本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种将tlr4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法。
背景技术：
脓毒症是危重患者死亡的首要原因，其发病率在日益增加，研究指出在过去十年中，住院期间重症脓毒症发生率几乎增长了一倍，相应的这也大大提高了其死亡率升高的风险性。脓毒症可导致多器官功能衰竭，如急性肾损伤。就危重患者而言，脓毒症成为目前aki发生的首要原因，aki常使脓毒症或感染性体克的病情复杂化，所谓的脓毒症aki与其死亡的风险增加和住院时间延长存在独立相关性。尽管在积极抗感染治疗、重要脏器功能支持和复苏手段方面己经取得一定的进步，但脓毒症aki的病死率仍居高不下(>50％)。其中最主要的原因是人们对aki及aki的发病机制目前尚不十分清楚，对肾脏的组织病理学不够了解。
有相关研究指出，脓毒症的死亡率与病原体本身关系并不大，反而与机体的炎症反应密切相关。此观点的核心是细胞炎症因子的大量释放。这些促炎症因子包括白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)及许多其他的小分子等。脓毒症被认为是导致重症患者器官损伤及死亡的主要原因。大量的实验研究己证实严重感染时促炎因子与抗炎因子表达失衡，会导致全身炎症反应的失控，引起组织器官的损伤。有研究发现：血清il-6的浓度能够反映炎症水平和疾病的严重程度，通过监测il-6的变化可以提高脓毒症诊断的精确程度。
目前国际上临床实际应用的aki定义：48h内血清肌酐增加≥26.5μmol/l(0.3mg/dl)或＞50％；或者尿量＜0.5ml/kg，持续6h以上。提出aki的概念的主要目的就是希望提高大家对危重病患者早期肾脏损伤的认识，以避免发生arf，从而降低危重病包括脓毒症患者的病死率。但是目前在以什么指标作为危重病尤其脓毒症患者aki的预测指标、早期aki的标志以及aki病情进展的标志等方面存在很大的争议，也是目前aki的研究热点之一。可以肯定的是，单纯根据尿量、血清肌酐值的变化来诊断aki是不及时的。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理的将tlr4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法，其推测了vegf与tlr4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤具有保护作用，将有助于从一个新的视角揭示脓毒症性aki的发生机制，确立tlr4特异性抑制剂c34作为脓毒症急性肾损伤治疗的新靶标提供科学依据，为开发新药奠定理论和实验基础，有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：它分别从细胞实验和动物实验两种途径进行研究分析；
所述的细胞实验的研究方法如下：
1、小鼠脓毒症性aki模型的建立：
1.1、采用单次腹腔注射lps(10ml/kg)制备脓毒症性aki的模型；40只balb/c小鼠按随机数字表法分为2组，即对照组和模型组，每组20只；生理盐水(ns)对照组：腹腔给予等量生理盐水；模型组：小鼠腹腔注射10ml/kg的lps；造模前12h禁食，自由饮水，造模后自由饮水和进食；
2、动物成模的判定：
2.1、小鼠激发后的表现：对照组活动灵活，可自由饮水、毛发竖起，活动灵活，可自由饮水、进食，尿量平稳；模型组动物精神萎靡，对外界反应迟钝，呼吸频率加快，被毛蓬松少光泽，大便稀软；12h出现死亡大鼠，随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低，肌力减弱，眼周血性分泌物，停止进食进水，排泄稀水样便，色黄，腥臭味；进一步发展出现呼吸急促，对被动仰卧无反抗，排泄物呈黏液状，量多，最终死亡；
2.2、病理切片：取右肾中叶常规切片he染色以观察肾脏形态的改变：光镜下找到完整的肾组织横断面，采用美国mediacybernetics公司image-proplus6.0图像分析软件分别测量肾小球体积，肾囊体积，管状结构、肾小管上皮细胞数目；
3、标本收集：
眼球取血后，脱颈处死小鼠，解剖收集小鼠双侧肾脏，剥离多余结缔组织，用生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取双肾重；然后，左肾放入4％的多聚甲醛溶液中固定；右肾放入ep管，于液氮中快速冻存，置于-80℃冰箱中备用；
4、正常及脓毒症性aki小鼠肾细胞原代培养：
