本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法。
背景技术：
胶原蛋白是脊椎动物细胞外基质中的一个重要组成部分，是哺乳动物中最丰富的蛋白质，约占总蛋白含量的20％～30％。由于胶原蛋白具有显著的成纤维结构，良好的生物降解性，优越的生物相容性及较低的抗原性等优点，其已经广泛运用到美容业、制药业、食品、生物医学领域上。胶原蛋白的三股螺旋结构，使细胞能吸附、迁移于胶原蛋白基上，甚至调节和促进细胞的分化，作为重要的细胞外基质，胶原蛋白有助于维持组织或器官的稳定性，并维持它们功能的完整性。可见，三股螺旋结构是胶原蛋白生物活性的一个重要标志，是其发挥功能特性的前提。然而，天然的胶原蛋白的三股螺旋结构极易受加工环境的影响，在胶原蛋白生产加工不可避免会引入物理热、机械搅拌、剪切、化学试剂等，这会对胶原蛋白的三股螺旋结构造成部分破坏甚至完全破坏，导致其失去天然的生物活性功能。
目前，胶原蛋白三股螺旋结构定性的检测方法主要为圆二色谱法、红外光谱法，如胶原蛋白的圆二色谱特征为：在约198nm处有一个强的负吸收，在约220nm处有一个较弱的正吸收，吸收的强度能反应胶原蛋白三螺旋结构的保留程度；又如红外光谱法通过观测特定键能的吸收反应蛋白质的二级结构变化。然而，以上方法都只能通过与参照物对比，定性的判断胶原蛋白中三螺旋结构的破坏程度，而无法定量检测三股螺旋结构的含量。
除此之外，专利号cn106383232“一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法”公开了一种胶原蛋白三重螺旋结构的检测方法，但是该方法存在如下缺陷：1)制备荧光探针时操作复杂；2)该方法通过探针多肽与待测多肽形成胶原蛋白三重螺旋结构，进而检测此三重螺旋结构，并非检测体系中本存在的胶原蛋白三股螺旋结构；3)众所周知，粘度大是胶原溶液的一个特性，但该方法较难测定高粘度的胶原体系中三股螺旋结构的含量。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，在胶原蛋白样品液中加入胰蛋白酶进行酶解反应后，利用三氯乙酸沉淀法分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白，通过测定酶解前后胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，计算酶解后分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨酸的含量与酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量的比值，从而得到样品中具有三股螺旋结构的胶原蛋白的含量。
本发明利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构完全破坏或部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过检测胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化，计算得到胶原蛋白中具有完整三股螺旋结构的含量。本发明的检测方法弥补了现有技术仅能定性检测胶原蛋白三股螺旋结构的缺陷，且操作方法简单，不受胶原体系粘度大的影响。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，包含以下步骤：
(1)将样品液的ph调节为3.6～3.7，备用；
(2)将胰蛋白酶液加入样品液中，混合均匀，得到待酶解体系液；
(3)称取部分取待酶解体系液，加入盐酸溶液，水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，得到酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量；
(4)将取样后的待酶解体系液置于恒温振荡条件下进行酶解反应；
(5)称取酶解后溶液，利用三氯乙酸沉淀法处理分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白沉淀与上清液，将沉淀或上清液水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨的含量与酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量的比值。
