技术领域
本发明总体涉及用于检测、鉴定和任选定量分离的多核苷酸群体诸如从生物样品中获得的分离的多核苷酸群体内的核酸区段的组合物和方法。具体而言，本发明的组合物和方法可以在环境温度维持长时间而不损害组分的完整性或分析的保真度。
背景技术：
分枝杆菌是单细胞、需氧的革兰氏阳性细菌。通常，分枝杆菌具有厚疏水性细胞壁且缺乏外细胞膜。分枝杆菌引起的感染在宿主内可以是活跃的，或潜伏且无症状的。多药耐药菌株的出现，对延长的抗菌治疗的需求和患者的差依从性，使得分枝杆菌感染的治疗变得困难，特别是在发展中国家中。具体而言，结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的多药耐药(MDR)菌株的出现已经使TB的诊断和治疗在发展中非洲人群中变得高度优先。
分枝杆菌通常由于其缺乏外细胞膜而被归类为抗酸革兰氏阳性细菌。经常使用的抗酸染色方法是Ziehl-Neelsen染色或Kinyoun方法。它们通常无法很好地保留结晶紫染色，因此不被认为是革兰氏阳性细菌的典型代表。然而，它们的确含有独特的细胞壁结构，所述细胞壁结构比大多数其他细菌物种中存在的细胞壁结构更厚。通常，杆形细胞壁由疏水霉菌酸酯层(含有霉菌酸)和通过阿拉伯半乳聚糖(一种多糖)保持在一起的肽聚糖层组成。该细胞壁结构有助于分枝杆菌在环境急剧变化之后存活的能力，并且有助于分支杆菌物种的耐寒性，以及在治疗结核病和麻风病患者(这两者都是由不同分枝杆菌物种引起的)中的难度。霉菌酸是形成生物体周围的脂质壳并且影响在细胞表面的渗透性特性的强疏水性分子。霉菌酸被认为是在一些分枝杆菌物种中显著的毒力决定因素。最可能地，它们防止阳离子蛋白、溶菌酶和吞噬颗粒中的氧自由基对分枝杆菌的攻击。它们还保护细胞外分枝杆菌免于血清中的补体沉积。
此外，分枝杆菌典型地是缓慢生长的生物体，这促进了培养物种的难度。由于它们独特的细胞壁，它们在长期暴露于酸类、碱类、去污剂类、氧化爆发、补体裂解、和许多抗生素之后可以存活。大多数分枝杆菌易受抗生素克拉霉素和利福霉素的影响，但已经出现了抗生素耐药菌株。
结核分枝杆菌复合群的成员，即，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M. bovis)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、M. cannetti、M. caprae和M. pinnipedi，结核病的病原体，具有分枝杆菌的所有上述特征。在人中分枝杆菌感染(和特别是分枝杆菌属的一种或多种物种的感染)的主要后果是结核病(TB)，这是“结核分枝杆菌复合群”的成员引起的接触性感染，所述“结核分枝杆菌复合群”的成员包括，例如，物种的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M. bovis)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、M. cannetti、M. caprae和M. pinnipedi的致病性菌株。结核病通常攻击哺乳动物宿主的肺部，但也可以扩散到机体的其他器官和区域，包括，例如，骨、关节、肾脏和腹部等。结核分枝杆菌复合群的成员在遗传上密切相关，并且在属间具有高度保守的16S rRNA序列。
TB可以通过在来自受感染人的咳嗽或喷嚏的空气液滴中呼吸而获得。因此，收集怀疑含有结核分枝杆菌复合群的成员的生物样品包括收集来自怀疑被其感染的患者的痰。痰是来自呼吸道的咳出痰，并且理想地含有很少或几乎不含唾液或鼻分泌物，以避免口腔细菌污染痰样品。痰主要含有粘液，这是富含糖蛋白的粘性胶体。怀疑具有结核病的患者通常具有增加的粘液粘度，以及增加的粘液产生。除了粘液，痰可含有血液，即可能出现咯血，和/或脓液，即，本质上是脓性的。活跃结核感染的症状可以包括慢性咳嗽(通常痰中带血)、发热、夜间多汗症、慢性疲劳、苍白、体重下降、恶病质性浪费(cachectic wasting)(“消耗”)。其他症状可以包括呼吸困难、胸痛和气喘(“Pulmonary Tuberculosis,” PubMed Health)。如果吸入的结核杆菌居于肺部肺泡，则发生感染，随后是肺泡毛细管扩张和内皮细胞肿胀。肺泡炎导致结核杆菌的细胞内复制和多形核白细胞进入肺泡。生物体然后通过淋巴系统扩散到循环系统，然后扩散到整个身体。
尽管结核分枝杆菌在美国每年感染少于200,000人，但是根据世界卫生组织(WHO)，全球近二十亿人可能被感染，其中90％在感染后可以维持多年无症状。如果不进行治疗，TB在>50%的受感染群体中是致命的，并且在该疾病的散播性形式中，死亡率接近90％。
因为TB感染慢性且持久虚弱，所以与一种或多种第二种病原体(特别包括人免疫缺陷病毒(HIV))的共感染也是普遍的。在2007年，有至少1.37百万例HIV-阳性TB，主要集中在其中诊断和治疗往往有限、无效和/或成本高昂的出现群体中。
TB感染的常规诊断通常依赖于体检(例如，慢性持续性咳嗽，扩大或脆弱淋巴结，胸腔积液，异常呼吸音，并且，在疾病的后期阶段，手指或脚趾的特征性“杵状指(clubbing)”)和诊断测试(例如，痰液检查，样本的微生物培养和核酸检测，支气管镜检，胸部的CT扫描或X射线，肺活检，胸腔穿刺术，干扰素-γ(gamma)血液测试和结核菌素皮肤试验)的组合。
TB诊断的“标准”，分枝杆菌生物体的细胞培养，是困难的，部分原因是它们的传代时间长，即对于结核分枝杆菌为24小时。此外，分枝杆菌通常以低水平存在于受感染的个体中。因此，从临床样本培养可花费四至八周之间的任何时间，在该时间期间，患者可能变得病重并感染给其他人。此外，细胞培养需要收集、运输和保存样品中的活分枝杆菌生物体，直至诸如可以在实验室环境中分析样品的时间。在TB流行和健康护理极少的国家中，这可能不是一个选项，因此增加了传播感染的风险。
不幸的是，对于医疗护理获得受限的地区，全血必须在获得样品的12小时内进行分析，并且还没有对具有其他医疗状况(诸如HIV、AIDS、糖尿病、矽肺病、慢性肾衰竭、血液病症)的患者、已经对TB感染进行治疗的个体分析测试的有效性，也没有对怀孕个体或未成年人进行过测试(“Clinicians Guide to QuantiFERON® -TB Gold,” Cellestis)。其他非培养方法，诸如放射免疫测定法、胶乳凝集法和酶联免疫吸附测定(ELISA)对于证实生物样品中结核杆菌的存在的使用的成功程度有限。
大多数临床诊断实验室采用传统培养用于病原体鉴定，这对于大多数病毒通常需要3-7天，并且对于一些细菌菌株需要更长时间，包括用于培养结核分枝杆菌的多达约21天。传统培养需要活微生物的样本收集、冷冻运输、和潜在感染性和经常未知生物微生物的传播和处理。此外，许多感染性物质，例如，高度致病性禽流感、SARS、结核分枝杆菌复合群等是BSL-3级病原体，其需要专门设施和注意事项进行分析。在获得、运输和保持高质量活生物样本进行培养中存在挑战。样本必须使用冷链(最常见干冰)进行运输。使用商业运输从远处或跨国界运输潜在感染性样品可能是昂贵且繁琐的，特别是当样品必须在冷冻的情况下接受时。
收集是需要检测来自微生物的可能微量核酸的诊断平台或分子方案的第一步。无论所使用的核酸试验或RNA/DNA提取方案，样本收集，特别是潜在感染性病原体的灭活和病原体RNA/DNA的保存和稳定性，仍然在临床诊断中保持关键差距，特别是用于在世界各地使用。
通常，怀疑具有结核病的患者被要求用力咳嗽，然后咳出进入样本杯，以获得痰样品。通常，该程序在通风良好的区域进行，以尽量减少传播感染性分枝杆菌的可能性。患者可能被要求重复该程序以收集足够痰液用于分析，通常为约5 mL至约20 mL的量。通常，收集的痰样品是冷藏的，直到可以进行进一步分析程序，诸如细胞培养或去污染程序，以灭活或杀死样品中包含的任何微生物。为了检测痰样品中的结核分枝杆菌，需要过量的10,000个微生物/每mL痰液以便用100X显微镜物镜(1000X放大)显现杆菌。来自结核病患者的痰样品的直接涂片显微镜检查通常被视为用于监测患者对治疗的响应的有效工具。通常，将在痰的脓性部分中发现更抗酸的杆菌。
临床分子诊断领域随着聚合酶链式反应(PCR)和随后的实时PCR的出现而急剧变化。实时(RT-PCR)和实时逆转录PCR (rRT—PCR)可在数小时内提供优异的灵敏度和特异性结果。因此，目前大多数诊断实验室已经从传统培养转变为核酸检测(NAT)，诸如实时PCR。
TB的核酸扩增检测包括使用标准聚合酶链式反应(PCR)技术来检测患者样品中的分枝杆菌DNA，使用核酸探针来鉴定培养物中的分枝杆菌，使用限制性片段长度多态性(RFLP)分析来比较TB的不同菌株用于流行病学研究，和使用基于基因的敏感试验来鉴定分枝杆菌的耐药菌株。已经测序并公开了结核分枝杆菌的全基因组；目前两种TB的基于核酸扩增的测试已经由美国食品和药物管理局(FDA)在美国批准使用。第一种被称为“增强型扩增结核分枝杆菌直接试验(Enhanced Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test)” (E-MTD, Gen-Probe, San Diego, CA, USA)被批准用于在来自怀疑具有TB的患者的涂片阳性和涂片阴性的呼吸道样本两者中检测抗酸杆菌中的结核分枝杆菌复合群细菌。E-MTD测试将16S rRNA部分的等温转录介导的扩增与使用对于结核分枝杆菌复合群细菌特异性的杂交探针的检测方法相组合。第二种被称为AMPLICOR®结核分枝杆菌测试(AMPLICOR®, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)已经被批准用于只有在来自怀疑具有TB的患者的涂片阳性的呼吸道样本中检测结核分枝杆菌复合群细菌。本试验采用PCR来扩增16S rRNA基因的含有与对于结核分枝杆菌复合群细菌特异性的寡核苷酸探针杂交的序列的部分。