上述各组小鼠麻醉后，开胸迅速取出肾脏置于预先冰浴的d-hanks'溶液，在解剖显微镜下仔细分离出肾脏，并将肾膜剥离干净，去除脂肪，将获得的肾脏在青霉素小瓶中剪成1mm×1mm的小块后，加入1g/li型胶原酶，37℃，5％co2培养箱中消化1h后加入dmem液，混匀后用金属滤网过滤，滤液置离心管内1000r/min离心6min；弃上清后，沉淀的细胞用含20％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的dmem培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长；原代培养的细胞生长约7～10d后融合；0.25％胰蛋白酶消化传代，以含10％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的dmem培养液传代培养，每3～4天换液1次，约4～5d细胞长满后传代，3～8代的细胞用于实验；碱性磷酸酶染色为阳性，抗细胞角蛋白抗体反应阳性，鉴定为原代肾细胞；
5、免疫组化(sp法)及半定量测定tlr4：
肾脏组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并用抗tlr4抗体行免疫组化染色；使用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法进行检测；结果判定为阳性细胞呈棕色，阳性信号为胞浆/胞核内棕黄色颗粒；采用image-proplus6.0图像分析软件测定tlr4含量，以校正后的平均光密度表示；平均光密度为累积光密度(iodsum)除以选定区域的面积(areasum)；
6、real-timepcr检测脓毒症性aki小鼠原代肾细胞vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
7、western-blot方法检测脓毒症性aki小鼠原代肾细胞vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变；
8、构建vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna表达质粒：
构建vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna表达质粒；利用primer5.0分别设计vegf的上下游引物，两端分别引入xhoi和ecori的酶切位点序列，采用pcr扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒lenti-gfp-rnaidnavector中，构建慢病毒载体表达质粒，酶切、测序验证后，将表达质粒和病毒包装元件质粒prsv-rev，pmdlg-prre，pmd2g共同转染到hek293细胞，获得vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna的重组慢病毒颗粒，取浓缩纯化后的病毒上清感染hek293细胞，培养48h后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心、过滤、分装置－80℃保存备用；
9、实验分组：
取第3～8代培养的正常和脓毒症性aki小鼠原代肾细胞，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于96％；用含10％fbs的dmem培养，待细胞90％融合后，换无血清dmem培养24h，使细胞生长同步于g0期，换用含10％fbs的dmem液，健康和脓毒症性aki小鼠原代肾细胞均分为6组：
9.1、control1组：健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞，每孔不加任何干预；
9.2、control2组：健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞；
9.3、c34处理组：c34是一种新型特异性的tlr4抑制剂。在培养液中加入终浓度10μmol/l的c34处理，5％co2温箱中孵育1h；
9.4、空载体干预组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染空载体；
9.5、vegf过表达组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染，使vegf过表达；
9.6、vegf沉默组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用sirna干扰，使vegf沉默；
10、tlr4处理细胞：
分别用1×pbs和tlr4干预各组培养的小鼠原代肾细胞(除control1组)；每组中分别加入终浓度为0.1μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l的tlr4；
11、检测指标：
各组细胞经1×pbs和tlr4干预后，分别于0min、15min、30min、1h、2h、12h、24h，收获并裂解细胞；检测以下指标，并观察小鼠原代肾细胞增殖、凋亡情况：
11.1、细胞增殖检测：
11.1.1、流式细胞仪分析小鼠原代肾细胞周期：小鼠原代肾细胞按106个/ml的密度接种于100cm2的培养瓶，培养及分组如前述，收集的小鼠原代肾细胞用pbs液配制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液，用预冷的75％乙醇固定，加入rna酶，碘化丙啶室温孵育后，用facsort型流式细胞仪(美国bd公司)cellquest软件分析细胞周期中各期所占的百分比；
