本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种温度响应性可逆水凝胶的制备方法及应用。
背景技术：
智能水凝胶具有对外界环境刺激产生应答的特性，在功能“开关”材料、药物缓释材料、敷料以及可注射水凝胶等方面有重要的应用，是当前生物材料领域的研究热点。
其中，温度敏感型水凝胶是指体系体积或者相行为等随温度而变化的水凝胶，作为药物缓释材料具有独特优势。比如，水凝胶在低于人体温度时可以处于收缩状态，很好地实现对药物的包埋，而在人体温度时处于溶胀状态，包埋的药物分子可以自由扩散到人体组织，实现有效的可控释放。大多数温度敏感型水凝胶是基于温度变化时聚合物分子聚集状态的变化实现凝胶体积或者强度的变化，而一般难以实现“溶胶-凝胶”的可逆转变。
温度敏感型聚合物“聚n-异丙基丙烯酰胺”(pnipam)是热缩型温敏聚合物，分子内既含有疏水基团又有亲水基团。在温度比最低临界转变温度(lcst)低时，主要起作用的是酰胺基团与水分子之间的作用力，保持高分子的溶胀状态。随温度的上升超过lcst时，高分子内部和高分子之间的疏水作用增强，这使得水分子与高分子链的结合被破坏，水分子被排出从而产生相变。但是，pnipam溶液自身随温度升高无法形成水凝胶，更无法实现“溶胶-凝胶”的可逆转变。多肽一维纳米结构则由于其氨基酸组成，具有很好的生物相容性和较低毒性，这种结构可以提供表面基团或者疏水内部空腔对药物分子进行结合和负载，是药物控释应用的理想材料，但是其并不具备温度响应性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种温度响应性可逆水凝胶的制备方法及应用。通过n-异丙基丙烯酰胺溶液与自组装多肽溶液的混合得到互穿网络型二元复合体系，将前者的温度响应性和后者的药物负载及释放性能有效结合，成功制备随温度的变化具有可逆的“溶胶-凝胶”转变性能的材料，可作为水凝胶敷料和可注射水凝胶，实现对药物的负载和控释。
本发明一方面提供了一种温度响应性可逆水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
配制能够自组装形成一维纳米结构的多肽的水溶液，溶液中多肽的浓度大于其自组装临界浓度，放置，使其完成自组装；
将聚n-异丙基丙烯酰胺溶于tris缓冲溶液，过夜放置，搅拌得到聚n-异丙基丙烯酰胺溶液，浓度为5-40mg/ml；
将上述自组装完成的多肽溶液与上述聚n-异丙基丙烯酰胺溶液于20-30℃下按照如下复配条件进行混合，得终态溶液，复配条件为：终态溶液中多肽的浓度为大于其自组装临界浓度且同时保持均匀分散的浓度，终态溶液中聚n-异丙基丙烯酰胺的浓度为1.0-40mg/ml；
调节终态溶液温度，终态溶液温度≥32℃时，得到水凝胶；终态溶液温度＜32℃时，得到溶胶。
作为优选，所述能够自组装形成一维纳米结构的多肽选自i3k、a6k、i3cgk、nap-ffgplglarkrk、v3g3i3a3k3、k3g3a3v3i3中的一种。
本发明另一方面提供了上述方法制备得到的温度响应性可逆水凝胶，所述温度响应性可逆水凝胶随温度变化可以实现水凝胶和溶胶的可逆转变。
本发明再一方面提供了上述温度响应性可逆水凝胶在药物负载和控释中的应用，包括如下步骤：
将药物分子加入到完成自组装的自组装多肽溶液或终态溶液中，搅拌，放置大于2小时，得负载药物的混合溶液，将混合溶液升温至32-80℃形成负载药物的温度响应性可逆水凝胶，将上述负载药物的温度响应性可逆水凝胶放入32-80℃的纯水或缓冲溶液中，进行药物控释。
本发明再一方面提供了上述温度响应性可逆水凝胶在制备智能水凝胶敷料中的应用。
本发明再一方面提供了上述温度响应性可逆水凝胶在制备可注射水凝胶中的应用。
本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明的方法通过自组装多肽自组装得到一维纳米结构与聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)之间通过物理交联的方法实现温度响应性可逆水凝胶的制备，方法简单易实施；
(2)本发明的制备方法中可选用的自组装多肽分子种类多，来源广泛，只要能够组装为长的一维结构如纳米纤维、纳米管、纳米带等即可；
(3)本发明的温度响应性可逆水凝胶能够提供疏水环境或者表面基团用于药物的相互作用，从而实现药物的高效负载，具备温度敏感性，能够进行药物的控释；
(4)本发明的温度响应性可逆水凝胶的相转变温度在体温附近，可以通过人体皮肤或者组织温度实现升温形成水凝胶的过程，也可以通过冰敷等物理降温方式简单方便地实现降温恢复溶液状态的过程，从而可用于智能水凝胶敷料或者可注射水凝胶。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的i3k纤维的原子力显微镜(afm)形貌图；
图2为本发明实施例所提供的i3k/pnipam混合溶液在30℃及37℃时不同状态的照片；
图3为本发明实施例所提供的温度响应性可逆水凝胶负载阿霉素(dox)的i3k纤维的原子力显微镜(afm)形貌图；
