本发明涉及农业应用生物
技术领域：
，尤其是一种cwmv-vigs基因沉默载体及其在本氏烟中的应用。
背景技术：
：病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,vigs)是一种转录后基因沉默的现象，是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学技术，已成为植物基因功能研究的有力工具。当病毒携带目标基因cdna浸染植物细胞后，在植物细胞内复制与表达的过程中会形成双链rna(dsrna)，dsrna作为基因沉默的激发子，首先在细胞中被特异核酸内切酶切割成小片段的rna(sirna)，然后sirna在植物细胞内以单链形式与一些特异蛋白(ago1)等结合形成rna诱导的沉默复合体，此沉默复合体又特异地与胞质中同源rna结合，造成同源rna降解导致产生转录后水平的基因沉默。中国小麦黄花叶病毒(chinesewheatyellowvirus,cwmv)是一种正义rna病毒，包含有两条单链rna，rna1和rna2。该病毒主要是由土壤中的禾谷多黏菌传播，在我国的冬小麦种植区常年发生。先前，本实验室成功构建了cwmv的全长浸染性cdna克隆，其能够成功侵染本氏烟或寄主小麦并在植株体内正常的复制、增殖和系统运动。因此，以cwmv的全长侵染性cdna为基本元件，并通过人工的改造构建vigs的载体也成为一种可能。利用vigs方法进行植物功能基因的研究主要有以下优点：(1)vigs能快速、直接、高效的在个体中鉴定基因功能缺失的表型，鉴定基因功能；(2)它是一种瞬时基因沉默方法，不需要复杂的遗传转化体系；(3)它是一种转录后的基因沉默，因此能通过对基因家族中高度保守的序列进行沉默来克服基因功能冗余现象；(4)可快速比较同一基因在不同物种中的功能，适用于比较基因组学研究。因此，vigs已在多种植物基因功能研究上开始应用。目前用于vigs的病毒载体常用的主要有烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)、马铃薯x病毒(potatovirusx，pvx)、烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,trv)以及大麦条纹花叶病毒(barleystripemosaicvirus,bsmv)等病毒介导的沉默载体。有些病毒载体本身也能诱导植物在生长过程中出现某些症状或在生理上产生一些变化，给靶标基因功能的鉴定带来一定的干扰。因此，高效且常用的vigs载体相对还是较少。技术实现要素：本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种由cwmv介导的在本氏烟上基因沉默的方法及其应用。本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种构建cwmv诱导的基因沉默载体的方法，包括以下步骤：引物设计：基于本实验室前期构建的cwmv侵染性cdna克隆的rna2的突变体质粒pcb-35s-m5设计引物p1f/p1r，其中p1f的引物包含有spei、kpni、mlui三个酶切位点，p1r的引物包含有saii的酶切位点，引物具体序列见表1；扩增反应：以pcb-35s-m5的质粒为模板，采用高保真的phusindna聚合酶进行扩增，其中引物对p1f/p1r扩增的pcr产物长约为550bp；pcb-35s-mcs突变体的构建：扩增的pcr产物进行切胶纯化回收后用spei/saii进行双酶切，酶切产物经纯化后，连接至同样双酶切处理的pcb-35s-m5上，转化大肠杆菌，测序验证获得重组质粒pcb-35s-mcs。cwmv-vigs载体的应用，具体步骤包括：农杆菌的转化：取重组质粒pcb-35s-mcs3-5μl用电击转化的方法将其转化至农杆菌gv3101中，于28℃的生化培养箱中培养3天；农杆菌的浸润侵染：挑取pcb-35s-mcs阳性克隆和于实验室-80℃保存的pcb-35s-r1菌液分别接种到含kan+抗生素的yep液体培养基中，于28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养过夜，次日按1:100将菌液转接到新的5ml含kan+抗生素的yep液体培养基中，28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养至od600值在0.6-1.5之间并收集农杆菌菌液；用烟草浸润液重悬菌液并于室温下放置2-3小时后，将两者按照1：1的比例混匀，并用注射的方法接种本氏烟叶片；侵染活性分析：二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化；沉默效果分析：三周后进行靶基因表达量的分析并记录植株表型变化。发明有益的效果是：本发明构建了一种cwmv-vigs载体，并能在本氏烟中对靶基因在转录水平上形成有效抑制从而达到基因沉默，这不仅丰富了vigs载体的种类，而且为基因功能的研究提供有效的技术手段。附图说明图1：cwmv-vigs载体的主要结构示意图。