结果已经表明，这些测试的灵敏度和特异性倾向于根据地理位置和风险因素而变化。此外，这些技术需要复杂的实验室条件和设备来进行，因此降低了测试的速度和灵敏度。对于这些和其他原因，本领域中仍然需要用于检测临床样品中分枝杆菌病原体的可靠和准确方法，和特别是用于在现场应用、远程位置、和在其中常规实验室缺乏且经济资源有限的发展中国家中快速鉴定此类病原体的方法。具体而言，用于安全收集、处理和转运致病样本的组合物，以及用于快速检测和准确鉴定此类样本中的TB特异性核酸的基于分子生物学的方法是高度期望的。
技术实现要素：
本发明克服了与当前策略和设计相关的问题和缺点，并且提供了用于检测和鉴定核酸序列的新组合物、工具和方法。
本发明的一个实施方案涉及用于检测生物样品中的微生物的PCR即用组合物(PCR-ready compositions)，其包含组分：以约0.05U至约1 U的量存在的热稳定聚合酶；包含以约0.1 mM至约1 mM的浓度共同存在于组合物中的约等量的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；以约0.01 mM至约1 mM的浓度存在于组合物中的选自乙二醇四乙酸、羟基乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、和它们的任何组合的螯合剂；以约1 mM至约1 M的浓度存在于组合物中的选自N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)、二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油、非离子型去污剂、聚乙二醇、四甲基氯化铵和它们的任何组合的PCR摩尔渗透压浓度试剂；以约5 ng/ml至约100 ng/ml的浓度存在于组合物中的选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、山羊血清白蛋白、哺乳动物白蛋白、和它们的任何组合的白蛋白；以约50 mM至约1 M的浓度共同存在于组合物中的至少两种盐，第一种是选自氯化钾和谷氨酸钾的钾盐，且第二种是选自氯化镁和硫酸镁的镁盐；和以约1 mM至约1 M的浓度存在于组合物中的选自三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐和它们的任何组合的缓冲剂，且pH为约6.5至约9.0，其中缓冲剂的pKa 在选择的温度下在pH 的约一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合。优选地，热稳定聚合酶是Taq聚合酶、高保真聚合酶、Pfu聚合酶、热启动聚合酶或下一代聚合酶。优选地，组合物进一步包含选自荧光素、5-羧基-X-罗丹明和ROX的一种或多种染料。优选地，缓冲剂或整个组合物的pH为约6.5至约7.5，并且缓冲剂的pKa 在环境温度下在缓冲剂的pH 的0.5之内，更优选地缓冲剂的pKa在环境温度下在缓冲剂的pH 的0.2之内。优选地，组合物进一步包含配置成通过PCR扩增对微生物特异性的核酸序列的PCR引物对，所述PCR引物对以约0.5 µM至约50 µM的浓度共同存在于组合物中，其中各PCR引物为约5个至约50个核苷酸长度。更优选地，PCR引物对中的各引物为约18个至35个核苷酸长度。优选地，待检测的微生物是可以是细菌、病毒、真菌或寄生病原体的病原体。更优选地，细菌是分枝杆菌，或病毒是流感病毒，诸如，例如流感病毒株H1N1、H2N2、H3N3 或H5N1。优选地，组合物进一步包含以约1 fg至约1 ng的浓度存在的对照核酸，所述对照核酸提供了PCR扩增的定性或定量的量度。优选的对照核酸包含，例如，SEQ ID NO 8的序列，SEQ ID NO 12的序列，或SEQ ID NO 21的序列。优选地，组合物可进一步包含检测探针，诸如，例如，与对微生物特异性的PCR扩增的核酸序列特异性结合的检测探针。本发明的一种优选组合物含有约50 mM TRIS；约70 mM氯化钾；约3 mM硫酸镁；约45 mM甜菜碱；约0.03 μg/mL牛血清白蛋白；约0.1 mM EDTA；约0.05 μM染料；约8 µM PCR引物对。优选地，PCR引物对的一条引物包含SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 5的核酸序列，并且PCR引物对的另一条引物包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6的核酸序列。还优选的是以下组合物，其中检测探针是约20个至约35个核苷酸长度的分枝杆菌特异性序列，并且包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 7的序列。
本发明的另一个实施方案包含用于检测生物样品中的微生物的PCR即用组合物，其包含组分：热稳定聚合酶；包含约等量的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；螯合剂；PCR摩尔渗透压浓度试剂；白蛋白；至少两种盐；和以至少50 mM的浓度存在于组合物中且具有约6.5至约9.0的pH的缓冲剂，其中缓冲剂的pKa 在选择的温度下在pH 的约一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合。优选地，所述热稳定聚合酶以约0.05U至约10 U的量存在；所述脱氧核苷酸三磷酸的混合物以约0.1 mM至约10 mM的浓度存在于组合物中；所述螯合剂以约0.01 mM至约10 mM的浓度存在于组合物中；所述PCR摩尔渗透压浓度试剂以约1 mM至约10 M的浓度存在于组合物中；所述白蛋白以约5 ng/ml至约1 mg/ml的浓度存在于组合物中；所述至少两种盐以约50 mM至约10 M的浓度共同存在于组合物中；且所述缓冲剂以约1 mM至约10 M的浓度存在于组合物中。
本发明的另一个实施方案涉及用于检测生物样品中的微生物的方法，所述方法包括：将生物样品与权利要求1-22中任一项的组合物接触以形成混合物；对混合物进行多个热循环步骤，以形成源自对微生物特异性的核酸的扩增产物；检测是否存在扩增产物来确定生物样品中是否存在微生物。优选地，所述方法进一步包括检测对照核酸的扩增序列，并且确定从多个热循环步骤发生的扩增的质或量。还优选地，所述生物样品包含从个体获得的生物材料、一种或多种离液剂、一种或多种去污剂、一种或多种还原剂、一种或多种螯合剂和一种或多种缓冲剂。
本发明的另一个实施方案涉及提供检测生物样品中的微生物的方法，其包括提供PCR即用组合物，所述组合物包含组分：以约0.05U至约1 U的量存在的热稳定聚合酶；以约0.1 mM至约1 mM的浓度共同存在于组合物中的包含约等量的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；以约0.01 mM至约1 mM的浓度存在于组合物中的一种或多种螯合剂；以约1 mM至约1 M的浓度存在于组合物中的一种或多种PCR摩尔渗透压浓度试剂；以约5 ng/ml至约100 ng/ml的浓度存在于组合物中的一种或多种白蛋白；和以约50 mM至约1 M的浓度存在于组合物中的一种或多种盐；和以约1 mM至约1 M的浓度存在于组合物中的一种或多种缓冲剂，pH为约6.5至约9.0，其中缓冲剂的pKa 在选择的温度下在pH 的约一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合。优选地，缓冲剂的pH为约6.5至7.5，并且pKa在环境温度下在pH 的约0.5个单位之内。优选地，所述方法进一步包括将生物样品与组合物接触，并且对混合物进行热循环反应。优选地，所述一种或多种螯合剂包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或它们的任何组合，一种或多种PCR摩尔渗透压浓度试剂包括N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)、二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油、非离子型去污剂、脱氧肌苷、甘油、7-脱氮脱氧鸟苷三磷酸、氢氧化钠、聚乙二醇、四甲基氯化铵、或它们的任何组合，所述一种或多种白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、山羊血清白蛋白、哺乳动物白蛋白、或它们的任何组合，所述一种或多种盐包括氯化钾、谷氨酸钾、氯化镁、硫酸镁和它们的任何组合，所述一种或多种缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐或它们的任何组合。
本发明的另一个实施方案涉及包含在被配置用于添加生物样品和热循环的无菌容器内含有的本发明的组合物的试剂盒，和用于从热循环的结果确定是否存在病原体的说明书。
本发明的其他实施方案和优势部分描述在随后的描述中，并且部分地，可以从该描述是显而易见的，或可以从本发明的实施中获知。
附图说明
图1说明了来自以1:1比例在PrimeStore®中保存的阳性涂片痰样品的结核菌素DNA的实时(RT)PCR分析。此外，擦拭相同的涂片阳性痰样品，导致拭子上约50至约400微升样品，并且将拭子置于1.5 mL PrimeStore®中。根据制造商说明书使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒(AMPLICOR®, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)从每种PrimeStore®中的痰样品提取DNA。使用4微升提取的DNA用于根据制造商说明书使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒的实时PCR。对于各样品获得的Cτ值显示在表2中；