11.1.2、采用cck8的检测细胞增殖情况：小鼠原代肾细胞分组处理后，去培养基，每孔加入含10％cck-8试剂的培养基，置37℃、5％co2条件下孵育，于酶标仪上检测，根据od值计算生长增殖曲线；
11.2、检测小鼠原代肾细胞凋亡(采用tunel、流式细胞仪检测等方法)：
11.2.1、tunel检测：采用insitucelldeathdetectionkit，pod(roche)试剂盒，各组细胞分别接种于6孔板中，37℃含5％co2的饱和湿度培养箱中培养至50-70％融合，4％多聚甲醛室温下固定1h，3％h2o2甲醇溶液室温孵育10min，0.1％柠檬酸钠溶液(含0.1％tritonx-100)室温孵育2min，加入50μl新鲜制备的tunel反应液，置湿盒中37℃孵育60min，加入50μlconverterpod溶液，37℃避光孵育30min，dab染色，苏木素轻度复染，每份样本随机选取5个视野，计算细胞凋亡率；
11.2.2、流式细胞仪检测(采用annexinv法)：收集培养细胞，加入100μlbindingbuffer和fitc标记的annexin-v(20μg/ml)10μl，室温避光30min，再加入pi(50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μlbindingbuffer，即进行流式细胞术定量检测；同时以不加annexinv-fitc及pi的细胞悬液作为阴性对照；根据凋亡率分析细胞凋亡情况；
11.3、real-timepcr检测细胞内vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
11.4、western-blot方法检测细胞内vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变；
12、验证tlr4靶向调控vegf的表达：
12.1、通过blast等生物信息学方法寻找vegf在基因组上的定位,采用mfold软件预测初级转录本(primarymicrorna，pri-mirna)的二级结构；通过国外公布的人类及小鼠转录起始位点(tss)预测文库，根据第四位赖氨酸三甲基化的h3组蛋白(h3k4me3)在tss位点周围的富集与启动子cpg岛为主要标识，预测vegf的tss。运用tfsearch转录因子结合位点预测软件分析vegf的tss上游2kb内的dna序列，预测可能的tlr4结合位点；
12.2、以双荧光素酶报告基因检验tlr4能否通过转录调控vegf的表达；构建vegf的启动子报告载体，转染293t细胞；24小时后用tlr4处理转染细胞(分别加入终浓度为为0.1μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l的tlr4)；于转染48小时后收细胞，并根据dual-luciferasereporterassaykit的使用说明书检测荧光素酶的活性，观察tlr4能否通过转录调控vegf的表达；
12.3、通过染色质免疫共沉淀技术(chip)，采用tlr4抗体(anti-tlr4)验证tlr4与所预测结合位点的相互关系；
13、寻找与vegf相互作用的蛋白质，探讨vegf调节tlrs信号通路可能涉及的分子机制：
13.1、应用改良的酵母双杂交系统(sos恢复系统)，以vegf蛋白为诱饵(bait)，进行酵母双杂交试验：
13.1.1、从小鼠肾组织中提取总rna，进行cdna的合成和扩增，将cdna产物与表达src的膜定位信号肉豆蔻酰基的基因片段融合，克隆到表达载体上，构建cdna文库；
13.1.2、构建诱饵表达载体(psos-gfp)：诱变psos上的bglⅱ，notⅰ位点，同时在mcs上引入一个gfp表达盒；为了与实验室已有的经典酵母双杂交系统的载体(pdbleu-gfp)兼容，在gfp表达盒两端引入与pdbleu-gfp克隆方式相同的酶切位点(bglⅱ，notⅰ)和同源区；同时确保外源基因与sos蛋白的c末端相融合；
13.1.3、将vegf基因定向克隆至诱饵表达载体(psos-gfp)，检测无自激活和毒性后，将重组质粒转化酵母温度敏感缺陷株cdc25-2；
13.1.4、将含诱饵蛋白vegf与含dna文库的质粒共转染转化酵母温度敏感缺陷株cdc25-2，选择性培养，筛选阳性克隆；
13.1.5、将阳性菌落中的质粒转化e.colidh5α，经测序确定能够与vegf相互作用的靶蛋白/靶基因；
13.2、将vegf基因和靶基因分别克隆至腺病毒表达载体pcmv-myc和pcmv-ha，共转染hek293细胞，用免疫共沉淀的方法验证两者的相互作用。探讨vegf调节tlrs信号通路可能涉及的分子机制。
所述的动物实验的研究方法如下：
1、构建小鼠脓毒症性aki模型，转染含vegf过表达/沉默的慢病毒表达载体到脓毒症性aki小鼠：
