本发明主要涉及一种从头生物合成迷迭香酸的方法，具体说，利用丹参功能基因，在绿色微生物酿酒酵母中构建迷迭香酸生物合成途径，通过两步发酵法工艺，使工程菌株以基本碳源和氮源为原料，不需要添加底物，从头合成迷迭香酸的方法，属于生物
技术领域：
。发明背景丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)是大宗常用中药材，用于治疗心脑血管疾病，主要有效成分为水溶性酚酸类化合物——丹酚酸和脂溶性二萜醌类化合物——丹参酮。因其临床疗效显著及药理作用物质基础明确，丹参的基因组学信息受到学者们重视，部分功能基因被挖掘。丹参的功能基因，主要是指丹参植物体内参与有效成分生物合成的关键酶基因或称为途径基因，包括参与丹酚酸类化合物生物合成的苯丙烷途径基因，如苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶基因(C4H)、4-香豆酰-辅酶A连接酶基因(4CL)、酪氨酸转氨酶基因(TAT)、对羟基苯丙酮酸还原酶基因(HPPR)、迷迭香酸合成酶基因(RAS)，参与丹参酮类化合物生物合成的异戊二烯途径基因，如乙酰CoA酰基转移酶基因(AACT)、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(HMGR)、脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)、脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(DXR)等。迷迭香酸(rosmarinicacid，RA)最早是从唇形科植物迷迭香(Rosmarinusofficinalis)中分离得到的一种水溶性天然酚酸类化合物。RA在制药、食品、保健品、化妆品等领域具有重要价值。在医药方面，RA具有显著的抗炎、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗抑郁等活性，在改善睡眠、提高记忆力、维持葡萄糖平衡、减缓淀粉糊精样变、抑制肠道病毒、减轻睾丸损伤、治疗不孕不育等方面也有特殊药理作用。目前多采用提取分离技术从植物中获取RA，如有机溶剂浸提、超声波萃取、CO2超临界萃取、大孔吸附树脂等方法，这些方法较繁琐，得率低且纯度不高，难以满足市场需求。有文章发现以酿酒酵母为宿主，采用过表达薰衣草(Lavandulaangustifolia)来源的酰基转移酶基因(LaAT1)和拟南芥来源(Arabidopsisthaliana)At的4-香豆酰-辅酶A连接酶(At4CL5)，通过添加底物：咖啡酸+3,4-二羟基苯乳酸或4-香豆酸+4-羟基苯乳酸经两步反应，分别得到RA和4-香豆酰-4’-羟基苯乳酸，4-香豆酰-4’-羟基苯乳酸是RA类似物，可在CbCPR和CbCYP协同作用下在C-3和C-3’位引入羟基生成RA。采用合成生物学思路在微生物系统中从头合成RA，实现RA的大规模工业化发酵生产，可以弥补植物提取的不足，对解决RA的资源问题具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于运用生物技术方法，克隆多个丹参功能基因及其他物种来源的关键酶基因构建到酵母表达载体上，在酿酒酵母中构建RA的生物合成途径，从而使工程菌株以基本碳源和氮源为原料，从头合成RA。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1.RA生物合成途径设计与途径基因克隆(1)参考文献，设计在酵母中构建的迷迭香酸(RA)生物合成途径，酪氨酸解氨酶(TAL)、4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)、酪氨酸转氨酶(TAT)、对羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)、迷迭香酸合成酶(RAS)、细胞色素P450酶(CYP)和细胞色素P450还原酶(CRP)共7个关键酶催化的生物过程，并采用3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG)促进酪氨酸的生物合成，设计的RA生物合成途径如图1所示；(2)途径基因TAT、4CL、HPPR、RAS来源于丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