本发明中酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量即为酶解前胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，酶解反应后，具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构破坏/部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解成为多肽，其分子质量比胶原蛋白的分子质量小得多，且容易被三氯乙酸溶液溶解，通过离心，未被酶解的胶原蛋白难溶于三氯乙酸溶液并沉淀于底部，而多肽溶解在上清液中，因此通过测定蛋白沉淀的水解液中羟脯氨酸含量，可以计算出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白含量。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，胰蛋白酶液的配置方法为：称取胰蛋白酶，加入含0.05mcacl2的0.001mhcl溶液中。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:20～1:100。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，酶解温度为15～30℃，振荡转速为50～120rmp，酶解时间为1～24h。
上述技术方案中，发明人经过多次试验，通过优选胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比、酶解温度、振荡转速和酶解时间等参数，使胶原中三股螺旋结构破坏/部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶充分酶解成为多肽，提高检测结果的准确性。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(5)中，处理分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白沉淀与上清液的步骤为：往酶解后溶液中加入4℃的质量浓度为10％～30％的三氯乙酸溶液，酶解后溶液与三氯乙酸溶液的质量比为1：0.5～2，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(5)中，选择沉淀处理：弃去上清，用4℃的质量浓度为10％三氯乙酸溶液清洗沉淀表面3次后，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量，样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量按式(1)计算：
式中：
nc—样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量，单位为％；
x1—酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，x2—酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，单位为mg/g。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，所述步骤(5)中，选择上清液处理：称取上清液，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量按式(2)计算：
式中：
nc—样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量，单位为％；
x1—酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，x2—酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，单位为mg/g。
作为本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法的优选实施方式，水解结束后，采用waters氨基酸衍生法、紫外分光光度法或氨基酸分析仪法测定水解液中羟脯氨酸的含量。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1)本发明弥补了现有定性检测胶原蛋白三股螺旋结构方法的不足，提供了利用胰蛋白酶酶解定量检测胶原蛋白三股螺旋结构的含量的方法；
2)本发明通过定量检测胶原蛋白三股螺旋结构，从而定量的判断胶原蛋白在各种工艺条件下胶原三股螺旋结构破坏的程度；
3)本发明适用于含胶原蛋白的复杂生物体系，特异性强，结果重现性好，可作为胶原基类产品开发过程检测的应用手段。
附图说明
图1为本发明利用胰蛋白酶酶解法检测胶原蛋白三股螺旋结构原理示意图。
图2胶原蛋白液及明胶液在25℃酶解的凝胶电泳图，其中，c0h25℃中的c表示胶原液，0h表示的是酶解0h，25℃表示在25℃酶解，以此类推；此外，g表示明胶液在胰蛋白酶下的酶解，s为胶原蛋白标准品。
图3胶原蛋白在30和37℃酶解的凝胶电泳图，其中，c0h30℃中的c表示胶原液，0h表示的是酶解0h，30℃表示在30℃下酶解，以此类推；此外，g表示明胶液在胰蛋白酶下的酶解。
图4胶原样品的圆二色谱图。