balb/c小鼠按随机数字表法分为5组，其中空白对照组10只；脓毒症性aki组4组，每组各10只，分别为：脓毒症性akicontrol组，不加任何干预；ad-gfp组；ad-vegf组；ad-vegf-shrna组。脓毒症性aki小鼠造模同前，从第10d开始，ad-vegf和ad-vegf-shrna组小鼠腹腔注射携带含ad-vegf和ad-vegf-shrna的重组慢病毒，ad-gfp组小鼠转染只含gfp基因组的慢病毒载体。转染方法为每周一次，连续四周；
2、小鼠肾功能检测：
主要指标的测定：血清肌酐(scr)含量、尿素氮(bun)含量和血尿酸(ua)含量；
3、标本收集：
以1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，解剖收集小鼠双侧肾脏，剥离多余结缔组织，用生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取双肾重。然后，左肾放入4％的多聚甲醛溶液中固定；右肾放入ep管，于液氮中快速冻存，置于-80℃冰箱中备用；
4、组织学检查：
肾组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并做苏木精-伊红(he)染色，过碘酸-雪夫(pas)染色，masson三色染色和用抗tlr4抗体行免疫组化染色；
5、real-timepcr检测小鼠肾组织vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
6、western-blot方法检测小鼠肾组织vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变。
本发明的工作原理：
1、tlr4是调控脓毒症急性肾损伤的重要通路：
tlrs是一种识别pamps的受体，可识别外源性或内源性pamps，种类较多，目前发现的受体有11种(tlr1-11)，其在人体内分布也较为广泛，如组织器官、循环中等。tlrs介导的信号传导途径是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。目前tlr4是研究的热点。有关脓毒症实验表明：细菌感染时，tlr4能够识别病原菌，激活tlr信号通路，触发天然免疫功能，通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子，刺激炎性细胞因子产生，tlr4表达量的多少与炎症因子释放量直接相关，且通过调控信号传导通路来调节免疫应答和炎症反应，影响脓毒症的发展。tarekm等研究者制作了(clp)脓毒症小鼠模型来研究tlr4的表达，结果发现局部表达的tlrs可能调节全身感染引起的肾脏反应。patrickn等研究者有关动物实验，证实tlr4在由内毒素诱导的脓毒症aki中起关键作用。以上研究支持tlr4参与脓毒症性aki的发生，而tlr4在肾脏细胞及肾外细胞均有表达，el-achkar等人认为内毒素通过两种途径造成肾小管上皮细胞及肾血管内皮细胞损伤。除了与固有免疫细胞tlr4结合后释放系统性炎症因子间接作用于肾脏引起损伤，还可作用于肾小管上皮细胞及内皮细胞tlr4，引起局部炎症反应和氧化应激，直接造成肾脏损伤。cunningham等认为肾外tlr4在内毒素诱导肾脏损伤中起主要作用，而肾脏tlr4仅在lps诱导的tnf-α介导的肾小管及血管细胞凋亡发挥较小的作用。该研究将c3h/hej小鼠肾脏交叉移植给野生型小鼠后，小鼠血尿素氮水平升高明显，而将野生型小鼠肾脏移植给c3h/hej小鼠后，小鼠虽然出现血尿素氮水平升高，但较升高幅度明显低于前者，可抵抗lps诱导肾脏损伤；
2、vegf参与脓毒症急性肾损伤调控：
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)是一种属血小板源性生长因子家族的生长因子，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生，提高单层内皮的通透性。有关vegf的研究已从肿瘤领域深入到各个疾病领域。近期研究发现，vegf的表达与肾脏疾病密切相关。在肾脏疾病中，急性肾梗死(acuterenalinfarction，ari)的发生是由肾动脉或分支的血管栓塞引起的，因此，ari的发生可能跟vegf表达相关。vegfmrna和蛋白质在正常肾小球脏层上皮细胞、远端小管和集合管上及近端小管上表达。其主要由足细胞产生，刺激内皮细胞的增殖，增加血管通透性，增加肾小球滤过率。隆琦等在急性肾损伤的大鼠模型中发现缺血再灌注后vegf表达减少。冯炜等推测在肾缺血缺氧早期，肾小管上皮细胞分泌vegf增多。不同肾病中vegf的表达有所不同。
3、一些研究还表明脓毒症vegf信号通路发生变化。yano等人的研究显示脓毒症小鼠心、肝、肾组织vegf和plgf水平随时间增加而增加，vegf过表达恶化小鼠脂多糖介导的毒性作用，而腺病毒介导的可溶性血管内皮生长因子受体(solublevascularendothelialgrowthfactorreceptor1，sflt-1)过表达可减弱内毒素引起的vegf和plgf水平升高，阻止内毒素介导的心功能不全，血管渗透性增加，降低死亡率；tsao等发现内毒素诱导的脓毒症小鼠，给予vegf加重炎症反应增加死亡率。xu等人研究发现，在tnf受体(tnfreceptor1，tnfr1)敲除的小鼠中，lps对肾小球内皮层、内皮细胞、肾小球过滤率和蛋白尿的影响降低。并且lps处理后，肾组织中vegf表达减少。表明vegf表达减少是导致lps引起的脓毒症急性肾损伤的主要原因。