图2说明了来自PrimeStore®中保存的七份涂片阴性、培养阳性的痰样本和三份稀疏(即其中在载片上菌株几乎不可见的阳性涂片结果)的样本拭子的结核菌素DNA的实时(RT)PCR分析。根据制造商说明书使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒和Invitrogen™ iPrep™ Purelink™病毒试剂盒(Carlsbad, CA, USA)提取DNA。根据制造商说明书使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒。对于各样品获得的Cτ值显示在表8中；
图3显示PrimeMix® Universal MTB测定组分的RT-PCR分析图，所述PrimeMix® Universal MTB测定组分从-20℃温度储存中取出，并且在室温下放置不同次数，即，1、3、5和10次，然后用于PrimeMix® Universal MTB测定中；
图4显示了当使用用6-FAM (FAM)或VIC™染料标记的检测探针在PrimeMix®测定中检测单链DNA内部阳性对照(IPC)时的RT-PCR分析图；
图5显示了当在PrimeMix® Universal MTB测定中使用不同量的提取的结核病患者DNA(即2 μl、3 μl、4 μl、和5 μl模板DNA)时的RT-PCR分析图；
图6显示了当与单重测定(其中初始溶液仅含有从患者和储存溶液(即，PrimeStore®)获得的生物样品)相比进行多重PrimeMix® Universal MTB 测定(其中将单链DNA内部阳性对照(IPC)添加至含有结核菌素样品的溶液)时的RT-PCR分析图；
图7显示了当置于PrimeStore®中的内部阳性对照(“IPC”)的浓度变化(即，将10-5、10-6、10-7、和10-8 ng/μL IPC置于相同量的PrimeStore®)时的RT-PCR分析图。IPC的探针用6-FAM (“IPC Fam”)或VIC™染料(“IPC Vic”)标记。还进行多重反应，其中还将结核分枝杆菌复合群特异性引物和探针连同IPC引物和探针(结果显示在标记为“IPC Vic在多重中”栏)添加至PrimeMix®(结果显示在标记为“MTB在多重中”栏)；
图8显示了当结核分枝杆菌样品的初始量为15 μl和150 μl(10倍差异)(每种初始储存在1.5 mL PrimeStore®中)时的RT-PCR分析图。这用标记6-FAM (“IPC Fam”)和VIC™染料(“IPC Vic”)标记的IPC探针，以及结核分枝杆菌的单重检测(“MTB”)和结核分枝杆菌的多重检测(“MTB在多重中”)和其中用VIC™染料标记探针的IPC的多重检测(“IPC Vic在多重中”)来进行；
图9显示当各种分枝杆菌菌株(即，五种不同结核分枝杆菌菌株，两种不同的鸟分枝杆菌菌株，一种胞内分枝杆菌(M. intracellularae)菌株，一种岗地分枝杆菌(M. gondii)菌株和一种堪萨斯分枝杆菌菌株(M. kansasii))置于PrimeStore®中，然后从PrimeStore®中提取，然后使用PrimeMix®程序的单重(“MTB单重”)和多重(“MTB在多重中”)形式进行分析。单重测定仅使用结核分枝杆菌复合群特异性引物和探针，而多重测定使用结核分枝杆菌复合群特异性引物和探针和IPC-特异性引物和探针；
图10显示了当改变来自特定纯化的菌株的结核分枝杆菌的量(即10-4、10-3、10-2、10-1代表10倍稀释，其中10-1代表330 ng/μL的DNA浓度，10-2代表33 ng/μL的DNA浓度，10-3代表3.3 ng/μL的DNA浓度，且10-4代表0.33 ng/μL的DNA浓度)时的RT-PCR分析图。进行使用结核分枝杆菌复合群特异性引物和探针的PrimeMix® Universal MTB 测定的单重反应(结果显示在“MTB 单重”列中)，以及进行多重PrimeMix®测定(其中存在结核分枝杆菌复合群特异性引物和探针和IPC-特异性引物和探针) (结果显示在“MTB在多重中”和“IPC在多重中”列中)；以及
图11显示了当改变来自特定纯化的菌株的结核分枝杆菌的量(即10-4、10-3、10-2、10-1代表10倍稀释，其中10-1代表33 ng/μL的DNA浓度，10-2代表3.3 ng/μL的DNA浓度，10-3代表0.33 ng/μL的DNA浓度，且10-4代表0.033 ng/μL的DNA浓度)并且在IPC特异性探针上使用不同标记(6-FAM (“IPC Fam”)或VIC™染料(“IPC Vic”))时的RT-PCR分析图。
图12显示了比较非乙酰化的BSA (mg/mL终浓度)与循环阈值(CT)的表。
具体实施方式
本发明通过提供用于安全地收集、处理和运输怀疑含有致病性微生物的生物样品的有用、非显而易见且新的组合物，以及用于通过基于分子生物学的核酸检测快速检测、鉴定和定量那些病原体的方法而克服了现有技术中的这些和其他固有局限。具体而言，提供了用于特异性检测一株或多株致病微生物诸如细菌、病毒、真菌和寄生虫的方法。在具体应用中，本发明包括允许收集目标样本、制备用于测定的目标样本、从样本分离基因组物质、和随后处理基因组物质以鉴定生物样品中(如果存在)的一种或多种生物体的诊断产品。当与一种或多种样本收集设备结合时，本文公开的组合物允许安全收集、运输和储存生物样本，甚至对于在远程或“现场”应用中收集的样本，其中从样品收集至样品测定的时间可以是几小时至几天，或者甚至几周。
本发明进一步包括简化和加快样本收集、制备和分子检测微生物(特别是作为流感和结核病的病原体的那些微生物)的组合物和方法。在具体应用中，本发明包括以下诊断产品，借此收集、运输和快速制备样本用于下游PCR而不需要冷链或昂贵且费时的样品去污染和样品乳化。分子诊断产品包括在即用溶液或悬浮液中引物、探针和酶的热稳定、包括所有的PCR混合物。该诊断产品可用于具有高通量系统的中心实验室中，或用于具有极小能力且不存在可靠社区电力或者甚至用手持设备的农村或流动诊所中。本发明还包括用于直接来自收集点的现场样品或通过使用在环境温度的标准邮件的廉价、简化、安全的运输的流行病学和爆发监测、流行病和传染病追踪和微生物测序的方法。本发明还包括用于微生物(特别是病原体)的小心收集、快速提取和快速PCR检测的安全位点的诊断分子检测试剂盒。
使用本文公开的病原体特异性核酸检测探针和扩增引物，本发明还提供了收集的样品中病原体的容易鉴定，并且允许安全、成本有效且近期评价感染，包括，例如，作为针对潜在流行病的监控、监测爆发、评价受影响或处于危险群体中疾病进展和/或鉴定微生物的特定物种和/或菌株用于诊断测试或确定特定治疗方式中的工具。
在一个实施方案中，本发明提供了用于从怀疑含有一种或多种致病微生物或致病的或病原体感染的细胞(统称为“病原体”)的样品获得特定多核苷酸群体的方法。整体而言，该方法总体涉及将怀疑含有一种或多种病原体的样品与足够量的包括以下的组合物接触有效量的时间：a) 一种或多种离液剂； b) 一种或多种去污剂； c) 一种或多种还原剂；d)一种或多种螯合剂；和e)一种或多种表面活性剂，以杀死基本上全部，优选杀死其中所有致病微生物，包括，例如，致病性细菌、真菌和病毒(如果存在于样品中)。在该方法的实施中，将基本上所有(并且优选所有)细胞和其中包含的微生物裂解，并且它们的细胞内容物释放到溶液中。优选地，将基本上所有(和更优选地，所有)的细胞酶、蛋白、肽、脂蛋白、和其他细胞内容物变性和/或失活，包括可存在于样品中的任何外源或内源核酸酶，从而使得所得混合物基本上安全(和优选地，安全)用于由工人处理、储存和/或运输而无需过度效果，并且无需担忧处理样品的致病性、毒性、或危险，所述样品现在已经去污染，并且使得其中最初存在的任何致病微生物被破坏、灭活、杀死和/或裂解，以使它们无害。可以将用于收集生物样品的组合物保持在即用浓度中，或根据用于具体应用的方便或需要为浓缩形式，诸如，例如， 2x、5x、10x、20x 25x、30x、或更大倍。
优选地，从该方法如此获得的多核苷酸群体将优选是基本上稳定的，从而使得核酸基本上不降解，并且获得的多核苷酸群体的完整性将优选至少基本上保持，从而使得获得的多核苷酸是基本上完整的且以当包含它们的细胞通过组合物中存在的组分的作用而最初释放/裂解时它们所处的形式存在于样品中。如本文指出，在本发明的优选应用中，使用公开的方法获得的病原体特异性多核苷酸群体是基本上稳定且不可降解的，从而使得它们可以保持显著时间期间，甚至在低于理想的环境温度(例如，在约0℃至甚至约40℃或更高的温度)，持续延长的时间期间(例如，持续几小时至几天至几周或甚至几个月)，而不显著降解释放的核酸，从而使它们在进行核酸提取之后几天至几周，甚至当不可能储存从冰上冷冻或初始样品收集和随后的分子分析之间冷藏的样品提取的多核苷酸群体时适合用于下游分子分析(例如，模板依赖性扩增反应等)。
如本文指出，在优选的实施方案中，(i)一种或多种离液剂，优选包括硫氰酸胍、异氰酸胍、盐酸胍或它们的任何组合；(ii)一种或多种去污剂，优选包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸盐、胆酸钠、烷基苯磺酸钠、N-十二烷酰肌氨酸或它们的任何组合；(iii)一种或多种还原剂，优选包括2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、二甲亚砜或它们的任何组合；(iv)一种或多种螯合剂，优选包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或它们的任何组合；或(v)一种或多种缓冲剂，优选包括三(羟基甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、碳酸氢盐、磷酸盐或它们的任何组合。
