本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种利用类弹性蛋白elp构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法。
背景技术：
：如今世界各地的抗生素耐药性问题已日渐增涨，这一问题让人们对抗生素要求大大提升，然而细菌耐药性的发展速度远远大于了我们对抗生素的研究。这时抗菌肽以它独有的优势脱颖而出。amps在不同生物体中对感染的先天免疫反应中起着重要作用。抗菌肽是由各种组织和细胞类型生物体产生的抗病原微生物的天然抗生素。基于防御素的特殊抗性机理，即防御素主要作用于病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性，而传统的抗生素主要作用于微生物的酶，酶基因的突变就会使靶细胞对其产生抗性，所以，防御素具有传统抗生素无法比拟的优势。此外，防御素还具有十分广泛的抗性谱，可抗细菌、真菌、被膜病毒，甚至对支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞（如肿瘤细胞）和艾滋病病毒也有杀伤作用。因此可将防御素作为“超级”抗生素发挥其强效、广谱的抗微生物感染的作用。但从宿主有机体中分离防御素成本极高，使得防御素的利用受到限制，因此通过基因工程手段构建防御素基因表达载体，转入合适的宿主表达细胞，使防御素大量生产，是使其得以广泛利用的有效途径。类弹性蛋白(elastin-likeprotein，elp)是一种化学合成或利用基因工程技术合成的温敏多肽。在水溶液中，elp低温可溶，溶液升温并超过elp的相变温度(transitiontemperature，t)后，elp分子构象变化，疏水聚集，速从溶液中析出；溶液降温(t＜tt)后，elp分子可恢复为溶解状态，elp的这一性质被称为可逆相变(inversetransition)，多数elp重组蛋白都具有这一特性，并能通过可逆相变循环(inversetransitioncycling，tc)进行纯化：升温或将elp的tt降低至室温以下(t＞tt)，触发样品溶液中elp重组蛋白相变析出，通过离心或过滤等方式从样品中分离得到elp重组蛋白，并用低温(t＜tt)缓冲液溶解，重复上述操作，直至重组蛋白纯度较为理想。1996年，mcpherson等首次在大肠杆菌中成功表达并通过itc纯化得到elp，进一步，meyer等在原核表达体系中利用elp-tag纯化得到elp重组蛋白。2005年，banki等首次将具有自切割功能的内含肽(intein)和elp联合使用，构成elp-intein标签(elp-tag)，带有elp-tag的重组蛋白可先通过itc纯化，再诱导intein断裂，再释放与elp-tag融合表达的目的蛋白，最后通过itc去除elp-tag，获得目的蛋白。相比于his-tag等常用的蛋白纯化标签，elp-tag蛋白纯化体系无需树脂基质，成本低廉，操作简单，且易于放大，商业化前景良好。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用类弹性蛋白elp构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法，它是建立绵羊β-防御素-1(sbd-1)的活性区蛋白，利用类弹性蛋白elp有分离纯化特性，将elp-sbd-1基因克隆入原核表达载体pet-22b，成功构建表达载体pet-22b-elp-sbd-1，得到具有生物活性的､大量的､易纯化绵羊β-防御素sbd-1。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用类弹性蛋白elp构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法，其特征在于：它包括以下步骤：1）、以rt-pcr的方法获得sbd-1的成熟肽全基因序列；2）、克隆入原核表达载体pet-22b中，构建表达载体pet-22b-elp-sbd-1；3）、转化dh5α感受态细胞4）、通过itc循环纯化得到sbd-1目的蛋白；5）、再通过诱导表达、超声破碎、蛋白纯化、浓缩、抑菌实验，得到绵羊β-防御素sbd-1目的蛋白。一种elp-sbd-1成熟肽基因，其核苷酸序列为seqidno.11所示的氨基酸序列。编码绵羊β-防御素sbd-1的基因。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒，其为pet-22b-elp-sbd-1。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒转化的宿主细胞。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组载体转化的宿主细胞为大肠杆菌dh5α。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组载体转化的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。