)，分别记为：Sm1(SmTAT，GenBank登录号：DQ334606)、Sm2(Sm4CL2，GenBank登录号：AY237164)、Sm3(SmHPPR，GenBank登录号：DQ266514)、Sm4(SmRAS，GenBank登录号：KM575933)；CYP、CPR来源于彩叶草(Coleusblumei)，分别记为：Cb1(CbCYP，GenBank登录号：AJ427452)、Cb2(CbCPR，GenBank登录号：AM980997)；TAL来源于约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，记为Fj(FjTAL，GenBank登录号：KR095307)；aroG来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，记为aroG(aroG，GenBank登录号：CP024826，1628265-1629317区)；(3)Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb1和Cb2六个基因以相应生物材料来源的cDNA为模板，采用高保真Taq酶进行PCR扩增，得到全长基因，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；Fj和aroG基因委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行全基因合成。所有基因在PCR扩增或合成时，在两端分别引入KpnⅠ/XhoⅠ或XhoⅠ/XbaⅠ酶切位点。2.RA途径单基因酵母表达载体构建(1)选用pAUR123、pRS424、pRS425、pRS426酵母表达载体。pAUR123为大肠杆菌和酵母中进行复制的穿梭型表达载体，带有用于在酵母进行筛选的金担子素A(AureobasidinA，AbA)抗性基因和大肠杆菌中筛选的氨苄青霉素抗性基因，在启动子PADH1、终止子TADH1序列之间有KpnⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ等酶切位点用于克隆目的基因，可用于构建“启动子-途径基因-终止子”的单基因表达单元；pRS424、pRS425、pRS426分别为Trp-、Leu-、Ura-营养缺陷型高拷贝穿梭型表达载体，其多克隆位点适用于插入“启动子-途径基因-终止子”基因表达单元。所用pAUR123质粒来自TaKaRa公司，pRS424、pRS425、pRS426质粒来自Novagen公司。(2)将测序确定后的八个基因Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb1、Cb2、Fj及aroG与pAUR123分别用KpnⅠ/XhoⅠ或XhoⅠ/XbaⅠ进行双酶切，T4连接酶室温连接1小时，将连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃孵育45min～1h后涂布到带有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃静置培养12h～16h；所用限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ购自赛默飞世尔科技公司，大肠杆菌菌株DH5α来自Invitrogen公司。(3)挑取单菌落分别置于含1ml培养基的1.5ml离心管中，37℃，培养4h～6h,采用特异性引物对菌液进行菌液PCR鉴定，对比条带大小和阴性对照，初步判断阳性菌落；(4)将阳性菌落摇菌，提质粒，酶切2h，电泳鉴定正确，得到重组质粒，即单基因酵母表达载体：pAUR123-Sm1、pAUR123-Sm2、pAUR123-Sm3、pAUR123-Sm4、pAUR123-Cb1、pAUR123-Cb2、pAUR123-Fj、pAUR123-aroG；(5)设计引入同尾酶酶切位点的引物PADH1-F(带有SalⅠ和SpeⅠ酶切位点)，序列为：5’-GGCCGCGTCGACAGACTAGTCGAACAAGTCCGATCAGCTCATAA-3’；引物TADH1-R(带有NheⅠ和NotⅠ酶切位点)，序列为5’-GGCCGCGCGGCCGCTAGCTAGCTCGACTGAAGGCTAGGCTGTGGAT-3’；分别以pAUR123-Sm1、pAUR123-Sm2、pAUR123-Sm3、pAUR123-Sm4、pAUR123-Cb1、pAUR123-Cb2、pAUR123-Fj、pAUR123-aroG重组质粒为模板，扩增出包含启动子PADH1、途径基因、终止子TADH1序列的单基因表达单元片段，记为“PADH1-途径基因-TADH1”，此处“途径基因”指本发明所述的Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Cb1、Cb2、Fj及aroG八个基因；所用限制性内切酶SalⅠ、SpeⅠ、NheⅠ和NotⅠ购自赛默飞世尔科技公司。