图2：cwmv-vigs载体的侵染活性分析,a:1、健康本氏烟；2、cwmv侵染本氏烟；3、cwmv-vigs侵染本氏烟；b:(a)图虚框内局部放大图；c:1、提取健康本氏烟的totalrna；2、提取cwmv侵染本氏烟的totalrna；3、提取cwmv-vigs侵染本氏烟的totalrna。图3：cwmv-vigs:nbpds侵染本氏烟的表型分析：a、健康本氏烟；b、cwmv-vigs:nbpds侵染的本氏烟。图4：本氏烟nbpds基因沉默效率的分析：a、cwmv侵染本氏烟的样本；b、cwmv-vigs:nbpds侵染本氏烟的样本。图5：cwmv-vigs:nbl12侵染本氏烟的表型分析：a、健康本氏烟；b、cwmv-vigs:nbl12侵染的本氏烟。图6:本氏烟nbl12基因沉默效率的分析：a、cwmv侵染本氏烟的样本；b、cwmv-vigs:nbl12侵染本氏烟的样本。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步说明：本发明在构建cwmv诱导的基因沉默载体的方法，包括以下步骤：引物设计：基于本实验室前期构建的cwmv侵染性cdna克隆的rna2的突变体质粒pcb-35s-m5(见yang,j.,zhang,f.,xie,l.,song,x.j.,li,j.,chen,j.p.(2016).functionalidentificationoftwominorcapsidproteinsfromchinesewheatmosaicvirususingitsinfectiousfull-lengthcdnaclones.thejournalofgeneralvirology,97,2441-2450.)设计引物p1f/p1r，其中p1f的引物包含有spei、kpni、mlui三个酶切位点，p1r的引物包含有saii的酶切位点，引物具体序列见表1；表1用于构建pcb-35s-mcs载体的引物引物名称引物序列(5’——3’)p1f5’-gactagttggtaccacgcgtggtgggaaaagtggtgtgagtag-3’p1r5’-attttttcgtcgacattgaagg-3’扩增反应：以pcb-35s-m5的质粒为模板，采用高保真的phusindna聚合酶进行扩增，其中引物对p1f/p1r扩增的pcr产物长约为550bp；pcb-35s-mcs突变体的构建：扩增的pcr产物进行切胶纯化回收后用spei/saii进行双酶切，酶切产物经纯化后，连接至同样双酶切处理的pcb-35s-m5上，转化大肠杆菌，测序验证获得重组质粒pcb-35s-mcs。cwmv-vigs载体的应用，具体步骤包括：农杆菌的转化：取重组质粒pcb-35s-mcs3-5μl用电击转化的方法将其转化至农杆菌gv3101中，于28℃的生化培养箱中培养3天；农杆菌的浸润侵染：挑取pcb-35s-mcs阳性克隆和于实验室-80℃保存的pcb-35s-r1菌液分别接种到含kan+抗生素的yep液体培养基中，于28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养过夜，次日按1:100将菌液转接到新的5ml含kan+抗生素的yep液体培养基中，28℃、220rpm/min的水平摇床中振荡培养至od600值在0.6-1.5之间并收集农杆菌菌液；用烟草浸润液重悬菌液并于室温下放置2-3小时后，将两者按照1：1的比例混匀，并用注射的方法接种本氏烟叶片；侵染活性分析：二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化；沉默效果分析：三周后进行靶基因表达量的分析并记录植株表型变化。本发明用2个重要基因为例进行试验，实施例1中pds是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶，该基因的沉默导致植株叶片的光漂白；实施例2中的l12基因是本实验前期克隆的本氏烟叶绿体关键基因，该基因的沉默会使植物叶片出现明显的花叶症状。实施例1：nbpds部分基因片段的克隆：提取本氏烟的totalrna，并通过反转录获得与本氏烟相对应的cdna，取少量cdna作为模板，利用引物对上游引物pdsn:5’-actagtgaacatattgagtcaaaaggt-3’(下划线部分为spei的序列)和下游引物pdsc：5’-ggtaccgcttctgctgaagagcagatt-3’(下划线部分为kpei的序列)进行pcr扩增，获得的目标产物为nbpds的部分片段，扩增出序列长度约为300bp，经电泳检测、切胶回收后将其连接至pmd18-tsimple载体，获得pmd18-nbpds重组质粒，再将其转化至大肠杆菌dh5α,然后，挑取验证过的阳性克隆，进行测序鉴定。pcb-35s-mcs:nbpds重组载体的构建、转化与筛选：将测序正确的pmd18-nbpds质粒与pcb-35s-mcs质粒分别用spei/kpei进行双酶切，电泳检测、切胶回收，得到纯化的nbpds的部分片段个线性化的pcb-35s-mcs质粒；用t4-dna连接酶将纯化后的nbpds的部分片段连接至线性化的pcb-35s-mcs质粒，得到pcb-35s-mcs:nbpds重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌细胞dh5α，涂布在含50μg/mlkan+的lb平板培养基上，lb平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落进行pcr验证，获得阳性克隆进行测序鉴定。