一种利用类弹性蛋白elp构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法获得的绵羊β-防御素sbd-1在抗生素中的应用。本发明的有益效果是：1、利用类弹性蛋白elp具有温度敏感的可逆相变特性，用离心等简单方法分离纯化，作为重组蛋白的纯化标签；2、为下一步代替抗生素提供理论基础，对大量生产β-防御素sbd-1提供方法依据；3、无需树脂基质，成本低廉；4、以通过微生物发酵进行大规模生产，成本低，产量高，利于纯化；5、通过设计不同链长和氨基酸组成序列，得到不同tt的elp以满足不同的应用需求；6、机体几乎无法区分自身的弹性蛋白和外源的elp在体内可以生物降解，产物是无害的天然氨基酸，具有良好的生物相容性、低免疫原性和毒性，因此，为生物材料分子，elp有更加广泛的应用前景。7、得到了有活性绵羊β-防御素sbd-1，为大规模的工业化生产提供有利条件。附图说明图1是本发明的流程图。图2是westernblot鉴定结果图，marker，1，2，3都为elp-sbd-1。图3是凝胶电脉结果图.图4是大肠杆菌抑菌试验结果图。图5是双酶切鉴定结果图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。材料：健康蒙古绵羊，经过动物宰杀后，取十二指肠组织备用。下述实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。实施例1：构建重组表达载体pet-22b-elp-sbd-11、蒙古绵羊十二指肠组织总rna的提取（1）、将采集的蒙古绵羊十二指肠组织放入含有液氮的研钵进行研磨，直至成为粉末，期间不断补充液氮，防止液氮挥发，组织rna降解；（2）、取30-50mg组织粉末至1.5ml无酶ep管中，加入1ml预冷trizol的溶液，迅速振荡混匀，静置5min，以分离核酸蛋白复合物；（3）、将冰浴的与trizol反应的组织混合物于提前预冷的离心机中，4℃条件下12000rpm高速离心10min，用新的1.5ml无酶ep收取上清；（4）、将匀浆溶液加入0.2ml（1/5体积）提前冰浴的氯仿溶液，用震荡器剧烈震荡15s，混匀在冰上放置10min；（5）、将步骤（4）溶液在4℃条件下12000rpm高速离心分离10min后，轻柔小心地吸取上层无色水相约0.5ml移至新的1.5ml无酶管中，同时再加入与无色水相体积比为1:1的异丙醇，速颠倒混匀后，置冰浴10min；（6）、将步骤（5）混合液于4℃、12000rpm高速离心10min，弃上清，加入预冷后75%乙醇（rnase-freeddh2o或1‰depc水配制）1ml洗涤沉淀，每使用1mltrizol至少使用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤；（7）、将步骤（6）混合液4℃、12000rpm离心10min，弃上清，使用10μl无酶枪头吸取多余液体，将沉淀静置，短暂干燥约2-3min；（8）、吸一定量的rnase-freeddh2o或1‰depc水，溶解离心管底部的rna沉淀；取约0.5μl步骤（8）提取的十二指肠组织总rna进行0.8%琼脂糖电泳（u=100v，=15min），检查结果为清晰的、无拖尾的两条带，如图3，电泳结果初步评判总rna的完整性；与此同时用核酸蛋白测定仪来测定总rna的浓度、纯度，经测定符合试验要求的总rna，保存于-80℃备用；取52、rt-pcr反应cdna合成采用使用无酶枪头及无酶离心管，按照如下步骤配制反应原料：1)、首先加入1μl反应浓度为50μm的oligo(dt)20，1μl反应浓度为10mm的dntp混合物，然后加入质量为1ng～5μg十二指肠组织总rna，再补齐总反应体积添加12μlrnase-freeddh2o或1‰depc水,充分混匀后瞬时离心，65℃加热5min；2）立即将上述反应的混合液体放置到冰上将其冷却2～5min后，顺时离心，约10s后，添入4μl的5×primescriptbuffer，在添加2μlrnaseinhibitor（40u/μl），用移液器慢慢充分混匀，瞬时离心，37℃下孵育2min；3）再将上述的混合物用瞬时离心机瞬时离心，添加1μl试剂盒内的primescriptrtase（for2step）逆转录酶，随后将用移液器慢慢反复吹打充分混匀，封置于恒温水浴锅中37℃孵育50min；4）将步骤（3）中的反转录反应完成后，在70℃恒温条件下水浴15min反转录终止，反转录酶失活，反转得到的cdna储存于-20℃；（2）、pcr方法扩增sbd-1基因1）、pcr引物的设计根据genbank数据库中sbd-1的全长cdna序列（u75250）设计sbd-1成熟肽引物，下游引物含酶切位点noti如表1:表上游引物5′-tcgtctaagctgccatagg-3′下游引物3′-tttatagcggccgc(noti)cttctttctgcagcatttta-5′2）、按表2体系扩增sbd-1基因表2反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μlcdna2μlsbd-u0.5μlsbd-