(6)将得到的PCR扩增产物“PADH1-途径基因-TADH1”片段与pRS424、pRS425、pRS426分别进行双酶切、T4连接酶连接、转化，鉴定得到重组质粒，即单基因营养缺陷型表达载体：pRS424-Sm1、pRS425-Sm2、pRS426-Sm3、pRS424-Sm4、pRS426-Cb1、pRS426-Cb2、pRS426-Fj/pRS425-aroG。3.营养缺陷型多基因表达载体构建(1)应用同尾酶策略，在单基因营养缺陷型表达载体基础上，把单个基因表达单元首尾相连，得到重组质粒，即多基因表达载体：pRS424-SmTAT-Sm4CL2-SmHPPR-SmRAS(记为pRS424-S4)，pRS426-CbCYP-CbCPR-FjTAL(记为pRS426-C2F)；(2)将构建好的pRS424-S4、pRS425-aroG、pRS426-C2F采用热激法，共同转化酿酒酵母W303a感受态细胞，涂布于Trp-/Leu-/Ura-三缺营养缺陷型固体培养基平板后，于30℃培养箱培养48h；所用酿酒酵母W303a来自Invitrogen公司。(3)挑选单菌落，针对途径基因进行PCR鉴定，含有所有八个基因的阳性菌落进行培养，记为工程菌株YW-S4C2FG。4.工程菌发酵培养(1)将工程菌YW-S4C2FG和含有pRS424、pRS426空载体的阴性对照酵母菌株YW-G0分别接种Trp-/Leu-/Ura-三缺和Trp-/Ura-两缺营养缺陷型培养基中活化，于30℃活化培养24h；(2)从平板培养基上挑取单菌落，分别接种于Trp-/Leu-/Ura-三缺和Trp-/Ura-两缺营养缺陷型培养基离心管中，在200rpm、30℃下振荡培养24h；(3)将上述培养物按1:50比例分别接种到带有20mLTrp-/Leu-/Ura-三缺和20mLTrp-/Ura-两缺营养缺陷型液体培养基的摇瓶中，200rpm、30℃下振荡培养24h；(4)转入无菌离心管，于5000rpm离心，去上清，分别加入20mL新的三缺和Trp-/Ura-两缺营养缺陷型液体培养基，用移液枪轻柔悬浮细胞；(5)将悬浮酵母细胞转移至无菌摇瓶中，200rpm、30℃继续振荡培养72h；5.迷迭香酸(RA)检测(1)发酵过程结束，收集发酵液，用等体积乙酸乙酯分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干乙酸乙酯，所得干燥物即为发酵产物；(2)取干燥物用LC-MS初始条件下的流动相溶液溶解，0.22μm滤膜过滤，用CAPCELLPAKC18(2μm，2.1mmI.D.×100mm)色谱柱，对发酵产物成分进行分析。所述的LC-MS流动相初始条件为:流动相A为0.4％甲酸水溶液，B为乙腈，A：B＝9：1。所用CAPCELLPAKC18购自资生堂(Shiseido)公司。综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明采用三个质粒共同转化方法，在酿酒酵母W303a中构建了迷迭香酸(RA)的生物合成途径，得到工程菌株YW-S4C2FG。该菌株以基本碳源和氮源为原料，不需要添加苯丙素类化合物为底物，通过两步发酵法，可以合成RA。所用酿酒酵母W303a来自Invitrogen公司。本发明重点在于：在酿酒酵母工程菌中构建了完整的迷迭香酸合成途径，并检测到迷迭香酸积累。已有的在大肠杆菌中合成RA的报道，需要添加苯丙素类化合物如咖啡酸及RA生物合成中间体如3,4-二羟基苯乳酸等作为底物，成本较为昂贵。本发明解决了添加底物问题，可以在工程酵母菌中从头合成迷迭香酸，为迷迭香酸的工业化生产提供了新的途径。附图说明图1.本发明构建的从头生物合成迷迭香酸的途径示意图。黑色边框标注的为催化RA生物合成的关键酶。图2.pRS424-S4载体图谱。