基于上述前期研究结果，有充足理据推测vegf与tlr4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤保护作用：tlr4通过tlrs信号通路介导vegf低表达，vegf的低表达又上调tlr4的活化，从而放大tlrs的生物效应并形成恶性循环，加剧脓毒症急性肾损伤的发生。
采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明所述的将tlr4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法，其推测了vegf与tlr4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤具有保护作用，将有助于从一个新的视角揭示脓毒症性aki的发生机制，确立tlr4特异性抑制剂c34作为脓毒症急性肾损伤治疗的新靶标提供科学依据，为开发新药奠定理论和实验基础，有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明细胞实验的流程图。
图2是本发明动物实验的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
具体实施方式一：
参看如图1所示，本具体实施方式采用的技术方案是：它从细胞实验途径进行研究分析，其研究方法如下：
1、小鼠脓毒症性aki模型的建立：
1.1、采用单次腹腔注射lps(10ml/kg)制备脓毒症性aki的模型；40只balb/c小鼠按随机数字表法分为2组，即对照组和模型组，每组20只；生理盐水(ns)对照组：腹腔给予等量生理盐水；模型组：小鼠腹腔注射10ml/kg的lps；造模前12h禁食，自由饮水，造模后自由饮水和进食；
2、动物成模的判定：
2.1、小鼠激发后的表现：对照组活动灵活，可自由饮水、毛发竖起，活动灵活，可自由饮水、进食，尿量平稳；模型组动物精神萎靡，对外界反应迟钝，呼吸频率加快，被毛蓬松少光泽，大便稀软；12h出现死亡大鼠，随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低，肌力减弱，眼周血性分泌物，停止进食进水，排泄稀水样便，色黄，腥臭味；进一步发展出现呼吸急促，对被动仰卧无反抗，排泄物呈黏液状，量多，最终死亡；
2.2、病理切片：取右肾中叶常规切片he染色以观察肾脏形态的改变：光镜下找到完整的肾组织横断面，采用美国mediacybernetics公司image-proplus6.0图像分析软件分别测量肾小球体积，肾囊体积，管状结构、肾小管上皮细胞数目；
3、标本收集：
眼球取血后，脱颈处死小鼠，解剖收集小鼠双侧肾脏，剥离多余结缔组织，用生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取双肾重；然后，左肾放入4％的多聚甲醛溶液中固定；右肾放入ep管，于液氮中快速冻存，置于-80℃冰箱中备用；
4、正常及脓毒症性aki小鼠肾细胞原代培养：
上述各组小鼠麻醉后，开胸迅速取出肾脏置于预先冰浴的d-hanks'溶液，在解剖显微镜下仔细分离出肾脏，并将肾膜剥离干净，去除脂肪，将获得的肾脏在青霉素小瓶中剪成1mm×1mm的小块后，加入1g/li型胶原酶，37℃，5％co2培养箱中消化1h后加入dmem液，混匀后用金属滤网过滤，滤液置离心管内1000r/min离心6min；弃上清后，沉淀的细胞用含20％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的dmem培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长；原代培养的细胞生长约7～10d后融合；0.25％胰蛋白酶消化传代，以含10％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的dmem培养液传代培养，每3～4天换液1次，约4～5d细胞长满后传代，3～8代的细胞用于实验；碱性磷酸酶染色为阳性，抗细胞角蛋白抗体反应阳性，鉴定为原代肾细胞；
5、免疫组化(sp法)及半定量测定tlr4：
肾脏组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并用抗tlr4抗体行免疫组化染色；使用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法进行检测；结果判定为阳性细胞呈棕色，阳性信号为胞浆/胞核内棕黄色颗粒；采用image-proplus6.0图像分析软件测定tlr4含量，以校正后的平均光密度表示；平均光密度为累积光密度(iodsum)除以选定区域的面积(areasum)；
6、real-timepcr检测脓毒症性aki小鼠原代肾细胞vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
