本发明涉及一种敲除ybbd提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法，属于遗传工程领域。
背景技术：
几丁寡糖是由n-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的低聚合度水溶性甲壳低聚糖，是几丁质经水解生成的一类低聚物。与几丁质相比，几丁寡糖具有更高的水溶性，很容易被吸收利用，它们不仅具有几丁质的部分相似性质，而且一些功能性质更加显著。据报道，几丁寡糖具有抗菌活性、抗肿瘤活性、抵抗细菌侵染的防御能力、降低胆固醇的能力和促进钙吸收的能力、促进双歧杆菌增殖及强的吸湿保湿性能等性质，因此几丁寡糖在食品、医药、农业、日化用品等领域均具有广泛应用。目前，几丁寡糖的合成主要通过化学降解法和酶降解法，但前者需利用强酸或者强氧化剂处理，环境污染较为严重，而后者需要利用虾壳蟹壳为原料制备几丁质底物，易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
微生物细胞中存在着可能是最大数量的天然糖供体，利用微生物进行寡糖的生物合成，可直接或间接的利用天然糖供体进行目的寡糖的规模合成，使得许多天然或非天然的功能性寡糖的应用成为可能。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级几丁寡糖的有效途径。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌生产几丁二糖能力的方法，是敲除枯草芽孢杆菌中的几丁二糖降解酶ybbd。
在本发明的一种实施方式中，所述几丁二糖降解酶的氨基酸序列如seqidno.15所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：构建重组ybbd敲除框，然后转化至枯草芽孢杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组ybbd敲除框转化至枯草芽孢杆菌168-pveg-glms，pp43nmk-nodc中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)克隆几丁二糖降解酶编码基因ybbd两侧同源臂、博来霉素抗性基因zeo序列，构建重组ybbd敲除框片段；(2)通过融合pcr构建重组ybbd敲除框；(3)将步骤(2)构建的重组ybbd敲除框转化至枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168-pveg-glms，pp43nmk-nodc)，通过阻断几丁二糖降解途径，得到高产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种产几丁二糖的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌敲除了几丁二糖降解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述产几丁二糖的枯草芽孢杆菌按上述方法构建获得。
本发明还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产几丁寡糖的方法，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基，于35～37℃、发酵24～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将37℃、220rpm下培养10h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下发酵48h。
本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在制备含几丁寡糖的产品方面的应用。
有益效果：本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高几丁寡糖在胞外积累，其几丁寡糖产量从248mg/l提高到450mg/l,比出发菌株提高81.5％，其中，几丁二糖，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为60mg/l，16mg/l，38mg/l和336mg/l，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，蛋白胨6，硫酸铵6，酵母粉12，木糖5，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，mgso4·7h2o3,微量元素10ml/l。
微量元素溶液(g/l)：mnso4·5h2o1.0，cocl2·6h2o0.4，namoo4·2h2o0.2，znso4·7h2o0.2，alcl3·6h2o0.1，cucl2·h2o0.1，h3bo40.05，含5mhcl。
培养条件：将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。
几丁寡糖的测定方法：
高效液相色谱(hplc)检测法：agilent1200，uv检测器，nh2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速1ml/min，柱温35℃，进样体积为10μl。
实施例1重组质粒的构建
根据ncbi上公布的百脉根根瘤菌(mesorhizobiumloti，genbank：maff303099)中的n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc，通过密码子优化，基因合成seqidno.2所示的序列，设计引物：nodc-f:5’-
ataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgggcaaaaactacaagctctg-3’，
nodc-r:5’-acgatgtagatgttagacatgtgtacattcctctcttaccccgggttatgaaagtgcttcaaactgttgcc-3’，使用上述引物，以合成n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc为模板扩增nodc基因片段，质粒pp43nmk经kpni和hindiii双酶切线性化后与以上扩增基因片段通过gibsonassemblyclongingkit(newenglandbiolabs)连接，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认重组质粒pp43nmk-nodc构建成功。
实施例2重组枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168，pp43nmk-nodc的构建