图4为本发明的温度响应性可逆水凝胶在37℃时dox释放量随时间的变化曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种温度响应性可逆水凝胶的制备方法，包括：
s1：配制能够自组装形成一维纳米结构的多肽的水溶液，水溶液中多肽的浓度大于其自组装临界浓度，放置，使其完成自组装。
本步骤中自组装多肽自组装成一维纳米结构，由于其氨基酸组成，具有很好的生物相容性和较低毒性，这种结构又可以提供表面基团或者疏水内部空腔对药物分子进行结合和负载，本步骤通过具有较强组装能力的多肽在一定浓度之上自组装形成长的纳米纤维、纳米管等组装体结构，可以理解的是，能够形成一维纳米结构的多肽分子均在可选范围，优选的，如i3k、a6k、i3cgk、nap-ffgplglarkrk、v3g3i3a3k3、k3g3a3v3i3等。
s2：将聚n-异丙基丙烯酰胺溶于tris缓冲溶液，过夜放置，搅拌得聚n-异丙基丙烯酰胺溶液，浓度为5-40mg/ml。
本步骤中聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)具有温度敏感性相行为，低温时在水中溶胀，32℃以上凝聚析出。
s3：将上述自组装完成的多肽溶液与上述聚n-异丙基丙烯酰胺溶液于20-30℃下按照如下复配条件进行混合，得终态溶液，复配条件为：终态溶液中多肽的浓度为大于其自组装临界浓度且同时保持均匀分散的浓度，终态溶液中聚n-异丙基丙烯酰胺的浓度为1.0-40mg/ml。
本步骤中中，多肽自组装形成的一维纳米结构与pnipam之间通过物理交联的方法实现温度响应性可逆水凝胶的制备。
s4:调节终态溶液温度，终态溶液温度≥32℃时，得到水凝胶；终态溶液温度＜32℃时，得到溶胶。
在本步骤中,终态溶液升温至32℃以上，溶液失去流动性，可以形成水凝胶，低于32℃时回复流动性。而此浓度下单一的自组装多肽溶液或pnipam溶液升温后依然流动性良好，不能形成水凝胶。
本发明的另一实施例提供了上述方法制备得到的温度响应性可逆水凝胶。
本发明再一实施例提供了上述温度响应性可逆水凝胶在药物负载和控释中的应用，包括如下步骤：
将药物分子加入到完成自组装的自组装多肽溶液或终态溶液中，搅拌，放置大于2小时，得负载药物的混合溶液，将混合溶液升温至32-80℃形成负载药物的温度响应性可逆水凝胶，将上述负载药物的温度响应性可逆水凝胶放入32-80℃的纯水或缓冲溶液中，进行药物控释。本实施例中，由于多肽自组装纳米结构的存在，提供了大量的药物结合位点，可以方便地实现对不同药物的负载和控制释放。上述水凝胶在≥32℃的范围能够形成水凝胶，基于药物的药效，优选的温度范围在32-40℃。
本发明再一实施例提供了上述温度响应性可逆水凝胶在制备智能水凝胶敷料中的应用。本实施例中，作为水凝胶敷料，本发明的温度响应性水凝胶不但具备富含水分、可促进自溶性清创、吸收创面渗出液、保持创面湿润、提高伤口肉芽组织再生生能力等一般水凝胶敷料的优点，而且去除敷料时可以通过温度变化使凝胶转变为可流动性的溶胶自发流失，不粘连创面，避免创面的二次损伤和降低疼痛。
本发明再一实施例提供了上述温度响应性可逆水凝胶在制备可注射水凝胶中的应用。本实施例中，作为可注射水凝胶，利用其初始的溶胶状态，可以填充任意形状的缺损，植入时可以利用人体组织自身的温度实现对体系的升温形成水凝胶，不需外科手术。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的温度响应性可逆水凝胶的制备方法及应用，以下将结合具体实施例进行说明。
实施例
配制浓度为10.0mm(大于i3k临界自组装临界浓度)的i3k水溶液，水溶液ph为4.5±0.5，放置1天以上，使其完成自组装，自组装的纳米纤维状结构如图1所示；
将聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)溶于tris缓冲溶液，浓度为20mg/ml，过夜放置，搅拌得聚n-异丙基丙烯酰胺溶液。
将上述自组装完成的i3k溶液与上述聚n-异丙基丙烯酰胺溶液于30℃下等体积混合，搅拌10min，混合均匀，得终态溶液，终态溶液中多肽的浓度为大于其自组装临界浓度且同时保持均匀分散的浓度，终态溶液中聚n-异丙基丙烯酰胺的浓度大于1.0mg/ml。
调节终态溶液温度，终态溶液温度≥32℃以上，得温度响应性可逆水凝胶；终态溶液温度＜32℃时，得温度响应性可逆水凝胶的溶胶，如图2所示，而单一多肽溶液及单一pnipam溶液升温前后皆保持良好流动性，不能形成水凝胶。
载药：以阿霉素dox为模型药物，将0.05-2.0mg/mldox加入终态溶液，搅拌，使充分溶解，放置大于2小时，使药物分子与i3k纤维充分作用，负载到纤维之上，得负载药物的混合溶液，负载药物的i3k纤维如图3所示。
药物释放：将负载药物的混合溶液升温至37℃形成负载药物的温度响应性可逆水凝胶，将上述负载药物的温度响应性可逆水凝胶放入37℃的纯水或缓冲溶液中，放置一定时间后取出200μl上层清液，测定其中的dox浓度，计算释放量，同时向混合溶液中重新加入200μl纯水；重复此过程，释放的dox量随时间的变化曲线如图4所示。通过图4可看出，本发明的可逆“溶胶-凝胶”体系负载的药物分子在凝胶状态下可以实现高效可控的释放。