图3.pRS425-aroG载体图谱。图4.pRS426-C2F载体图谱。图5.RA标准品及发酵产物LC-MS图谱。图6：迷迭香酸(RA)图5a：RA对照品；图5b：阴性对照YW-G0发酵产物；图5c：工程菌株YW-S4C2FG发酵产物；图5d：发酵产物RA的MS/MS图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细地说明，这些实例和附图仅起说明性作用，并不因此限制本发明的内容。因此，凡不违背本发明精神所做的修改及变形，均应包括在本发明范围内。实施例1丹参功能基因SmTAT(Sm1)基因的PCR扩增根据已知的SmTAT基因序列，在两端设计包含KpnI和XbaI酶切位点的引物。PCR反应体系如下：组成成分体积ddH2O3.6μl2×高保真PCR预混液5.0μl引物Sm1-F(10μM)0.2μl引物Sm1-R(10μM)0.2μl丹参cDNA模板1.0μl总体积10μl引物Sm1-F序列为：5’-GGTACCATGGAGTTGCAGAATCCAGC-3’；引物Sm1-R序列为：5’-AGATCTTGAATCATCCTCATGGCAAG-3’；丹参cDNA模板来自于丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)新鲜材料：用上海捷瑞生物技术有限公司的RNA提取试剂盒提取丹参叶片总RNA、上海创英生物科技有限公司的一体化反转录预混液反转录成丹参cDNA。PCR反应条件如下：PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切下带有Sm1片段的凝胶，并用胶回收试剂盒纯化回收，所得即为SmTAT基因(Sm1)PCR扩增产物。实施例2pAUR123-Sm1单基因表达载体构建(1)用KpnI和XbaI限制性内切酶分别酶切纯化回收的SmTAT基因(Sm1)PCR扩增产物和pAUR123表达载体，酶切体系如下：组成成分体积H2O7μlSm1基因片段或pAUR123质粒10μl10×FDBuffer2μlKpnI(200U/μl)0.5μlXbaI(200U/μl)0.5μl总体积20ul限制性内切酶KpnI、XbaI及相应的10×FDBuffer购自赛默飞世尔科技有限公司。(2)于37℃酶切2h，反应液进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒分别回收Sm1基因片段与pAUR123载体片段。(3)Sm1基因与pAUR123载体连接，连接体系如下：组成成分体积10×T4连接缓冲液1μlT4连接酶1μlpAUR123载体片段3μlSm1基因片段5μl总体积10μlT4连接酶及相应的10×T4连接缓冲液购自Promega公司。(4)室温放置1h，进行连接反应；(5)热激法转化大肠杆菌DH5α从-80℃取出一管DH5α感受态细胞，于超净台加入连接体系，轻弹混匀，冰置30min，并打开水浴锅调至42℃备用。42℃热激45s～60s，冰中放置2min，于超净台加入200μlLB培养基，37℃摇床孵育45min～60min后，将菌液涂布到附加100mg/L氨苄青霉素的LB(Amp+)固体平板，37℃培养箱培养过夜。(6)采用菌落PCR鉴定阳性菌落。选择阳性克隆送样测序，鉴定Sm1基因已正确扩增并插入到pAUR123表达载体中。证明表达载体pAUR123-Sm1构建成功。实施例3pRS424-Sm1营养缺陷型单基因表达载体构建(1)设计分别包含有SalⅠ/SpeⅠ和NheⅠ/NotⅠ酶切位点的上、下游引物(PADH1-F和TADH1-R)，以pAUR123-Sm1重组质粒为模板，扩增出包含启动子PADH1、Sm1基因、终止子TADH1序列的单基因表达单元片段，记为“PADH1-Sm1-TADH1”；(2)用SpeⅠ和NotⅠ限制性内切酶对“PADH1-Sm1-TADH1”PCR扩增产物和pRS424载体分别进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收“PADH1-Sm1-TADH1”片段和pRS424载体片段部分，酶切体系如下表所示，反应条件为37℃酶切2h：组成成分体积ddH2O7μlPADH1-Sm1-TADH1基因表达单元片段或pRS424质粒10μl10×FDBuffer2μlSpeⅠ(200U/μl)0.5μlNotⅠ(200U/μl)0.5μl总体积20ul(3)Sm1基因与pRS424载体连接，连接体系如下：组成成分体积10×T4连接缓冲液1μlT4连接酶1μlpRS424载体片段3μlPADH1-Sm1-TADH15μl总体积10μl(4)室温放置1h，进行连接反应；(5)热激法转化大肠杆菌DH5α。