，可用于挑取质粒进行扩大培养。将初步鉴定结果说明tudmirna-199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，部分测序结果图如图2所示，与预期相符。将测序鉴定正确的大肠杆菌培养，并使用endo-freeplasmidmaxikit进行抽提，得到含tudmirna-199b序列的tudmirna-199b重组质粒。
实施例三肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体
将plvx-shrna2-puro病毒载体、实施例二获得的含tudmirna-199b序列的tudmirna-199b重组质粒分别用hindiii和bamhi限制性内切酶进行双酶切后，t4dna连接酶连接，得到连接产物。将该连接产物转化到感受态大肠杆菌jm109中，均匀涂布到含氨苄青霉素lb培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养，并使用endo-freeplasmidmaxikit进行抽提，得到肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体。
实施例四转染肝细胞mirna-199b低表达的慢病毒表达载体进行病毒包装
培养293t细胞，取实施例三抽提的肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体转染293t细胞，按照病毒包装辅助试剂盒操作说明书进行操作，48h后收集tudmirna-199b重组病毒上清，5000g离心10min后取上清，计算出病毒的滴度为3.4x106ifu。
实施例五肝细胞mirna-199b低表达的慢病毒表达载体病毒包装后的上清感染效果的检测
tudmirna-199b重组病毒上清感染hl-7702肝细胞后，将感染成功的肝细胞和未感染的正常肝细胞培养2个月后的总rna分别提取后，进行实时荧光定量pcr检测mir-199b的相对表达情况，结果如图4所示，con指未感染的对照组。从图4可知，tudmirna-199b重组病毒感染hl-7702肝细胞后的mir-199b的相对表达量远远低于对照组的相对表达量。
进一步对set的相对表达情况进行检测，结果如图5所示。从图5可知，tudmirna-199b重组病毒感染hl-7702肝细胞后的set的相对表达量远远高于对照组的相对表达量。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110>深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）
<120>一种肝细胞mir-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>140
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>1
ggatccggtggcgctaggatcatcaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagta60
ttctggtcacagaatacaaccccagtgtttagaatctctatctgttccaagatgatccta120
gcgccaccttttttgaattc140