处于即用浓度的优选制剂包括：(a)(i)约3 M硫氰酸胍；(ii)约1 mM TCEP；(iii)约10 mM 柠檬酸钠；(iv)约0.5% N-十二烷酰肌氨酸；(v)约0.0002%聚硅氧烷；(vi)约100 mM 2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇(TRIS)；以及(vii)约0.1 mM EDTA；或(b) (i)约3 M硫氰酸胍；(ii) 1 mM TCEP；约10 mM 柠檬酸钠；(iii)约0.5% N-十二烷酰肌氨酸，氯化钠；(iv)约0.0002%聚硅氧烷；(v)约100 mM TRIS；(vi)约0.1 mM EDTA；以及(vii)约10%至约25%乙醇(体积/体积)。
因为公开的制剂在容易杀死和裂解细胞、使蛋白的细胞组分变性和使对完整核酸的保存有害的酶类诸如内源性和外源性核酸酶失活中的显著有效性，本发明人已经证明，在某些情况下，样品中存在的基本上所有微生物在它与组合物接触的最初几分钟内被杀死和/或被裂解。在一些情况下，细胞的杀死和裂解在将样品与组合物接触的约3或约4或约5或几分钟内基本上完成。同样，在其他情况下，将样品与组合物接触约6、或约7、或约8、或约9、或约10分钟左右的期间足以基本上杀死和/或裂解收集的样品中可能存在的所有病原体。同样，样品中存在的从裂解的细胞释放的基本上所有蛋白、酶、核酸等在样品与组合物接触的只有几分钟内基本上全部失活和/或变性。
优选地，样品将是生物、临床、兽医或环境来源的，并且在某些实施方案中，样品优选是人来源的，并且特别地，来自具有、怀疑具有、或处于发展微生物感染，诸如分枝杆菌属的一种或多种菌株或物种引起的结核感染的风险中的人。从其收集样品的个体可以是也具有、被怀疑具有、或处于发展一种或多种第二或第三种医疗状况，和特别地，被一种或多种非致病性细菌物种或一种或多种真菌或病毒来源的病原性物种或它们的任何组合感染的第二和/或第三种感染的患者。
优选地，与从样品获得的多种分离和纯化的多核苷酸包含的核酸片段群体将适合用于引物依赖性扩增，特别地，当多核苷酸被储存在组合物中持续样品收集和分子分析之间约1至约90天的期间，甚至当储存在低于理想的储存条件时，包括例如，约0℃至约40℃的环境温度下，优选在环境温度下的储存，也是如此。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过将获得的病原体特异性多核苷酸的群体与标记的寡核苷酸检测探针接触而检测该群体内至少一种第一病原体特异性核酸区段的存在的步骤，其中标记的杂交产物的存在表明在获得的多核苷酸群体中存在一种或多种病原体特异性核酸区段。
在示例性实施方案中，标记的寡核苷酸检测探针包括由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的序列组成的至少一种第一序列区。该组合物可进一步初始包括已知量的约50至约500，可替代地，约70至约250，或可替代地还有，约90至约150个核苷酸长度至少一种第一内部阳性对照核酸区段，其中所述内部阳性对照核酸区段与获得样品的宿主的基因组核酸基本上不杂交，并且与病原体的基因组核酸也基本上不杂交。此类IPC在本文中详细公开，并且可以包括单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA或双链DNA:RNA杂合体。在某些实施方案中，IPC核酸区段包括来自SEQ ID NO:8的至少40个连续核苷酸序列，至少50个连续核苷酸序列，至少60个连续核苷酸序列，至少70个连续核苷酸序列，或至少80个连续核苷酸序列，或它们的互补物。
在示例性实施方案中，IPC包括：(a) 与对于第一内部阳性对照核酸区段特异性的约15至约40个核苷酸长、约18至约35个核苷酸长、或约20至约30个核苷酸长的标记的寡核苷酸检测探针特异性结合的第一序列结构域；(b) 与约15至约45个核苷酸长、约25至约35核苷酸长、或约20至约30个核苷酸长的正向PCR扩增引物特异性结合的第二序列结构域；和(c) 与约15至约45个核苷酸长、约18至约40个核苷酸长、约21至约35个核苷酸长、或约24至约30个核苷酸长的反向PCR扩增引物特异性结合的第三序列结构域，其中所述第二和第三序列结构域分别可操作地位于第一序列结构域的上游和下游，以促进在有效扩增至少一个第一部分的条件下从正向和反向引物PCR定向扩增内部阳性对照核酸区段的至少一个第一部分。
该方法还可以优选进一步包括至少以下步骤：(a) 进行至少一个热循环步骤，其中所述循环包括至少一个第一扩增步骤和至少一个第一杂交步骤，其中所述至少一个第一扩增步骤包括将获得的多核苷酸群体与组合物(所述组合物包含至少一对不同的、独立选择的特异性扩增引物、热稳定聚合酶、第一摩尔渗透压浓度试剂(包含甜菜碱或另一种阳离子官能两性离子型化合物)、至少一种第一参考染料和多种脱氧核苷三磷酸)接触，以产生至少一种第一病原体特异性扩增产物；和(b) 通过将其与第一标记的病原体特异性寡核苷酸检测探针接触而检测如此产生的扩增产物的存在，其中标记的杂交产物的存在表明获得的多核苷酸群体中一种或多种病原体特异性核酸区段的存在。在此类实施方案中，不同的、独立选择的、病原体特异性扩增引物对可优选包括18至约30个核苷酸长的第一寡核苷酸引物和18至约30个核苷酸长的第二寡核苷酸引物，其中第一和第二引物中的每一种分别与第一和第二不同的序列区域特异性杂交。对于分枝杆菌的检测和鉴定，优选地，引物对包含5’-SEQ ID NO:1的序列或其互补物。
在相关的实施方案中，本发明方法可以进一步任选包括进行获得的多核苷酸群体中内部阳性对照核酸区段的至少一个第一序列区域的引物依赖性扩增和定量获得的多核苷酸群体中存在的内部阳性对照核酸区段的量的步骤。
同样，该方法可以进一步任选地包括将沿着分析过程的一个或多个步骤存在于组合物中的内部阳性对照核酸区段的量与将样品初始添加至裂解/储存/运输培养基之前存在于初始组合物中IPC的量，或与存在于初始组合物中的目标核酸的量进行比较。此类比较可以用来证明在测定的下游点样品中仍然含有的IPC的量与在将样品添加至MTM组合物之前存在于MTM组合物中的IPC的已知量相当或基本上相同，并且可以用来定量收集的样品或下游测定组分中感兴趣的目标核酸的量。此类信息也可以表明与初始存在的相比样品中剩余核酸的量，并且可以提供初始存在的多核苷酸样品随时间的降解程度的估计值。
在本技术的一些应用中，在扩增病原体特异性核酸区段之后进行内部阳性对照核酸区段的至少第一序列区域的引物依赖性扩增，而在其他方面，在扩增病原体特异性核酸区段基本上同时进行内部阳性对照核酸区段的至少第一序列区域的引物依赖性扩增。
内部阳性对照核酸区段的扩增产物可以用包含第一可检测标记的合适的寡核苷酸检测探针来检测，并且病原体特异性核酸区段的扩增产物用包含第二不同的可检测标记的寡核苷酸检测探针来检测。
此类方法还可以进一步任选地包括检测获得的多核苷酸群体内一种或多种耐药基因的存在。
本发明还提供了引物依赖性扩增反应相容的组合物，所述组合物优选包括(a)一种或多种缓冲剂；(b)一种或多种摩尔渗透压浓度试剂；(c)一种或多种白蛋白；(d)一种或多种螯合剂；(e)一种或多种盐；(f)至少一对不同的、独立选择的病原体特异性扩增引物，其中第一和第二引物中的每一条与第一和第二不同的序列区域特异性杂交；(g) 与第三序列区域特异性杂交的包含第一可检测标记的病原体特异性寡核苷酸检测探针；(h) 至少一种具有引物依赖性扩增能力的热稳定聚合酶；和(i)多种脱氧核苷三磷酸，每种以足以使至少一种第一病原体特异性扩增产物扩增的量存在。可以将用于热循环(例如，用于PCR)的组合物保持在即用浓度，或根据用于具体应用的方便或需要保持在浓缩形式，诸如，例如， 2x、5x、10x、20x 25x、30x、或更大倍。
在说明性实施方案中，(a) 所述一种或多种缓冲剂优选包括三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)；(b) 所述一种或多种聚合酶链式反应摩尔渗透压浓度试剂优选包括N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)、二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油、非离子型去污剂、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇、四甲基氯化铵、或它们的任何组合；(c) 所述一种或多种白蛋白优选BSA、HAS或任何哺乳动物白蛋白；(d) 所述一种或多种螯合剂优选包括乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或它们的任何组合；和(e) 所述一种或多种盐优选包括氯化钾、硫酸镁、谷氨酸钾、或它们的任何组合，并且所述引物对优选包括：(i) 18至约30个核苷酸长的第一寡核苷酸引物，其优选包括至少一个第一序列区域，所述第一序列区域由与病原体特异性核酸序列至少95％相同的序列组成；和(ii) 18至约30个核苷酸长的第二寡核苷酸引物，其优选包括至少一个第一序列区域，所述第一序列区域由与病原体特异性核酸序列至少约90％相同、优选至少约95％相同、且更优选至少约98％相同的序列或其互补物组成。