转化方法同实施例2。(6)菌落PCR鉴定阳性菌落。选择阳性克隆送样测序，鉴定Sm1基因已正确扩增并插入到pRS424表达载体中。证明表达载体pRS424-Sm1构建成功。实施例4pRS424-S4营养缺陷型多基因表达载体构建(1)pAUR123-Sm2(pAUR23-Sm4CL2)的构建同实施例2方法一致。以pAUR123-Sm2为模板，同实施例3方法一致扩增出“PADH1-Sm2-TADH1”基因表达单元片段；(2)用SpeⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切“PADH1-Sm2-TADH1”片段，用NheⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切pRS424-Sm1表达载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收“PADH1-Sm2-TADH1”基因表达单元片段和pRS424-Sm1载体片段部分，酶切反应体系如下表所示，反应条件：37℃，2h。组成成分体积H2O7μlPADH1-Sm2-TADH1基因片段10μl10×FDBuffer2μlSpeⅠ(200U/μl)0.5μlNotⅠ(200U/μl)0.5μl总体积20ul组成成分体积H2O7μlpRS424-Sm110μl10×FDBuffer2μlNheⅠ(200U/μl)0.5μlNotⅠ(200U/μl)0.5μl总体积20ul限制性内切酶SpeI、NheⅠ和NotⅠ及相应的10×FDBuffer购自赛默飞世尔科技公司。(3)PADH1-Sm2-TADH1基因表达单元片段与pRS424-Sm1载体片段连接，连接体系如下：组成成分体积10×T4连接缓冲液1μlT4连接酶1μlpRS424-Sm1载体片段3μlPADH1-Sm2-TADH15μl总体系10μl(4)室温放置1h，进行连接反应；(5)热激法转化大肠杆菌DH5α，转化方法同实施例2.菌液PCR鉴定阳性菌落。选择阳性克隆送样测序，鉴定“PADH1-Sm2-TADH1”基因片段已正确插入到pRS424-Sm1表达载体中。证明表达载体pRS424-Sm1-Sm2构建成功。(6)采用步骤(1)～(5)同样策略，依次将“PADH1-Sm3-TADH1”、“PADH1-S4-TADH1”基因表达单元连接到pRS424-Sm1-Sm2后面，最终得到连有Sm1、Sm2、Sm3、Sm4共4个基因的载体pRS424-Sm1-Sm2-Sm3-Sm4，记为pRS424-S4。实施例5酵母菌感受态细胞的制备(1)用无菌牙签在YPAD平板上挑取一个酵母菌株的单菌落，加入到5mL的YPAD液体培养基里，200rpm、30℃摇床振荡培养(同时将一瓶装有50ml2×YPAD培养基的250mL培养瓶置于30℃培养箱进行预热)；(2)酵母菌培养12h～16h后，测定培养液OD值，计算细胞浓度；(3)取2.5×108个细胞加到置于培养箱中预热的50mL2×YPAD培养基的培养瓶中，计算细胞浓度为5×106cell·mL-1；(4)200rpm、30℃摇床振荡培养4h～5h，至细胞浓度为2×107cell·mL-1；(5)3000rpm、离心5min，25mL无菌水重悬细胞，室温离心，清洗，再重悬，再离心，最后用1.0mL的无菌水重悬酵母细胞；(6)将酵母细胞悬浮液转移到1.5mL的无菌微量离心管中，13000g离心30s，弃去上清。用1.0mL的无菌水重悬，吸取包含有108个细胞的100μl样品加入到新的1.5mL的无菌微量离心管中，悬浊液即为酵母菌感受态细胞。置-80℃冰箱保存，备用。实施例6重组质粒转化酵母菌感受态细胞(1)取一管酵母菌感受态细胞，于13000g离心30s，弃去上清，得到沉淀于管底的酵母菌感受态细胞。