图5胶原样品的红外吸收光谱图。
图6胶原样品的热焓图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为本发明利用胰蛋白酶酶解法检测胶原蛋白三股螺旋结构原理示意图。本发明通过在胶原蛋白样品液中加入胰蛋白酶进行酶解反应后，三股螺旋结构破坏的胶原蛋白经胰蛋白酶酶解变成多肽，利用三氯乙酸沉淀法分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白，通过测定酶解前后胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，计算酶解后分离出具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白中羟脯氨酸与酶解前胶原蛋白样品液中羟脯氨酸含量的比值，从而得到样品中具有三股螺旋结构的胶原蛋白的含量。
本发明所述的定量检测胶原蛋白三股螺旋结构含量的方法，包括以下步骤：
(1)取50ml的样品液置于150ml锥形瓶中，用0.5m的醋酸溶液或naoh溶液调节样品液ph为3.6～3.7；
(2)胰蛋白酶液的配置：称取胰蛋白酶，加入含0.05mcacl2的0.001mhcl溶液中，得到胰蛋白酶液；
(3)在样品液中加入1ml的胰蛋白酶液，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:20～1:100，搅拌均匀，得到待酶解体系液；
(4)酶解前样品的处理：准确称取待酶解体系液于水解管中，加入盐酸溶液，水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量；
(5)将取样后的待酶解体系液置于恒温振荡条件下进行酶解反应；
(6)酶解后样品的处理：称取酶解后液体，加入4℃的质量浓度为10％～30％的三氯乙酸溶液，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min分离沉淀与上清液；选择上清液或者沉淀进行处理，选择后操作如下：
①选择处理的是沉淀操作：弃去上清，用4℃的质量浓度为10％的三氯乙酸溶液清洗沉淀表面3次后，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量，样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量按式(1)计算：
式中：
nc—样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量，单位为％；
x1—酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量即待酶解体系液中胶原蛋白总含量，单位为mg/g；
x2—酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，即待酶解体系液中具有完整三螺旋结构的胶原蛋白含量，单位为mg/g。
②选择处理的是上清液操作：称取上清液，加入盐酸溶液，水解，测定水解液中羟脯氨酸的含量样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量按式(2)计算：
式中：
nc—样品中胶原蛋白三股螺旋结构的含量，单位为％；
x1—酶解前待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，即待酶解体系液中胶原蛋白总含量，单位为mg/g；
x2—酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，即待酶解体系液中三螺旋结构破坏的胶原蛋白含量，单位为mg/g；
上述式(1)和(2)中，
c1—酶解前水解液中羟脯氨酸的含量，单位为mg/g；
c3—酶解后水解液中羟脯氨酸的含量，单位为mg/g；
m1—酶解前水解液的质量，单位为g；
m2—酶解前待酶解体系液的取样量，单位为g；
m3—酶解后水解液的质量，单位为g；
m4—酶解后液体的取样量，单位为g。
本发明采用waters氨基酸衍生的方法、紫外分光光度法或氨基酸分析仪法测定水解液中羟脯氨酸的含量。
本发明可根据现有的胶原蛋白水解方法，调整合适的水解温度和水解时间，将胶原蛋白充分转变为氨基酸。
实施例1胰蛋白酶酶解温度的确定
各取2份50ml浓度为4mg/ml的胶原蛋白溶液，一份置于60℃水浴锅中加热10min以破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，后冷却至25℃，制备得明胶液；另一份备用。将两份溶液分别用0.5m醋酸溶液调节ph为3.7，加入胰蛋白酶液，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:20，置于25℃振荡，转速为95±2rmp，酶解24h。间断时间取样于分离胶为8％的凝胶电泳中分析，结果如图2所示，在25℃酶解24h，胶原蛋白液的β链和α链均不发生降解，而明胶液在胰蛋白酶的作用下，随着酶解时间的延长，α链及其以下的条带逐渐变小直至消失。可见，胰蛋白酶的酶解温度可以为25℃。