7、western-blot方法检测脓毒症性aki小鼠原代肾细胞vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变；
8、构建vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna表达质粒：
构建vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna表达质粒；利用primer5.0分别设计vegf的上下游引物，两端分别引入xhoi和ecori的酶切位点序列，采用pcr扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒lenti-gfp-rnaidnavector中，构建慢病毒载体表达质粒，酶切、测序验证后，将表达质粒和病毒包装元件质粒prsv-rev，pmdlg-prre，pmd2g共同转染到hek293细胞，获得vegf基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠vegf基因shrna的重组慢病毒颗粒，取浓缩纯化后的病毒上清感染hek293细胞，培养48h后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心、过滤、分装置－80℃保存备用；
9、实验分组：
取第3～8代培养的正常和脓毒症性aki小鼠原代肾细胞，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于96％；用含10％fbs的dmem培养，待细胞90％融合后，换无血清dmem培养24h，使细胞生长同步于g0期，换用含10％fbs的dmem液，健康和脓毒症性aki小鼠原代肾细胞均分为6组：
9.1、control1组：健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞，每孔不加任何干预；
9.2、control2组：健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞；
9.3、c34处理组：c34是一种新型特异性的tlr4抑制剂。在培养液中加入终浓度10μmol/l的c34处理，5％co2温箱中孵育1h；
9.4、空载体干预组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染空载体；
9.5、vegf过表达组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染，使vegf过表达；
9.6、vegf沉默组：选择原代培养健康/脓毒症性aki小鼠原代肾细胞为研究对象，利用sirna干扰，使vegf沉默；
10、tlr4处理细胞：
分别用1×pbs和tlr4干预各组培养的小鼠原代肾细胞(除control1组)；每组中分别加入终浓度为(0.1μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l)tlr4；
11、检测指标：
各组细胞经1×pbs和tlr4干预后，分别于0min、15min、30min、1h、2h、12h、24h，收获并裂解细胞；检测以下指标，并观察小鼠原代肾细胞增殖、凋亡情况：
11.1、细胞增殖检测：
11.1.1、流式细胞仪分析小鼠原代肾细胞周期：小鼠原代肾细胞按106个/ml的密度接种于100cm2的培养瓶，培养及分组如前述，收集的小鼠原代肾细胞用pbs液配制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液，用预冷的75％乙醇固定，加入rna酶，碘化丙啶室温孵育后，用facsort型流式细胞仪(美国bd公司)cellquest软件分析细胞周期中各期所占的百分比；
11.1.2、采用cck8的检测细胞增殖情况：小鼠原代肾细胞分组处理后，去培养基，每孔加入含10％cck-8试剂的培养基，置37℃、5％co2条件下孵育，于酶标仪上检测，根据od值计算生长增殖曲线；
11.2、检测小鼠原代肾细胞凋亡(采用tunel、流式细胞仪检测等方法)：
11.2.1、tunel检测：采用insitucelldeathdetectionkit，pod(roche)试剂盒，各组细胞分别接种于6孔板中，37℃含5％co2的饱和湿度培养箱中培养至50-70％融合，4％多聚甲醛室温下固定1h，3％h2o2甲醇溶液室温孵育10min，0.1％柠檬酸钠溶液(含0.1％tritonx-100)室温孵育2min，加入50μl新鲜制备的tunel反应液，置湿盒中37℃孵育60min，加入50μlconverterpod溶液，37℃避光孵育30min，dab染色，苏木素轻度复染，每份样本随机选取5个视野，计算细胞凋亡率；
11.2.2、流式细胞仪检测(采用annexinv法)：收集培养细胞，加入100μlbindingbuffer和fitc标记的annexin-v(20μg/ml)10μl，室温避光30min，再加入pi(50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μlbindingbuffer，即进行流式细胞术定量检测；同时以不加annexinv-fitc及pi的细胞悬液作为阴性对照；根据凋亡率分析细胞凋亡情况；