(2)混合转化液：转化混合物体积(μl)PEG3350(50％(w/v))2401.0M醋酸锂36单链载体DNA(2.0mg/mL)50重组质粒DNA34总体积360(3)将360μl转化液加入到第(1)步带有酵母菌感受态细胞的离心管中，用移液枪轻吹打重新悬浮酵母细胞，然后于42℃水浴40min；(4)13000g离心30s，弃去上清，加入300μl无菌水，再次用移液枪问好重悬细胞；(5)吸取2μl、20μl、200μl细胞悬浮液，分别根据转化单质粒或共转多质粒的筛选标记涂布到相应的含有Trp-、Leu-、Ura-单缺、Trp-/Ura-两缺或Trp-/Leu-/Ura-三缺的营养缺陷型培养基平板上，30℃培养2d～3d；(7)取单菌落进行菌落PCR鉴定，筛选酵母菌阳性克隆；阳性工程菌在液体培养基中培养后，于-80℃冰箱保存，备用。实施例7工程酵母菌的两步发酵法培养(1)预培养：用接种环蘸取保存于-80℃冰箱的酵母工程菌YW-S4C2FG或从平板上挑取工程菌单菌落于3mL液体Trp-/Leu-/Ura-三缺营养缺陷型培养基中，200rpm、30℃下振荡培养16h～24h；(2)扩大培养：按2％接种量接种于20mL培养基中，条件同上，继续培养24h；(3)更新培养基：将菌液转移至50mL无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，用20mL新的培养基悬浮细胞沉淀，转移至原来的三角瓶中，条件同上，继续培养72h；(4)所得即为工程酵母菌的发酵液，用于后续迷迭香酸产物分析。实施例8发酵液中迷迭香酸(RA)的LC-MS分析检测及HPLC含量测定(1)样品处理：移液枪吸取600μl实施例7步骤(3)培养72h后的发酵液于2mL干净离心管内，12000rpm离心1min，移上清至新的离心管中，添加200μl乙酸乙酯萃取，涡旋仪混匀，12000rpm再次离心1min，吸取上层有机相于新的1.5mL离心管，重复上述操作三次，将含有机相的离心管置于55℃干浴锅，挥干之后吸取600μl流动相初始溶剂配比(540μl的0.4％甲酸水溶液+60μl乙腈)溶解，超声30min，过0.22μm滤膜，备用；(2)UPLC-MS检测：色谱柱为购自资生堂公司(Shiseido)的CAPCELLPAKC18(2μm，2.1mmI.D.×100mm)，以0.4％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按照90％A：10％B～64％A：36％B的梯度洗脱。洗脱时间12min，进样体积5μl，流速0.4mL/min，柱温50℃。LC-MS配备有电喷雾离子源(ESI源)，负离子监测模式下全扫描检测化合物。(3)对YW-S4C2FG重组菌株两步发酵法的发酵产物进行UPLC-MS检测，结果如图5所示：图5a表示RA标准品的出峰位置，出峰时间为6.7min，负离子检测模式下分子量为359.2；图5b是含有pRS424、pRS426两个空质粒的阴性对照YW-G0菌株发酵结果图谱，在RA标准品位置没有峰；图5c是YW-S4C2FG菌株的发酵检测结果图谱，与阴性对照相比，6.7min的位置出现新峰，与图5aRA标准品出峰时间一致；图5d为图5c中6.7min峰的MS/MS图谱，显示负离子模式下该峰与RA标准品一致，均为359.2。以上结果表明：两步发酵法培养酿酒酵母工程菌YW-S4C2FG，能够从头合成RA。(4)对发酵产物中RA含量进行HPLC检测：色谱柱为CNWAthenaC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，以含0.4％的甲酸水为流动相A，乙腈为流动相B，按照90％A：10％B～64％A：36％B的梯度洗脱。洗脱时间40min，进样体积20μL，流速1mL/min，柱温25℃。根据所建立的RA标准曲线(y＝9.017x-32.343，y表示峰面积，x表示检测样浓度，单位为mg/L；R2＝0.9998)对三个重复样品进行计算，得出RA含量为7.9±0.3mg/L。序列表<110>上海中医药大学<120>一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>44<212>DNA<213>同尾酶酶切位点的引物PADH1-F(人工序列)<400>1ggccgcgtcgacagactagtcgaacaagtccgatcagctcataa44<210>2<211>46<212>DNA<213>引物TADH1-R(人工序列)<400>2ggccgcgcggccgctagctagctcgactgaaggctaggctgtggat46当前第1页1 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