病原体特异性寡核苷酸检测探针优选24至约35个核苷酸长，且更优选包括至少一个第一序列区域，所述第一序列区域由与来自病原体特异性序列的至少一个第一连续核酸序列至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、或至少98％相同或更高％相同的序列或其互补物组成。组合物可以进一步任选包括与聚合酶链式反应相容的一种或多种内部参考染料，诸如包括一种或多种荧光团、一种或多种猝灭剂、一种或多种报道分子、一种或多种核酸插入剂或它们的任何组合的那些。
在说明性实施方案中，即用浓度的组合物优选包括：(a) 约50 mM TRIS；(b) 约70 mM氯化钾；(c)约3 mM硫酸镁；(d) 约45 mM甜菜碱；(e) 约0.03 μg/mL牛血清白蛋白；(f)约0.1 mM EDTA；(g) 约0.01μΜ至约1μΜ染料；(h) 约4 µM的18至约30个核苷酸长的第一寡核苷酸引物：(i) 约4μΜ的18至约30个核苷酸长的第二寡核苷酸引物；(j) 约6μΜ的24至约35个核苷酸长的病原体特异性寡核苷酸检测探针；(k) 约1单位的Taq聚合酶；和(l) 约0.2 mM脱氧核苷三磷酸。
可检测的标记可以优选包括一种或多种放射性标记、一种或多种发光标记、一种或多种化学发光标记、一种或多种荧光标记、一种或多种磷光标记、一种或多种磁性标记、一种或多种自旋共振标记、一种或多种酶标记、或它们的任何组合。示例性可检测标记包括，但不限于，荧光素、6-羧基荧光素(6-FAM)、6-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(6-FAMSE)、VIC染料、或它们的任何组合。
如本文指出，本发明还提供了诊断试剂盒，其优选包括一种或多种本文公开的组合物，和在检测水性样品中的病原体特异性核酸区段中使用该试剂盒的说明书；任选地该试剂盒可以进一步包括(通常在分开不同的容器中)第一MTM组合物，所述第一MTM组合物包含：a) 一种或多种离液剂； b) 一种或多种去污剂； c) 一种或多种还原剂；d)一种或多种螯合剂；和e)一种或多种表面活性剂，各自以当置于组合物中持续有效量的时间时基本上杀死或裂解一种或多种致病或感染的细胞或变性或失活从其释放的一种或多种蛋白、酶或核酸酶的量存在。在某些实施方案中，该试剂盒还可以进一步包括(优选在MTM组合物中)已知量的至少一种第一内部阳性对照核酸区段(和优选约50至约500个核苷酸长的区段)，其中所述内部阳性对照核酸区段与获得样品的宿主的基因组核酸基本上不杂交(和优选地，不特异性杂交)，并且与怀疑在样品内的一种或多种微生物病原体的基因组核酸也基本上不杂交。如本文指出，此类试剂盒还可以进一步任选包括一个或多个提取装置，所述提取装置用于从与MTM制剂接触的裂解/释放/变性样品中分离和纯化多核苷酸群体。此类提取装置可以是便携式、台式、或者甚至是手持装置，其优选包括：(i) 过滤容器，所述过滤容器具有至少一个接收端，并且包含适合用于其上结合多核苷酸群体的膜滤器，其中所述膜滤器被配制至少基本上遍及滤器和其中至少部分的宽度，和(ii) 体积分配机构，其适合用于可控地分配并用力注射一定量的与过滤容器可操作结合的液体，以过滤通过其中的液体，和b)用于使用提取装置以便从怀疑包含至少一种第一病原体的水性样品获得纯化的多核苷酸群体的说明书。
本发明有利地改进了常规样本收集，保证了其中含有的任何微生物病原体的裂解，并且促进了此类样品从收集点到鉴定和测定点的安全且有效的运输和储存。此外，本文公开的分子运输介质组合物促进了从收集的微生物释放的核酸的稳定化，以及保持了保真度并且使释放核酸的完整性保存了延长的时间期间，甚至在环境条件或低于理想的储存条件下。
因此，本发明有利地提供了裂解生物病原体的收集和保存制剂，稳定释放的核酸(包括RNA和DNA两者)，并且优选地至少基本上保持，并且优选完全保持，收集的多核苷酸的完整性，从而使得其中至少一个第一部分容易获得，并且非常适合用于下游分子诊断分析收集样品中包含的核酸。
本文公开的“一步”分离/储存/运输制剂有利地完成至少一种或多种，优选所有以下主要功能：灭活或杀死样品内的病原体；裂解细胞和从细胞内释放核酸；灭活细胞酶，包括内源性和外源性核酸酶，以防止释放的核酸降解；促进在环境温度下分离的多核苷酸样品的容易收集和安全处理/运输持续延长的时间期间，而不需要冷藏或常规零度以下的储存温度；在样品的随后处理、运输和/或储存期间有效稳定核酸；和储存和/或维持其中含有的至少一个第一部分多核苷酸群体的完整性持续足够时间而足以允许其中含有的至少一个第一核酸区段的分子表征和鉴定。
在如本文描述的具体方面，特别当进行该方法用于分析在远程或“现场”位点获得的样本时，本发明的分子运输介质(MTM)组合物优选稳定收集的生物样品持续至少一个足够长的时间期间，足以促进随后的分子分析，而基本上不降解或损失从收集的样品获得的至少第一核酸群体。优选地，本文的MTM组合物促进其中收集的生物样品在环境温度下收集/运输/储存延长的时间期间(从几小时到几天，或者甚至几周或几个月或更长时间)，从而使得收集的样品不需要冷藏和/或冷冻，以保存它们用于后续分子检测。还更优选地，本文公开的MTM制剂稳定和保存收集的核酸，其方式足以允许随后扩增和鉴定来自存在于收集的样品中的至少一种第一微生物病原体的至少第一核酸序列。
在说明性实施方案中，本文所述MTM制剂进一步任选包括至少第一内部阳性对照(IPC)，以促进微生物特异性多核苷酸的改进的回收，并且允许确定收集的样本的序列保真度和保存。示例性的已知多核苷酸序列可以在样本收集时存在于收集试剂中，并且该已知量IPC的随后分析可以用于在所述鉴定方法的整个收集/运输/分析阶段准确监测多核苷酸群体的保真度。
在本发明的实施中，使用本文公开的运输介质鉴定的示例性病原体包括但不限于一种或多种分枝杆菌，包括但不限于，分枝杆菌属的一种或多种物种或菌株，包括结核病的一种或多种病原体。
当在热循环步骤前多核苷酸群体在约10℃至约40℃的温度被储存在组合物中持续约1至约30天时，多核苷酸群体的完整性被至少基本上保持，且多核苷酸群体基本上保持不降解，所述组合物包括(a)(i)约3 M硫氰酸胍；(ii)约1 mM TCEP；(iii)约10 mM柠檬酸钠；(iv) 约0.5% N-十二烷酰肌氨酸；(v)约0.0002%聚硅氧烷；(vi) 约100 mM 2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇 (TRIS)；以及(vii)约0.1 mM EDTA；或(b) (i)约3 M硫氰酸胍；(ii) 1 mM TCEP；约10 mM 柠檬酸钠；(iii)约0.5% N-十二烷酰肌氨酸, 氯化钠；(iv)约0.0002% 聚硅氧烷；(v)约100 mM TRIS；(vi)约0.1 mM EDTA；以及(vii)约10%至约25%乙醇(体积/体积)。在一些实施方案中，当含有多核苷酸群体的组合物在约10℃至约40℃的温度储存约1至约7天、或约7天至约14天或14天至约28天的期间时，多核苷酸群体的完整性被至少基本上保持，且多核苷酸群体保持基本上不降解。
在具体实施方案中，在组合物在约10℃至约40℃的温度储存约1至约30天，并且在一些实施方案中持续约1至14天的期间之后，群体内多核苷酸的完整性基本上保持，从而使得至少约75％、或至少约80％、至少约85％或至少约90％、至少约95％、至少约98％和在一些情况下至少约99％的初始多核苷酸保持至少基本上全长。
在本发明的实施中，如此分析的多核苷酸群体将优选从生物样品中获得，其中生物样品从哺乳动物(包括，例如，人、非人灵长类、家畜等)获得。样品可以在扩增方案和随后检测扩增产物之前的任何合适时间获得，但在具体方面，样品收集、从样品中分离多核苷酸群体、和扩增/检测分析感兴趣的目标核酸之间的时间相当短，诸如，从样本收集到扩增产物检测大约几分钟到几小时，而在其他实施方案中，感兴趣的目标核酸的扩增/检测分析可能更长。
在一个实施方案中，收集怀疑含有从病原体分离的至少第一多核苷酸群体的生物样品的方法包括：将生物样品置于第一收集装置中，所述收集装置含有至少第一溶液，所述第一溶液包含：a) 一种或多种离液剂；b) 一种或多种去污剂；c) 一种或多种还原剂；d)一种或多种螯合剂；和e)一种或多种表面活性剂，各自以足以使一种或多种蛋白变性，或灭活一种或多种核酸酶的量存在；其中收集溶液杀死、失活或去污染存在于样本中的任何病原体而用于安全处理和运输；并且其中当在从收集溶液提取多核苷酸群体前含有多核苷酸群体的溶液在约10℃至约40℃的温度储存约1至约42天期间时，多核苷酸群体的完整性被至少基本上保持，且多核苷酸群体基本上保持不降解。
在进一步的实施方案中，杀死、灭活或去污染发生在与收集溶液接触的约五分钟或更少时间之内。在一些实施方案中，杀死、灭活或去污染发生在与收集溶液接触的约两分钟之内。在其他实施方案中，杀死、灭活或去污染发生在与收集溶液接触的约一分钟之内。
在一些实施方案中，进一步分析从生物样品获得的多核苷酸群体。本发明还包括用于检测微生物序列的试剂混合物，所述试剂混合物包括存在于混合物中的一种或多种微生物特异性引物、探针、或酶、或它们的组合，其在环境温度下至少基本上是稳定的，并适于和配置用于与聚合酶链式反应(PCR)设备一起使用。在一个实施方案中，试剂混合物在环境温度下基本上稳定持续至少约5天，且最多达两周。在另一个实施方案中，微生物序列的检测发生在从样品提取微生物序列之后约90分钟之内。试剂混合物可以用来鉴定微生物序列，诸如病原体、细菌或病毒序列、或它们的组合。本发明的试剂混合物，在本文中也称为“PrimeMix®”，并且在一些情况下“PrimeMix® Universal MTB”也可以被用来鉴定病毒或细菌序列的株，或甚至物种特异性结核菌素株。