11.3、real-timepcr检测细胞内vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
11.4、western-blot方法检测细胞内vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变；
12、验证tlr4靶向调控vegf的表达：
12.1、通过blast等生物信息学方法寻找vegf在基因组上的定位,采用mfold软件预测初级转录本(primarymicrorna，pri-mirna)的二级结构；通过国外公布的人类及小鼠转录起始位点(tss)预测文库，根据第四位赖氨酸三甲基化的h3组蛋白(h3k4me3)在tss位点周围的富集与启动子cpg岛为主要标识，预测vegf的tss。运用tfsearch转录因子结合位点预测软件分析vegf的tss上游2kb内的dna序列，预测可能的tlr4结合位点；
12.2、以双荧光素酶报告基因检验tlr4能否通过转录调控vegf的表达；构建vegf的启动子报告载体，转染293t细胞；24小时后用tlr4处理转染细胞(分别加入终浓度为为0.1μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l的tlr4)；于转染48小时后收细胞，并根据dual-luciferasereporterassaykit的使用说明书检测荧光素酶的活性，观察tlr4能否通过转录调控vegf的表达；
12.3、通过染色质免疫共沉淀技术(chip)，采用tlr4抗体(anti-tlr4)验证tlr4与所预测结合位点的相互关系；
13、寻找与vegf相互作用的蛋白质，探讨vegf调节tlrs信号通路可能涉及的分子机制：
13.1、应用改良的酵母双杂交系统(sos恢复系统)，以vegf蛋白为诱饵(bait)，进行酵母双杂交试验：
13.1.1、从小鼠肾组织中提取总rna，进行cdna的合成和扩增，将cdna产物与表达src的膜定位信号肉豆蔻酰基的基因片段融合，克隆到表达载体上，构建cdna文库；
13.1.2、构建诱饵表达载体(psos-gfp)：诱变psos上的bglⅱ，notⅰ位点，同时在mcs上引入一个gfp表达盒；为了与实验室已有的经典酵母双杂交系统的载体(pdbleu-gfp)兼容，在gfp表达盒两端引入与pdbleu-gfp克隆方式相同的酶切位点(bglⅱ，notⅰ)和同源区；同时确保外源基因与sos蛋白的c末端相融合；
13.1.3、将vegf基因定向克隆至诱饵表达载体(psos-gfp)，检测无自激活和毒性后，将重组质粒转化酵母温度敏感缺陷株cdc25-2；
13.1.4、将含诱饵蛋白vegf与含dna文库的质粒共转染转化酵母温度敏感缺陷株cdc25-2，选择性培养，筛选阳性克隆；
13.1.5、将阳性菌落中的质粒转化e.colidh5α，经测序确定能够与vegf相互作用的靶蛋白/靶基因；
13.2、将vegf基因和靶基因分别克隆至腺病毒表达载体pcmv-myc和pcmv-ha，共转染hek293细胞，用免疫共沉淀的方法验证两者的相互作用。探讨vegf调节tlrs信号通路可能涉及的分子机制。
本具体实施方式的工作原理：
1、tlr4是调控脓毒症急性肾损伤的重要通路：
tlrs是一种识别pamps的受体，可识别外源性或内源性pamps，种类较多，目前发现的受体有11种(tlr1-11)，其在人体内分布也较为广泛，如组织器官、循环中等。tlrs介导的信号传导途径是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。目前tlr4是研究的热点。有关脓毒症实验表明：细菌感染时，tlr4能够识别病原菌，激活tlr信号通路，触发天然免疫功能，通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子，刺激炎性细胞因子产生，tlr4表达量的多少与炎症因子释放量直接相关，且通过调控信号传导通路来调节免疫应答和炎症反应，影响脓毒症的发展。tarekm等研究者制作了(clp)脓毒症小鼠模型来研究tlr4的表达，结果发现局部表达的tlrs可能调节全身感染引起的肾脏反应。patrickn等研究者有关动物实验，证实tlr4在由内毒素诱导的脓毒症aki中起关键作用。以上研究支持tlr4参与脓毒症性aki的发生，而tlr4在肾脏细胞及肾外细胞均有表达，el-achkar等人认为内毒素通过两种途径造成肾小管上皮细胞及肾血管内皮细胞损伤。除了与固有免疫细胞tlr4结合后释放系统性炎症因子间接作用于肾脏引起损伤，还可作用于肾小管上皮细胞及内皮细胞tlr4，引起局部炎症反应和氧化应激，直接造成肾脏损伤。cunningham等认为肾外tlr4在内毒素诱导肾脏损伤中起主要作用，而肾脏tlr4仅在lps诱导的tnf-α介导的肾小管及血管细胞凋亡发挥较小的作用。该研究将c3h/hej小鼠肾脏交叉移植给野生型小鼠后，小鼠血尿素氮水平升高明显，而将野生型小鼠肾脏移植给c3h/hej小鼠后，小鼠虽然出现血尿素氮水平升高，但较升高幅度明显低于前者，可抵抗lps诱导肾脏损伤；