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μlpcr反应条件为：94℃预变性5min，然后在94℃变性60s，60℃复性45s，72℃延伸45s的条件下，循环30次，最后在72℃延伸10min；3、rt-pcr产物回收在紫外灯下从琼脂糖凝胶中切下单一条带的目的dna，置于离心管并称重，使用1%的凝胶，向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴放置10min；将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca1，11000r/min离心30s，弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700ml漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入500ml漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中，11000r/min离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量无酶水，室温放置2min，11000r/min离心1min收集dna溶液；4、连接反应按表3进行pmd19-tsimple载体和胶回收产物连接，反应条件为：6℃反应3h；表3cdna的连接反应体系反应成份体积sbd-1基因片段4μlpmd19-tsimple1μlligationmix5μl总体积10μl5、连接产物转化dh5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，冰上解冻后，加10μl的连接产物，在冰上冰浴30min，42℃热激90s，孵育3min，加入250μl的lb培养基，于37℃，180r·min-1摇床中培养45min-1h，将培养基分别涂布2个lb琼脂平板，预先涂布50μlx-gal和10μl的iptg且含amp，用途布棒涂布均匀，然后将培养基倒置37℃恒温培养箱中，培养12-14h；6、重组质粒的筛选观察菌落生长情况，蓝白斑生长良好后，将平板置于4℃冰箱中放置30min以后，进行挑菌；准备8个10ml离心管，各加入7mllb(己加amp)液体培养基，用20μl抢头挑取单个8个白色菌落分别置于8个离心管中，于37℃180r·min-1摇床中震摇培养12h；7、菌液pcr取培养后的菌液2μl作为pcr反应模板，按表4菌液pcr反应体系进行扩增；表4菌液pcr反应体系反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μl菌液2μlsbd-u0.5μlsbd-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μl8、质粒dna的小量制备采用碱裂解法小量制备质粒dna：从提取板上挑选10个单菌落分别接种10管10ml含氨苄青霉素（20mg/ml）的lb培养基中，37℃180r·min-1摇床培养过夜（12h）；取1.5ml培养物加入eppendorf管，4℃11000r/min离心1min；吸取培养液，干燥细菌沉淀；向沉淀中加入0.5mlste溶液，充分洗涤，11000r/min离心1min；弃掉上清液，加入预冷的溶液ⅰ200μl，剧烈震荡使菌体悬浮，室温放置10min；加现配的溶液ⅱ400ml使菌体裂解，冰浴10min；加入预冷的溶液ⅲ300ml，混合后冰浴5min，4℃11000r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1混合10min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，加2倍体积的无水乙醇，室温混合5min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，用70%乙醇洗涤，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，室温干燥沉淀，加50mlte缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用；9、质粒dna的酶切鉴定用限制性内切酶noti酶切鉴定阳性质粒，如图4所示，pcr产物标准dl1000，用noti酶切，其消化液组成为（表5）：表5sali＋noti酶切消化体系（20ml）成分加样体积,mlhbuffer2bas2质粒dna8noti1dh2o7终体积total2010、rt-pcr产物cdna的序列测定将酶切鉴定正确的阳性克隆质粒进行序列测定；11、elp的连接反应根据genbank数据库中elp的全长cds序列（kp756910.1）设计获得elp的带有酶切位点sali，elp含酶切位点sali，并连到pet3c-elp载体上；实施例2：重组质粒pet-22b-elp-sbd-1的构建1、引物的设计：根据genbank数据库中elp的全长cds序列（kp756910.1），以pet3c-elp和pmd19-t-sbd-1为模板，设计elp-sbd-1融合基因上游引物、linker和下游引物；上游引物：5′-acgcgtcgac(sali)atgtggtaccgggaatgggtgt-3′下游引物：3′-tttatagcggccgccttctttctgcagcatttta-5′,linker：5′-ggtgttcccggtatgggtaaacgtatcctatggcagcttagacga-3′2、elp-sbd-1的连接pcr反应条件为：94℃预变性5min，然后在94℃变性60s，3℃60s，2℃60s循环25次，最后在72℃延伸10min，用试剂盒回收pcr产物的片段。