将构建好的表达载体pp43nmk-nodc转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)。采用nodc-f及gna1-r引物挑选转化子进行菌落pcr，出现1200bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168，pp43nmk-nodc构建成功。
实施例3构建6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glms启动子替换框
根据对ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168，购自美国典型微生物保藏中心,atccno.27370)6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glms进行序列分析获得glms启动子区域，根据其上下游序列设计启动子替换框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：glms-l-f：5’-ggatttaagctttctgatgaacaggagg-3’和glms-l-r：5’-tatgctatacgaacggtattactctaatcccat-3’；右臂上下游引物分别为：glms-r-f:5’-gaggtggatgcaatgtgtggaatc-3’和glms-r-r:5’-gcggcatgttgtaggagaattcac-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)基因组中扩增替换框中包含的左臂和右臂。根据ncbi上公布的p7z6质粒序列(南京农业大学，闫新博士惠赠，ncbiaccessionno.eu541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分别为：glms-z-f:5’-gaaatgggattagagtaataccgttcgtatagc-3’和glms-z-r:5’-ggagcacttccctaccgttcgtat-3’。根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)序列设计引物，扩增组成型启动子pveg序列，上下游引物分别为：glms-p-f:5’-tacgaacggtagggaagtgctcc-3’和glms-p-r：5’-cgattccacacattgcatccacctc-3’。通过融合pcr方法，将替换框左臂、抗性基因、启动子序列和右臂融合为替换框。通过测序确认该启动子替换框构建成功。
实施例4重组枯草芽孢杆菌168-pveg-glms，pp43nmk-nodc的构建
将构建好的启动子替换框转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168，pp43nmk-nodc)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，确认6-磷酸氨基葡萄糖合成酶编码基因glms启动子替换成功，确定重组枯草芽孢杆菌168-pveg-glms，pp43nmk-nodc构建成功。
实施例5克隆几丁二糖降解酶编码基因ybbd敲除框
根据对ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168，购自美国典型微生物保藏中心,atccno.27370)几丁二糖降解酶编码基因ybbd，根据几丁二糖降解酶编码基因ybbd上下游序列设计敲除框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：ybbd-l-f：5’-aaattttgcattgcagcg-3’和ybbd-l-r：5’-ccgggtaccgagctcagaaacttcctcctatcgtctaatc-3’；右臂上下游引物分别为：ybbd-r-f:5’-ctgcaggcatgcaagctaaggagggacacatgagaaaaac-3’和ybbd-r-r:5’-gcaaagcgttccttgatgttta-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)基因组中扩增敲除框中包含的左臂和右臂。根据ncbi上公布的p7z6质粒序列(南京农业大学，闫新博士惠赠，ncbiaccessionno.eu541492)，设计引物，扩增博来霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分别为：ybbd-z-f:5’-gattagacgataggaggaagtttctgagctcggtacccgg-3’和ybbd-z-r:5’-gtttttctcatgtgtccctccttagcttgcatgcctgcag-3’。通过融合pcr方法，将敲除框左臂、抗性基因和右臂融合为替换框。通过测序确认该敲除框构建成功。
实施例6重组枯草芽孢杆菌的构建
将构建好的ybbd敲除框转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168-pveg-glms，pp43nmk-nodc)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，确认几丁二糖降解酶编码基因ybbd敲除成功，确定重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例7发酵生产几丁寡糖
将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。以出发菌株(bacillussubtilis168-pveg-glms，pp43nmk-nodc)为对照，在相同的条件下培养、发酵。最终重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中几丁寡糖产量从248mg/l提高到450mg/l，比出发菌株(bacillussubtilis168-pveg-glms，pp43nmk-nodc)提高81.5％，其中，几丁二糖，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为60mg/l，16mg/l，38mg/l和336mg/l。通过敲除几丁二糖降解酶编码基因ybbd，实现了几丁寡糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<120>一种敲除ybbd提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法
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