2、vegf参与脓毒症急性肾损伤调控：
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)是一种属血小板源性生长因子家族的生长因子，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生，提高单层内皮的通透性。有关vegf的研究已从肿瘤领域深入到各个疾病领域。近期研究发现，vegf的表达与肾脏疾病密切相关。在肾脏疾病中，急性肾梗死(acuterenalinfarction，ari)的发生是由肾动脉或分支的血管栓塞引起的，因此，ari的发生可能跟vegf表达相关。vegfmrna和蛋白质在正常肾小球脏层上皮细胞、远端小管和集合管上及近端小管上表达。其主要由足细胞产生，刺激内皮细胞的增殖，增加血管通透性，增加肾小球滤过率。隆琦等在急性肾损伤的大鼠模型中发现缺血再灌注后vegf表达减少。冯炜等推测在肾缺血缺氧早期，肾小管上皮细胞分泌vegf增多。不同肾病中vegf的表达有所不同。
3、一些研究还表明脓毒症vegf信号通路发生变化。yano等人的研究显示脓毒症小鼠心、肝、肾组织vegf和plgf水平随时间增加而增加，vegf过表达恶化小鼠脂多糖介导的毒性作用，而腺病毒介导的可溶性血管内皮生长因子受体(solublevascularendothelialgrowthfactorreceptor1，sflt-1)过表达可减弱内毒素引起的vegf和plgf水平升高，阻止内毒素介导的心功能不全，血管渗透性增加，降低死亡率；tsao等发现内毒素诱导的脓毒症小鼠，给予vegf加重炎症反应增加死亡率。xu等人研究发现，在tnf受体(tnfreceptor1，tnfr1)敲除的小鼠中，lps对肾小球内皮层、内皮细胞、肾小球过滤率和蛋白尿的影响降低。并且lps处理后，肾组织中vegf表达减少。表明vegf表达减少是导致lps引起的脓毒症急性肾损伤的主要原因。
基于上述前期研究结果，有充足理据推测vegf与tlr4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤保护作用：tlr4通过tlrs信号通路介导vegf低表达，vegf的低表达又上调tlr4的活化，从而放大tlrs的生物效应并形成恶性循环，加剧脓毒症急性肾损伤的发生。
本具体实施方式有益效果为：本具体实施方式所述的将tlr4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法，其推测了vegf与tlr4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤具有保护作用，将有助于从一个新的视角揭示脓毒症性aki的发生机制，确立tlr4特异性抑制剂c34作为脓毒症急性肾损伤治疗的新靶标提供科学依据，为开发新药奠定理论和实验基础，有良好的应用前景。
具体实施方式二：
参看图2，本具体实施方式采用的技术方案是：它从细胞实验途径进行研究分析，其研究方法如下：
1、构建小鼠脓毒症性aki模型，转染含vegf过表达/沉默的慢病毒表达载体到脓毒症性aki小鼠：
balb/c小鼠按随机数字表法分为5组，其中空白对照组10只；脓毒症性aki组4组，每组各10只，分别为：脓毒症性akicontrol组，不加任何干预；ad-gfp组；ad-vegf组；ad-vegf-shrna组。脓毒症性aki小鼠造模同前，从第10d开始，ad-vegf和ad-vegf-shrna组小鼠腹腔注射携带含ad-vegf和ad-vegf-shrna的重组慢病毒，ad-gfp组小鼠转染只含gfp基因组的慢病毒载体。转染方法为每周一次，连续四周；
2、小鼠肾功能检测：
主要指标的测定：血清肌酐(scr)含量、尿素氮(bun)含量和血尿酸(ua)含量；
3、标本收集：
以1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，解剖收集小鼠双侧肾脏，剥离多余结缔组织，用生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取双肾重。然后，左肾放入4％的多聚甲醛溶液中固定；右肾放入ep管，于液氮中快速冻存，置于-80℃冰箱中备用；
4、组织学检查：
肾组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并做苏木精-伊红(he)染色，过碘酸-雪夫(pas)染色，masson三色染色和用抗tlr4抗体行免疫组化染色；
5、real-timepcr检测小鼠肾组织vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4mrna表达改变；
6、western-blot方法检测小鼠肾组织vegf、sflt-1、tnf-α、tlr4蛋白水平表达改变。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。