进一步实施方案可以包括组合物，所述组合物包括至少一种微生物特异性核酸序列或怀疑含有至少一种微生物特异性核酸序列的生物样品；溶液，所述溶液包含：(i) 一种或多种缓冲剂(各自优选以约1 mM至约1M的量存在于组合物中)；(ii)一种或多种摩尔渗透压浓度试剂或白蛋白，其中至少一种含有甜菜碱(各自优选以约1 mM至约1M的量存在于组合物中)；(iii)一种或多种螯合剂(各自优选以约0.01 mM至约1 mM的量存在于组合物中)；(iv)一种或多种参考染料(各自优选以约0.01 μM至约50 mM、更优选约0.02 μM至约1 μM的量存在于组合物中)；和(v)一种或多种盐(各自优选以约50 mM至约1 M的量存在于组合物中)；和第一对病原体特异性扩增引物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包括病原体特异性探针。在一个实施方案中，参考染料以约0.01 μΜ至约1μΜ的量存在。优选地，所述组合物包括一种或多种盐。该盐优选是氯化钾、氯化镁、硫酸镁、谷氨酸钾、或它们的任何组合。优选地，盐在组合物中的浓度为约0.5mM至约50mM。
期望包括一种或多种缓冲剂以控制稳定核酸和酶的制剂pH。优选的pH范围为约6.0至约9.5，优选约6.5至约8.0，更优选约6.5至约7.5。优选地，缓冲剂和/或整体组合物的pH在缓冲剂pKa的一个单位之内，更优选在约0.5个单位之内，更优选在约0.2个单位之内，更优选在约0.1单位之内，各自在选择的温度、优选环境温度下测量。示例性的缓冲剂包括但不限于三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐或它们的任何组合。在优选的实施方案中，缓冲剂包括TRIS。
至少一种第一摩尔渗透压浓度试剂可以在该方法中被用来优化反应条件，尤其当高含量的鸟嘌呤和胞嘧啶存在于序列中时，并且可以包括，但不限于，甜菜碱、三甲基甘氨酸、甘氨酸甜菜碱、二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺、脱氧肌苷、甘油、7-脱氮脱氧鸟苷三磷酸、或氢氧化钠、或它们的任何组合。
示例性的螯合剂包括但不限于乙二醇四乙酸(EGTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵(ammonium bicitrate)、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂或它们的任何组合。在优选实施方案中，螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或其组合。在更优选的实施方案中，螯合剂包括EDTA。
至少一种第一参考染料，优选惰性化学物，可以任选地在该方法中用于将当使用荧光化合物诸如在FRET技术中使用的那些时获得的结果均一化。参考染料，当包括时，可以提供内部参考，可以将报告染料信号针对所述内部参考进行均一化。此类参考染料可以包括，但不限于，被动参考染料诸如荧光素、5-羧基-X-罗丹明和商业制剂诸如ROX™，或它们的组合。在一个更优选的实施方案中，参考染料包括ROX™。
优选地，所述组合物进一步包括以约0.1 mM至约50 mM的量添加脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)，诸如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、或脱氧尿苷三磷酸、或它们的组合。
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种额外的化合物或试剂，包括但不限于白蛋白。白蛋白通常是指以下任何蛋白，其是水溶性的，适度溶于浓盐溶液中，并且经历热变性。白蛋白在血浆中常见，并且与其他血液蛋白不同，因为它们未糖基化。优选地，白蛋白是牛血清白蛋白(BSA)、硫酸镁、水和酸或碱，诸如盐酸和氢氧化钠。可以将酸或碱添加至最终溶液以调节pH。优选地，以约0.01 μg/μL至约0.5 μg/μL的浓度添加BSA。
本发明组合物可以进一步包括一种或多种聚合酶。所述一种或多种聚合酶可以包括，但不限于，Taq聚合酶和高保真聚合酶。优选地，所述一种或多种聚合酶以约1 U酶的量存在于约10至约50 μL最终溶液中。
在具体实施方案中，所述组合物将进一步优选包括至少一种第一寡核苷酸检测探针，所述检测探针包括放射性标记、发光标记、化学发光标记、荧光标记、酶标记、磁性标记或自旋共振标记、或它们的组合。荧光标记可以包括，但不限于，荧光素、6-羧基荧光素(6-FAM)或6-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(6-FAMSE)等、或它们的组合。对于每种核酸的优选的引物和/或探针浓度为约1 pmol至约10 μM。
本发明进一步提供了用于检测从生物样品获得的多核苷酸群体中是否存在病原体特异性核酸区段的方法，所述方法包括：(a) 进行至少一个热循环步骤，其中所述循环包括至少一个第一扩增步骤和至少一个第一杂交步骤，其中所述至少一个第一扩增步骤包括将从怀疑含有病原体特异性核酸区段的生物样品获得的多核苷酸群体与组合物(所述组合物包含至少一对不同的、独立选择的病原体特异性扩增引物、聚合酶、第一摩尔渗透压浓度试剂(包含甜菜碱)、任选(但优选)至少一种第一参考染料和多种脱氧核苷三磷酸)接触，当样品中存在病原体特异性核酸区段时产生病原体特异性扩增产物；和(b) 通过将扩增产物与包含第一可检测标记的病原体特异性寡核苷酸检测探针接触而检测扩增产物的存在，其中标记的杂交产物的存在表明多核苷酸群体中一种或多种病原体特异性核酸区段的存在，其中不同的、独立选择的、病原体特异性扩增引物对包含18至约30个核苷酸长的第一寡核苷酸引物和18至约30个核苷酸长的第二寡核苷酸引物，其中第一和第二引物中的每一条分别与病原体特异性序列或其互补物或反向互补物内的第一和第二不同的序列区域特异性杂交。
本发明的分枝杆菌PrimeMix®的示例性制剂描述于本文实施例中，并且包括，但不限于，包括以下的组合物：(a) 约1 U Taq聚合酶；(b) 约6 μM检测探针，其包括以下核酸序列，所述核酸序列包含、或的核酸序列，基本上由其组成，或可替代地由其组成；(c)约4 μM的少于约50、优选少于约40、更优选仍少于约30个核苷酸长的反向寡核苷酸引物，所述反向寡核苷酸引物包含与或的一种或多种序列或其互补物至少98％相同的核酸序列，基本上由其组成，或可替代地由其组成；(d) 约4 μM的少于约50、优选少于约40、更优选仍少于约30个核苷酸长的正向寡核苷酸引物，所述正向寡核苷酸引物包含与或的一种或多种序列或其互补物至少98％相同的核酸序列，基本上由其组成，或可替代地由其组成；(e) 约50 mM Tris；(f) 约70 mM KCl；(g) 约3 mM MgSO4；(h) 约45 mM甜菜碱；(i) 约0.05 μM ROX或相当的参考染料；(j) 约0.025 μg/μl超纯BSA；(k) 约0.2 mM dNTPs；和(l) 约0.1 mM EDTA。
本发明的进一步实施方案包括用于检测微生物序列的方法，所述方法包括从生物样品获得基因组核酸和通过将添加核酸至一种或多种微生物特异性引物、探针或酶或它们的组合的试剂混合物而测定基因组材料，其中所述混合物在室温下基本上是稳定的，并且适于与PCR装置一起使用。在另一个实施方案中，PCR装置包括用于实时PCR检测的荧光检测设备。
进一步的实施方案中，本发明提供了用于检测分枝杆菌特异性核酸区段是否存在的方法，并且在具体方面，提供了用于检测结核分枝杆菌的特定类型、亚型或菌株是否存在的方法。在示例性实施方案中，本发明提供了在优选从生物样品获得的多核苷酸群体中鉴定含有一个或多个IS6110-特异性核酸区段的分支杆菌物种和菌株的方法。
在另一方面，本发明提供用于快速检测生物样品中的特定多核苷酸序列诸如分枝杆菌特异性IS6110序列的方法。从整体和一般意义上看，该方法包括使用常规方法诸如PCR和对目标序列特异的正向和反向引物扩增怀疑含有特定序列的核苷酸群体，特异性探针组与得到的单链PCR产物杂交，进行熔解曲线分析，并分析单链PCR产物与杂交探针的杂合体的Tm变化。
探针上的标记可包括但不限于分子领域普通技术人员已知的放射性的、发光的、化学发光的、荧光的、酶的、磁性或自旋共振的标记。在说明性实施方案中，标记探针含有至少第一小沟结合剂。用标记“探针”序列检测多核苷酸的一种此类方法利用荧光共振能量转移(FRET)过程。示例性的FRET检测方法往往涉及包含供体荧光团和受体荧光团的荧光团对，其中供体荧光团能够向受体荧光团传递共振能量。在示例性的FRET测定中，供体荧光团的吸收光谱基本上不与受体荧光团的吸收光谱重叠。本文所用“供体寡核苷酸探针”，是指用荧光共振能量转移对的供体荧光团标记的寡核苷酸。本文所用“受体寡核苷酸探针”，是指用荧光共振能量转移对的受体荧光团标记的寡核苷酸。本文所用“FRET寡核苷酸对”，通常包括“锚定”或“供体”寡核苷酸探针和“受体”或“传感器”寡核苷酸探针，当供体寡核苷酸探针和受体寡核苷酸探针二者都与其互补目标核酸序列杂交时，此类寡核苷酸对形成FRET关系。用作荧光共振能量转移对的可接受的荧光团对为本领域普通技术人员所众所周知，包括但不限于：荧光素/罗丹明、藻红蛋白/ Cy7、荧光素/ Cy5、荧光素/ Cy5.5、荧光素/ LC Red 640及荧光素/ LC Red 705等等。
在该方法的常规实施中，也可以如分子基因测定领域中常规进行地对一种或多种“阴性”和/或“阳性”对照样品进行循环步骤，以确保该方法的完整性、保真度和准确度。使用此类对照对于本领域普通技术人员是常规的，并且不必在本文中进一步描述。同样，在本发明的实施中，也可以期望，将一种或多种已知“内部阳性对照”(IPCs)掺入待分离的多核苷酸群体，以进一步确保公开方法的完整性、保真度和/或精确度。