3、利用overlap-pcr扩增elp-sbd-1片段，取扩增产物，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将产物按pcr产物回收试剂盒进行回收，-80℃保存；用t4dna连接酶连接到pmd19-t载体上，转化到dh5α感受态细胞，经过重组质粒的筛选，质粒dna的小量制备，用pcr和sali、noti双酶切鉴定后，dna测序，序列鉴定正确后，大量制备含有pmd19-t-elp-sbd-1片段的质粒；4、目的片段与表达载体的双酶切将elp-sbd-1的纯化产物用sali+noti双酶切，同时将表达载体pet-22b用sali+noti按表6进行酶切，在37℃下酶4h，而后将酶切产物通过1.0%琼脂糖胶电泳，切胶回收，双酶切鉴定结果如图5所示，1是成功构建pet-22b-elp-sbd-1,2是双酶切sali＋noti双酶切，m是kbladder；表6sali+noti酶切体系成分加样体积,mlelp-sbd-1/pet22b10sali2noti2bufferh2bsa2去离子水2总体积total205、酶切后的目的片段与酶切后的表达载体的连接将回收的目的基因片段和pet-22b质粒载体线性大片段按表7连接反应体系进行连接，反应液混匀，16℃，12h过夜连接；表7连接反应体系成分加样体积,μlpet-22b1.010×t4ligasebuffer1.0t4dnaligase(3u/μl)1.0elp-sbd-16.0灭菌蒸馏水1.0总体积total106、利用大肠杆菌偏爱密码子和genscriptrarecodonanalysis软件获得优化密码子优化的elp-sbd-1基因序列，并全基因合成，克隆入原核表达载体pet-22b；7、连接产物转化大肠杆菌bl21(de2)取新制备100ul大肠杆菌bl21(de2)和10ul连接产物pet-22b-elp-sbd-1混匀，冰浴30min，42℃水浴中热击90s，立刻置于冰上3min，加入lmllb液体培养基混匀，转至37℃摇床180rpm,lh，取50ul转化液涂布在lb(含amp)固体培养基上，自然干燥5-10min，37℃倒置12h过夜培养；8、阳性转化子的鉴定从含有氨苄青霉素的lb平板上挑取菌落形态圆正的，划小区域过夜培养，然后做菌落，取10ulpcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测；9、pet-22b-elp-sbd-1重组原核表达载体的诱导表达重新划板培养12h-13h后，选取单个阳性菌落置于装有含50μg/ml的氨苄青霉素的10mllb的7ml的培养瓶中，37℃摇床180r.min-1，12h-13h，后取新培养的大肠杆菌4ml，接于含50ugμg/ml的氨苄青霉素的500mllb的400ml的培养瓶中，至a(600)=0.6-0.8时(2h-2.5h)，加入终浓度为0.5mm的iptg诱导蛋白表达，培养4h后收集菌体；称重菌体沉淀并加入lysisbuffen(菌体1g:lysisbuffen10ml)重悬，加入终浓度为200ug/ml溶菌酶，20-30min后，加入pmsf至终浓度为100μg/ml混均，冰上完成超声破碎（条件220v，4sbursting，4scooling，100个循环，30min)；10、利用itc性质纯化目的蛋白（1）收集蛋白：重新划板培养12h-13h后，选取单个阳性菌落置于装有含50μg/ml的氨苄青霉素的10mllb的7ml的培养瓶中，37℃摇床180r.min-1，12h-13h，后取新培养的大肠杆菌4ml，接于含50ugμg/ml的氨苄青霉素的500mllb的400ml的培养瓶中，至a(600)=0.6-0.8时(2h-2.5h)，加入终浓度为0.5mm的iptg诱导蛋白表达，培养4h后收集菌体；11000r/min离心15min收集上清，超声破碎后（加入lysisbuffen(菌体1g:lysisbuffen10ml)重悬），11000r/min离心15min,收集上清；（2）、itc循环：收集到的蛋白室温放置30min，在放入25℃恒温水浴锅中保温30min，上清中加入5mnacl储备液至终浓度为2mnacl，以沉淀目的蛋白，25℃，11000r/min离心10min，弃上清以除去杂蛋白，收集沉淀，将沉淀溶于低phtris-hcl裂解液中，吹打混匀，使蛋白充分重悬于裂解液中4℃，30min，之后，11000r/min离心10min，收集上清，重复一次；11、sbd-1蛋白的纯化(1