图3为胶原蛋白在30和37℃酶解的凝胶电泳图。发明人经过试验发现，分别在25℃和30℃酶解24h，胶原蛋白液的β链和α链均不发生降解；而明胶液在胰蛋白酶的作用下，随着酶解时间的延长，α链及其以下的条带逐渐变小直至消失。而在37℃下，随着酶解时间的延长，胶原蛋白的主要特征条带(γ，β和α)颜色逐渐变浅，这说明溶液胶原蛋白完整条带逐渐被酶降解。根据胶原蛋白的热变性可知，在高于胶原蛋白的变性温度时，胶原蛋白的三螺旋结构会部分破坏甚至全部破坏；而当酶解温度过低，酶活力将下降，酶解时间会延长。因此酶解温度需低于该类胶原蛋白的变性温度。
综上，本发明中胰蛋白酶的酶解温度优选为15℃～30℃；酶解时间优选为1～24h。
实施例2胰蛋白酶酶解后使用沉淀或者上清液计算的结果汇总
(1)取浓度为4.0mg/ml的胶原蛋白液用4℃蒸馏水稀释为1.0mg/ml，备用；各取50ml浓度分别为4.0mg/ml和1.0mg/ml的胶原蛋白，用0.5m醋酸溶液调节溶液ph为3.7±0.05。各加入胰蛋白酶液，其中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:40，搅拌均匀后，得到待酶解体系液，待处理；
(2)分别取2.00±0.005g待酶解体系液于水解管中，加入5ml浓度为8.4m的盐酸溶液后，置于110℃水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量，即待酶解体系液中胶原蛋白总含量；
(3)将取样后的胶原蛋白液至于25℃振荡，转速为95±2rmp，酶解4h；
(4)酶解后样品的处理：分别准确称取2.00±0.005g酶解后液体，加入1.00±0.005g的4℃的质量浓度为30％的三氯乙酸溶液，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min分离沉淀与上清液。选择上清液或者沉淀进行处理，选择后操作如下：
①选择处理的是沉淀操作：弃去上清，用4℃的质量浓度为10％三氯乙酸溶液洗沉淀表面3次，加入5ml浓度为6m的盐酸溶液，于110℃水解24h。
②选择处理的是上清液操作：准确称取2.00±0.005g的上清液，加入5ml浓度为8.4m的盐酸溶液，于110℃水解24h。
(5)水解结束后，使用waters氨基酸衍生的方法分别测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算酶解前和酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，使用沉淀根据式(1)计算得到样品液中三股螺旋结构胶原蛋白的含量，使用上清液根据式(2)计算得到样品液中三股螺旋结构胶原蛋白的含量。
如表1所示，在该方法下，无论使用沉淀还是上清液计算，胶原蛋白中三股螺旋结构的含量不存在显著性差异；此外，同一胶原样品稀释为不同的浓度，在该方法下所得到的胶原蛋白中的三股螺旋结构的含量无显著性差异。
本实施例的步骤(3)中，将振荡转速分别调整为50rmp和120rmp也能够保证胶原蛋白充分酶解反应。
表1酶解后样品使用沉淀和上清液所计算得到的胶原蛋白中三股螺旋的含量
实施例3复杂体系中胶原蛋白三股螺旋结构的含量
(1)取胶原蛋白溶液，置于60℃水浴锅中加热10min以破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，后冷却至25℃，制备得明胶液；分别用制备的明胶液和胶原液配制明胶胶原液的混合液，混合比例如表2所示；
(2)各取50ml的混合液用0.5m醋酸溶液调节溶液ph为3.7±0.05，分别加入胰蛋白酶液，其中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:100，搅拌均匀后，得到待酶解体系液，待处理；
(3)分别取2.00±0.005g待酶解体系液于水解管中，加入5ml浓度为8.4m的盐酸溶液后，置于110℃水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量；
(4)将取样后的待酶解体系液至于30℃酶解1h；酶解结束后分别称取2.00±0.005g酶解后液体，加入1.00±0.005g4℃的质量浓度为30％三氯乙酸溶液，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min分离沉淀与上清液。弃去上清，用4℃的质量浓度为10％三氯乙酸溶液洗沉淀表面3次，加入盐酸溶液后，置于110℃水解。
(5)水解结束后，使用液相色谱柱前衍生法分别测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算酶解前和酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，进而根据式(1)计算得到样品液中三股螺旋结构胶原蛋白的含量。