在某些实施方案中，考虑加入核酸(例如RNA和/或DNA)以有益于所公开方法的多种目的和应用：a)作为“载体”(先前已显示加入少量的补充RNA/DNA以提高/增加样品/样本的总收率，特别是对可能含有低量目标的原始样本(即细胞、病毒和细菌)的总收率)；b)作为IPC用于下游分子过程，并跟踪或监测来自待检测的采集样品的核酸制品的保真度；和c)用于与下游定量分析例如qRT-PCR等的“校准物(calibrator)”比较。在此类实施方案中，可将一种或多种已知的或“对照”核酸以终浓度为约1 ag-约1 mg，更优选约1 fg-约1 µg，还更优选约1 pg -约1 ng加入到组合物中。
在说明性实施方案中，本发明提供分离的单链(ss)或双链(ds) RNA、DNA、PNA或其杂合体，其可用作：(a)载体分子用于帮助从怀疑含有核酸的生物样品回收多核苷酸；和/或(b)IPC (即“已知的”、“报告分子”、“对照”、“标准品”或“标记”)序列以监测样本采集的完整性和保真度及多核苷酸的分离/稳定。在某些实施方案中，本发明提供可用作载体分子和/或IPC的分离的ds-RNA、ds-DNA、ds-PNA或其杂合体。在其他实施方案中，本发明提供可用作载体分子和/或IPC序列的分离的ssRNA、ssDNA、ssPNA或其杂合体。在示例性实施方案中，本发明提供既可用作载体分子又可用作IPC序列的分离的ssRNA分子。
此类分子可自天然来源分离，在实验室制备，或可替代地，可以是含有天然和非天然序列两者的杂合体。如本文所述，因为本发明组合物尤其可用于自怀疑含有病原体来源的多核苷酸的哺乳动物(特别是人)来源获得的生物样本的分离和表征，因此优选作为载体和/或阳性对照化合物采用的一种或多种序列，基本上含有通常不能在哺乳动物基因组内或对所述哺乳动物为致病的生物体的基因组内发现的一级核苷酸序列。示例性的哺乳动物包括但不限于牛、绵羊、猪、狼、犬、马、猫、熊、鼠、狮子、野兔、山羊和非人灵长类。
优选地，这种非哺乳动物、非病原体特异性的载体/报告序列不可交叉反应，即基本上不能或优选不能与哺乳动物或病原体特异序列性杂交，因此，在配制对照/载体序列中特别优选非编码、非简并(即无意义)序列，以使对照/载体序列与从采集的样本获得的分离多核苷酸群体的成员的杂交降到最低。因此，示例性的载体/对照序列基本上不与或优选不与从哺乳动物基因组分离的多核苷酸群体结合(例如，在严格杂交条件下杂交)，或不与从对哺乳动物为致病的细菌、真菌、病毒基因组分离的多核苷酸群体结合。本领域普通技术人员已知的示例性的严格杂交条件包括但不限于以下所述或与其等同的杂交条件：(a)用含有约5X SSC、0.5% SDS和1.0 mM EDTA (pH 8.0)的溶液预洗涤；(b) 在5X SSC中在约60℃-约70℃温度下杂交过夜；和(c)随后用含有0.1% SDS的2X、0.5X和0.2X SSC各自在约65℃-约70℃温度下洗涤20分钟。
本发明的另一个方面提供了掺入上述引物和探针的试剂混合物，和包含此类组合物用于进行热循环扩增法的试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供了诊断核酸扩增/检测试剂盒，所述试剂盒通常在合适的容器中包括如本文所述的病原体特异性寡核苷酸扩增引物组，和用于在从生物样品或样本获得的多核苷酸群体的PCR扩增中使用该引物组的说明书。此类试剂盒可以在相同或在不同的容器中进一步任选地包括寡核苷酸检测探针，所述检测探针特异性结合由从含有或怀疑含有病原体特异性核酸区段的生物样品或样本获得的多核苷酸群体的PCR扩增产生的扩增产物。此类试剂盒还可以在相同或者不同的容器中进一步任选包括任何一种或多种试剂、稀释剂、酶、可检测标记(包括但不限于一种或多种放射性标记、发光标记、化学发光标记、荧光标记、酶标记、磁性标记或自旋共振标记)、dNTP、和对于进行如本文所述的多核苷酸群体的一个或多个热循环扩增所需的此类类似物。
本发明的另一个方面提供了用于在生物样品中含有的多核苷酸群体的基因分析之前收集和/或储存和/或运输生物样品的试剂盒。本发明允许尽可能少地收集生物材料，诸如痰，即，可以使用约0.01 mL至约25 mL，优选约0.05 mL至约10 mL，更优选0.1 mL至约5 mL。在此类实施方案中，试剂盒优选包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、离液剂、DNA酶、RNA酶、或对于制备样品用于分析所需的其他此类核酸分离和/或纯化试剂，诸如上述那些。
在进一步实施方案中，本发明试剂盒还可任选进一步包括如上所述一种或多种提取装置或设备，以促进从收集的生物样品分开或分离核酸。本发明的试剂盒还可以任选进一步包括一个或多个便携式、坚固耐用、或现场可采用热循环、PCR扩增系统和/或一个或多个系统、装置或工具，以促进对于显现在本方法实施期间产生的扩增产物而采用可检测标记的检测、定量和/或分配。
还可以包装本发明的诊断试剂和试剂盒用于商业流通，可以进一步任选包括用于样品或样本收集、处理或加工的一种或多种收集、传递、运输或储存装置。此类试剂盒的一种或多种容器通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、样本杯或其他容器，其中可放置一种或多种组合物，优选适合地分为等分试样用于单个样本的收集、运输和/或储存。试剂盒也可包括更大的容器，诸如箱，其包括上述容器以及其他设备、使用说明等。试剂盒也可任选包括一种或多种另外的试剂、缓冲剂或化合物，并且还可以进一步任选包括用于在临床、诊断、环境或法医样品的收集中使用试剂盒的说明书，以及一旦将此类样品置于一种或多种公开的组合物中而储存和运输此类样品的说明书。
考虑在某些实施方案中，本文公开的组合物可以进行配制，从而使得整个样品收集和核酸扩增/检测过程可以在远程、现场、战场、乡村或其他非实验室条件下实现，而不显著限制扩增/检测方法的保真度、准确度或效率。本发明的此类方面提供了优于常规费力分离/收集/运输/储存/分析方案的特别优势，所述常规费力分离/收集/运输/储存/分析方案需要几天至几周来实现，并且必须经常在需要冷藏或冷冻样品和/或测定试剂以便正确完成分析的条件下来进行。通过提供在保存稳定的、环境温度温和的试剂混合物中包括与所有必要的分离、储存和多核苷酸稳定成分的混合物以及与扩增选择的目标核苷酸所需的所有试剂的混合物(包括但不限于，单独的本文所述的扩增引物和检测探针，或本文所述的扩增引物和检测探针与一种或多种PCR缓冲剂、稀释剂、试剂、聚合酶、可检测标记等的组合)的试剂混合物，与商业获得的许多基于常规寡核苷酸探针的热循环测定相比，使用本发明可以获得显著的成本节约、时间减少和其他经济规模。当采用实时PCR方法用于扩增时，检测可以任选在给定循环数结束时进行，或可替代地，在扩增方案中的每个循环步骤的一个或多个之后进行。
本发明的组合物和方法涉及临床或兽医样本或法医或环境样品收集系统的收集，且可包括一种或多种收集工具和一种或多种试剂，用于有效地：1)获得超过本领域目前可获得的高收率的合适样本；2)使潜在的感染性生物学病原体(诸如结核分枝杆菌复合群的成员)失活，以使其不再有活力，并可对其进行处理；在最不担心病原体释放或污染的情况下运输或输送；或3)在环境温度下长时间有效稳定并保存来自水解或核酸酶降解的裂解的‘裸’RNA/DNA聚合物，直到可在诊断实验室处理样品；并且优选用于达到这些目标中的两个或更多个或全部三个。本发明的收集溶液提供以下益处：使微生物、病毒或病原体失活、杀死和/或裂解；使外源性或内源性核酸酶受到破坏和/或失活，所述酶包括但不限于RNA酶和/或DNA酶；与多种常规核酸提取、纯化和扩增系统相容；保存样品内RNA和/或DNA的完整性；促进在环境或热带温度的运输和运送，甚至是在延长时间或极端温度变化下；和适合短期(几小时到几天)、中期(几天到几周)或长期(几周到几个月)储存分离的核酸。合适的组合物(也称为“PrimeStore®”)和方法可以见于共同拥有的2008年10月1日提交的美国专利公开号2009-0312285(其全部内容通过明确引用而整体并入本文)。
在示例性的实施方案中，生物样品中多核苷酸群体的完整性，和/或从样品获得的多核苷酸中的至少一种的至少第一序列的保真度，在以下情况下至少基本上得以保持(即所述群体中至少75%，有时候约80%，在其他实施方案中至少约85%，或甚至至少约90%、至少约95%或至少约98%的核苷酸基本上为全长)：当包含样品的组合物在约-20℃到约40℃(或约-10℃到约40℃、或约-0℃到约40℃、或约10℃到约40℃)温度下储存约1到约7天或更长时间时；可替代地，在约-20℃到约40℃(或约-10℃到约40℃、或约0℃到约40℃、或约10℃到约40℃)温度下储存约7到约14天或更长时间时；或者可替代地，在约-10℃到约40℃(或约0℃到约40℃、或约10℃到约40℃或约20℃到约40℃)温度下储存约14到约42天或更长时间时。此外，在组合物在约-20℃至约40℃、优选约10℃至约40℃的温度储存约1至约14天或更长时间；或者可替代地在约-20℃至约40℃、优选约10℃至约40℃的温度储存约14至约42天或更长时间之后，群体内多核苷酸的完整性基本上保持，从而使得至少约80％的初始多核苷酸保持至少基本上全长。
可替代地，生物样品中多核苷酸群的完整性至少基本上得以保持，从而使得当与最初收集样品时存在于溶液中的量相比时，群体中的核苷酸至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%、96%、97%、98%或99%或更多存在于溶液中。在优选实施方案中，样品的完整性基本上得以保持，从而使得所有或几乎所有存在于原始样品中的细菌特异性多核苷酸会随着时间得以保持(即无可检测到的降解)。