spei/kpei双酶切反应体系：1μl10xbuffer，1μlspei，1μlkpei,7μl质粒；反应条件：37℃条件下酶切1小时；t4-dna连接酶连接反应体系：1μlt4dnaligase，1μl10xligasebuffer，3μlddh2o，2μl线性化的pcb-35s-mcs质粒，2μl经spei/kpei双酶切后的nbpds片段；反应条件：16℃条件下连接2-3小时。pcb-35s-mcs:nbpds重组质粒转化农杆菌gv3101与阳性克隆筛选：取备用的农杆菌gv3101感受态，加入3-5μl鉴定为阳性的重组质粒pcb-35s-mcs:nbpds，移液枪混匀后，将混合液转入事先烘干并冷却的电击杯中，冰上放置5min；将电击装备电压调整至2200v，将电击杯放入装置中进行电击；电击完成后立马把400μl无抗生素的yep液体培养基加入电击杯中，混匀后，将混合物转移到1.5ml无菌离心管中，放置在28℃摇床上，220rpm/min振荡，培养1h；取出离心管，吸取400μl培养菌液，用涂布棒均匀的涂布到含kan+的yep平板培养基上，倒置放在28℃培养箱中，培养3天；挑取单克隆用引物对pdsn/pdsc进行pcr鉴定，电泳检测分析后，筛选阳性克隆进行测序鉴定。cwmv-vigs:nbpds浸润接种及其本氏烟的培养：挑取pcb-35s-mcs:nbpds阳性克隆和于实验室-80℃保存的pcb-35s-r1菌液分别接种到含kan+抗生素的yep液体培养基中，放置于28℃摇床上，220rpm/min振荡，培养过夜；次日按1:100将菌液转接到新的5ml含kan+抗生素的yep液体培养基中，放置于28℃摇床上，220rpm/min振荡培养至od600值在0.6-1.5之间；分别收集农杆菌菌液，用烟草浸润液重悬菌液，将两者按照1：1的比例混匀并于室温下放置2-3小时；选择生长为4叶期的烟草苗，用1ml的注射器将该细菌悬浮液注射进本氏烟叶片；最后，将接种后的烟草放置于15℃、16/8h昼夜、60％相对湿度的植物光照生长箱中培养；二周后进行表型观察并记录各种生长情况至烟草开花期为止。结果分析：在cwmv全长侵染性的基础上，对rna2进行突变，插入多克隆位点(multiplecloningsite,mcs)，构建cwmv-vigs沉默载体如图1所示。本发明构建的cwmv-vigs侵染本氏烟，表型观察发现其与cwmv侵染的植株系统叶片上都明显呈现褪绿花叶症状，northernblotting检测显示cwmv-vigs能够在本氏烟中高效复制，且能够产生大量的亚基因组rna(subgenomicrna,sgrna)(图2)，说明本发明构建的cwmv-vigs沉默载体具有侵染活性并能系统侵染本氏烟，可用于植物靶基因的沉默。cwmv-vigs:nbpds侵染本氏烟14d后发现系统叶片上出现明显的白化症状，65d后发现整株烟草植株都出现明显的白化症状(图3)；对nbpds基因的转录水平检测，每个值都是至少三次重复的平均值，数据运用spss软件，进行成对样本的测验分析，结果发现cwmv-vigs:nbpds侵染的植株中nbpds的表达量显著低于cwmv:vigs侵染的植株(图4)，表明本发明构建的cwmv-vigs沉默载体能够有效的对nbpds进行基因沉默。实施例2：cwmv-vigs载体对本氏烟nbl12沉默分析，具体步骤：nbl12部分基因片段的克隆：利用引物对上游引物l12n:5’-actagtcctcgctgacgcccagaaact-3’(下划线部分为spei的序列)和下游引物l12c:5’-ggtaccgccctaacagccttaattgta-3’(下划线部分为kpei的序列)进行pcr扩增，目的片段的大小为300bp，其它构建过程参照实施例1。pcb-35s-mcs:nbl12重组载体的构建、转化与筛选：具体步骤参照案例1。cwmv-vigs:nbl12浸润接种及其烟草的培养：具体步骤参照案例1。结果分析：对cwmv-vigs:nbl12浸润侵染的本氏烟的症状观察发现侵染14d后系统叶片上出现明显的花叶症状(图5)，对nbl12基因的转录水平检测，每个值都是至少三次重复的平均值，数据运用spss软件，进行成对样本的测验分析，结果发现cwmv-vigs:nbl12侵染的植株中nbl12的表达量显著低于cwmv:vigs侵染的植株(图6)，表明本发明构建的cwmv-vigs沉默载体能够有效的对nbl12进行基因沉默。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。<110>浙江省农业科学院<120>中国小麦黄花叶病毒诱导的基因沉默载体的构建和应用<160>2<210>1<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>p1fgactagttggtaccacgcgtggtgggaaaagtggtgtgagtag43<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>p1rattttttcgtcgacattgaagg22当前第1页12