)脱盐以20mm的tris缓冲液，ph=6.8，用sephadexg10脱盐，流速:1ml/min；（2）表达蛋白的纯化(亲和层析)平衡液:50mmna3po4(ph6.8),300mnacl,10mmimidazole;洗脱液:30mmna3po4(ph6.8),300mnacl，500mmlmidazole，流速:lml/min；收集50ul纯化后的样品；（3）浓缩经验证后将其余样品放入超滤离心管15ml2000r/min离心30min，分别收集上下液；12、凝胶电脉分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%，电泳条件浓缩胶80v，分离胶120v；如图3，1是蛋白marker，2是空质粒，3是未itc,4是37℃，5是25℃，6是20℃；13、表达蛋白的westernblot鉴定elp-sbd-1表达凝胶电泳后，把目的蛋白转到尼龙膜上经一抗抚育，irdye680ltgoatanti-mouse(odyssey,926-68020,1:10000)和irdye800ltgoatanti-rabbit(odyssey,926-3211,1:10000)室温孵育1h，tbst清洗3×10min，于li-corodysseyclx进行扫描，以看到清析的条带，鉴定结果如图2所示，elp-sbd-1已在大肠杆菌中成功表达；14、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验将100mlpbs加到冷冻干燥后的蛋白样品0.05g中，用牛津杯法将以重组防御素作用于大肠杆菌，并以100ml的pbs作为对照，过液培养，sbd-1对大肠杆菌bl21能形成抑菌环，如图4所示。序列表<110>内蒙古农业大学<120>利用类弹性蛋白elp构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>ovisaries<400>1tcgtctaagctgccatagg19<210>2<211>34<212>dna<213>ovisaries<400>2tttatagcggccgccttctttctgcagcatttta34<210>3<211>112<212>dna<213>ovisaries<400>3tcgtctaagctgccataggaataaaggcgtctgtgtgccgagcaggtgccctagacacat60gagacagattggcacctgtcgcgggcccccagtaaaatgctgcagaaagaag112<210>10<211>34<212>dna<213>ovisaries<400>10acgcgtcgacsaatgtggtaccgggaatgggtgt34<210>8<211>34<212>dna<213>ovisaries<400>8tttatagcggccgccttctttctgcagcatttta34<210>9<211>45<212>dna<213>ovisaries<400>9ggtgttcccggtatgggtaaacgtatcctatggcagcttagacga45<210>10<211>308<212>dna<213>ovisaries<400>10atgtggtaccgggaatgggtgtgcccggcatgggcgtacctggtatgggagtcccgggga60tgggcgttccagggatgggagtcccagggatgggtgtaccgggcatgggagtgccgggaa120tgggcgtaccggggatgggtgtgcctggtatgggtgtccccggtatgggagttcccggca180tgggcgttccaggcatgggtgtgccgggtatgggagtaccgggtatgggtgtaccaggaa240tgggcgtgcctggcatgggagtaccaggcatgggcgtccccgggatgggtgttcccggta300tggggtaa308<210>11<211>434<212>dna<213>ovisaries<400>11gtcgacatgtgggtgccgggtatgggcgttccgggtatgggcgtgccgggcatgggcgtt60ccgggcatgggcgtgcctggcatgggcgttcctggcatgggcgtgcctggaatgggcgtt120cccggtatgggcgtgcctgggatgggcgttcccggaatgggcgtgcctggtatgggcgtt180cccggcatgggcgtgcccggcatgggcgttcctggaatgggcgtgcccggaatgggcgtt240ccaggtatgggcgtgcccgggatgggcgttccaggaatgggcgtgcccggtatgggcgtt300ccaggcatgggcaaccgtctgagctgccaccgtaacaagggtgtgtgcgttccgagccgt360tgcccgcgtcacatgcgtcagatcggtacctgccgtggtccgccggtgaaatgctgccgt420aagaaagcggccgc434当前第1页12