如表2所示，在明胶胶原的混合液体系中，该方法能较准确的测定复杂体系中胶原蛋白三股螺旋的含量。
表2不同百分含量明胶胶原混合液中三股螺旋的含量
实施例4不同加工处理胶原蛋白三股螺旋结构的含量
(1)分别取经过0.1μm(超滤处理1)和0.2μm(超滤处理2)的滤膜透析处理的胶原蛋白溶液，用0.5m醋酸溶液调节溶液ph为3.7±0.05，各加入胰蛋白酶液，其中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:80，搅拌均匀后得到待酶解体系液，待处理；
(2)分别称取待酶解体系液于水解管中，加入盐酸溶液后，置于110℃水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量；
(3)将取样后的待酶解体系液置于15℃中，以50rmp的转速振荡酶解24h；
(4)酶解结束后，分别称取酶解后液体，加入4℃的质量浓度为10％三氯乙酸溶液，酶解后液体与三氯乙酸溶液的质量比为1:2，振荡10s混合均匀后，在4℃下，5000rmp离心10min分离沉淀与上清液。弃去上清，用4℃的质量浓度为10％的三氯乙酸溶液洗沉淀表面3次，加入盐酸溶液后，置于110℃水解。
(5)水解结束后，使用紫外分光光度法分别测定水解液中羟脯氨酸的含量，计算酶解前和酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，进而根据式(1)计算得到样品液中三股螺旋结构胶原蛋白的含量。
如表3所示，在超滤膜为0.1μm时，胶原蛋白的三股螺旋结构会遭到破坏。
表3不同工艺处理后胶原蛋白三股螺旋结构的含量
实施例5不同提取批次的粘度高的胶原蛋白三股螺旋结构的含量
(1)分别取三批次(20171120、20171121和20171217)从牛跟腱中提取的胶原蛋白粘稠溶液(粘度约为4000mm2/s)，用0.5m醋酸溶液调节溶液ph为3.7±0.05，分别加入胰蛋白酶液，其中，胰蛋白酶与样品液总蛋白的质量比1:50，搅拌均匀后得到待酶解体系液，待处理；
(2)分别取待酶解体系液于水解管中，加入盐酸溶液后，置于110℃下水解后，测定水解液中羟脯氨酸的含量；
(3)将取样后的待酶解体系液置于25℃，以120rmp的转速振荡酶解4h；
(4)酶解结束后分别称取酶解后液体，加入4℃的质量浓度为20％的三氯乙酸溶液，酶解后液体与三氯乙酸溶液的质量比为1:1，振荡10s混合均匀后，在4℃，5000rmp离心10min分离沉淀与上清液。弃去上清，用4℃的质量浓度为10％的三氯乙酸溶液洗沉淀表面3次，加入盐酸溶液后，置于110℃水解。
(5)水解结束后，使用氨基酸分析仪法分别测定水解液中羟脯氨酸的含量，分别根据待酶解体系液和酶解后液体的取样用量，计算酶解前和酶解后待酶解体系液中羟脯氨酸的含量，进而根据式(1)计算得到样品液中三股螺旋结构胶原蛋白的含量。
以20171120批次提取的胶原蛋白液为样品，使用圆二色谱(cd)、红外光谱(ftir)及差式扫描量热仪(dsc)分别测定该样品的二级结构、特征吸收峰及热变性温度，与本专利方法对比。
如表4所示，本方法能对提取的粘稠胶原蛋白液中的三股螺旋结构进行检测，解决现有方法较难测定高粘度的胶原体系中三股螺旋结构的含量的问题。此外，与现有的cd、ftir和dsc对比发现：图4中的胶原蛋白液在198nm处有一负吸收，在222nm处有一正吸收，符合胶原蛋白的典型吸收波长，说明该批次胶原蛋白液的三股螺旋结构较完整；而在ftir图谱(图5)中显示，样品的酰胺ii键(1638cm-1)及酰胺iii键(1239cm-1)的吸收均符合胶原蛋白完整二级结构的特征吸收，说明胶原蛋白的三股螺旋结构相对完整；图6显示，该批次胶原蛋白的热变性温度41.90℃，热焓为1.843j/g，符合典型具有完整三股螺旋结构胶原蛋白的热变性温度。但是上述这些方法都只能定性的判断胶原蛋白的三股螺旋结构存在与否，不能定量的判断其三股螺旋结构的含量。结合本方法弥补了现有定性检测方法的不足。
表4不同提取批次高粘度胶原蛋白液中三股螺旋结构的含量
综上所述，本发明利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构完全破坏或部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化计算得胶原蛋白完整三股螺旋结构的含量，弥补了现有检测方法定性检测胶原蛋白三股螺旋结构的不足。本发明可以通过定量检测胶原蛋白三股螺旋，从而定量的判断胶原蛋白在各种工艺条件下三股螺旋破坏的程度。本发明适用于含胶原蛋白的复杂生物体系，特异性强，结果重现性好，操作简单，可作为胶原类产品开发过程检测的应用手段。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。