在所公开方法的实施中，优选从收集时间到分离、纯化或表征其中的多核苷酸群体的时间，少于约20%的原始存在于所收集的样品中的多核苷酸群体在随后的储存期间随着时间而被降解。优选基本上少于约15%的原始存在于所收集的样品中的多核苷酸群体在随后的储存期间随着时间而被降解，更优选少于约10%的原始存在于所收集的样品中的多核苷酸群体在随后的储存期间随着时间而被降解，还更优选少于约5%的原始存在于所收集的样品中的多核苷酸群体在随后的储存期间随着时间而被降解。在特别优选的实施方案中，不超过约5%、约4%、约3%、约2%或约1%的原始存在于所收集的样品中的多核苷酸群体在随后的储存期间随着时间而被降解。优选不管样品的储存条件如何都如此高完整性保存样品质量，并且可基本上保持以下时间：至少约1天、至少约5天、至少约7天、至少约14天、至少约21天、至少约30天、至少约45天、至少约60天、至少约90天或甚至至少约120天或更长。
尽管可用分子领域普通技术人员已知的任何常规方法测定从本发明实施获得的或在本发明实施中利用的特定多核苷酸序列的存在情况、完整性或序列保真度，但在一个实施方案中，使用PCR扩增方法。同样地，目的多核苷酸完整性的测定可包括在给定条件下PCR循环阈值(CT)的测定，所收集的核酸的序列保真度、定性完整性的测定可通过常规的DNA或RNA测序方法测定，所述方法包括但不限于Maxam-Gilbert的基于化学的方法、Sanger等人的双脱氧链终止法、Mathies等人的基于染料荧光团的方法或Nyren和Ronaghi所述的焦磷酸测序技术。例如，核苷酸测序可以通过使用TOPO® 2.0 Cloning Kit (Invitrogen™)克隆纯化的扩增子进行，并且然后使用BigDye® Terminator v3.1试剂盒进行测序。未掺入的荧光核苷酸可以根据制造商的推荐(Qiagen®)使用DyeEx® 96-孔板试剂盒来去除。可以进一步使用ABI 3100 Genetic Analyzer (ABI Inc., Foster City, CA, USA)进行核苷酸测序。
内部阳性对照(“IPC”)
在一些实施方案中，收集溶液和方法可以进一步包括至少一种内部阳性对照(IPC)来监测处理的样品的保真度，监测样本收集和多核苷酸分离/稳定的完整性和保真度和/或监测下游分子过程或分析。方法包括将至少一种IPC核酸区段置于本发明的收集溶液中或者将IPC核酸区段与提取的多核苷酸群体组合来监测样品和/或提取的核酸分子的下游分子处理。在一些实施方案中，IPC作为PrimeStore®溶液的组分存在，并且因此基本上是稳定的，并且当在环境温度下在溶液中储存延长的时间期间时基本上不降解。在这些情况下，可以考虑IPC是当从收集溶液提取时多核苷酸群体的部分。
优选地，IPC序列不可交叉反应，即基本上不能或优选不能与哺乳动物或病原体特异序列杂交，因此，在配制对照/载体序列中特别优选非编码、非简并(即无意义)序列，以使对照/载体序列与从收集的样本获得的分离多核苷酸群体的成员的杂交减到最低。因此，示例性的载体/对照序列基本上不与或优选不与从哺乳动物基因组分离的多核苷酸群体结合(例如，在严格杂交条件下杂交)，或不与从对哺乳动物为致病的细菌、真菌、病毒基因组分离的多核苷酸群体结合。
在某些实施方案中，本发明提供分离的单链(ss)-RNA、ss-DNA、ss-PNA、双链(ds)-RNA、ds-DNA、ds-PNA或其杂合体，其可用作IPC。在优选的实施方案中(其中结核分枝杆菌复合群特异性核酸的分离和检测是所需的)，使用单链脱氧核糖核苷酸区段。在说明性实施方案中，本发明提供了IPC序列，所述IPC序列包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成，所述核酸序列优选与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12到SEQ ID NO:21中的任一个具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%或更多同一性。
当样品或提取的核酸的进一步分子处理由鉴定结核分枝杆菌复合群特异性核酸组成时，本发明的IPC序列应当含有与合适可检测的探针(包括但不限于分子标记的探针和其衍生物)特异性杂交(即结合)的至少一个第一序列结构域。示例性的标记探针为包含分子领域普通技术人员已知的放射性的、发光的、化学发光的、荧光的、酶的、磁性或自旋共振的标记的探针。在优选的实施方案中，探针用6-FAM或VIC™染料标记。在说明性实施方案中，标记探针含有至少第一小沟结合剂。在进一步实施方案中(其中将采用扩增策略诸如PCR)，本发明的IPC序列含有至少第二序列结构域(与正向PCR扩增引物特异性结合)和第三序列结构域(与反向PCR扩增引物特异性结合)。
从含有生物样品的溶液和本发明的收集溶液提取核酸
从生物样品收集多核苷酸群体之后，可以进行从收集溶液和微生物碎片(诸如蛋白、脂质和碳水化合物)提取或分离核酸的任何方法，如本领域普通技术人员已知的，包括但不限于，使用标准的苯酚/氯仿纯化，基于二氧化硅的方法，和基于磁性玻璃颗粒的提取方法。本发明中使用的组合物和方法与大多数，如果不是所有，商业上获得的核酸提取组合物和方法相容，诸如，但不限于QiaAmp® DNA迷你试剂盒(Qiagen®, Hilden, Germany)、MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics, USA)和NucliSENS® easyMAG®提取系统(bioMérieux, France)。通常，提取的基因组核酸以约0.1 微升至约10,000微升、更优选约1微升至约1000微升，更优选约10微升至100微升的量存在。核酸的示例性量为25微升。
在PrimeMix®的示例性组合物和方法中，将本发明的引物和探针添加至特定制剂中，从而使得可以进行PCR。优选地，约8 μM正向和反向引物，约6 μM探针和约1个单位的Taq存在于PrimeMix®中。PrimeMix®的额外组分的示例性浓度范围可见于表1A中，PrimeStore®的额外组分的示例性浓度范围可见于表1B中。
表1A
用于制备PrimeMix®组合物的示例性组分的制剂范围
试剂 组分最终浓度范围
1. 一种或多种缓冲剂，例如： 约1 mM至约1 M
Tris、柠檬酸盐、MES、BES、Bis-Tris、
HEPES、MOPS、Bicine、Tricine、ADA、
ACES、PIPES、碳酸氢盐、磷酸盐
2. 一种或多种聚合酶链式反应摩尔渗透压浓度试剂、
阳离子官能化两性离子化合物、例如： 约1mM至约1 M
甜菜碱、DMSO、甲酰胺、甘油、
非离子型去污剂、BSA、聚乙二醇、四甲基氯化铵
3. 一种或多种螯合剂，例如： 约0.01 mM至约1 mM
EGTA、HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、
无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、
柠檬酸铵、柠檬酸氢铵(ammonium bicitrate)、
柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、
柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂
4. 一种或多种染料，例如： 约0.01 mM至约50 mM
荧光素、5-羧基-X-罗丹明、ROX™
5. 一种或多种盐，例如： 约50 mM至约1 M
氯化钾、硫酸镁、谷氨酸钾
6. 一种或多种聚合酶，例如： 约0.05U至约1U
Taq、Pfu、KOD、
热启动聚合酶、下一代聚合酶
7. 脱氧核苷三磷酸，例如： 约0.1 mM至约1 mM
dATP、dTTP、dGTP、dCTP、dUTP。
优选地，将足够量的引物和探针添加至该制剂以扩增和检测所需目标。
2-氨基-2-羟基甲基-丙烷-1,3-二醇(TRIS)从Applied Biosystems/Ambion (Austin, TX, USA)获得。2-[2-(双(羧基甲基)氨基)乙基-(羧基甲基)氨基]乙酸(EDTA) GIBCO® UltraPure BSA从Invitrogen™ Corp. (Carlsbad, CA, USA)获得。所有其他试剂从Sigma-Aldrich或USB Corporation可商业获得。
在一个实施方案中，如下制备10X缓冲溶液：
将2500 μL 2 M Tris (pH 8.0)添加至无菌5.0 mL冷冻管。
将3500 μL 2 M KCl添加至小瓶。
将300 μL MgSO4添加至小瓶。
将900 μL 5M甜菜碱添加至小瓶。
将200 μL ROX™添加至小瓶。
将50 μL BSA添加至小瓶。
将800 μL dNTP混合物添加至小瓶。
将20 μL 0.5 M EDTA添加至小瓶。
将1600 μL + 130 μL不含核酸酶的水添加至小瓶。
密闭小瓶并且脉冲涡旋以彻底混合内容物。
使用38% HCl将溶液的pH调节至pH 8.1-8.3。
将溶液等分或转移至无菌容器中。储存在-20℃，直到准备使用。
当在PrimeMix®内使用时，将该10X缓冲液稀释至约0.5X至约2X，优选地，约1X。
表1 B
用于制备PrimeStore™组合物的示例性组分的制剂范围
试剂 组分终浓度范围
1. 离液剂，例如：
硫氰酸胍 约0.5 M-约6 M
或盐酸胍 约0.5 M-约6 M
或异氰酸胍 约0.5 M-约6 M
2. 阴离子去污剂，例如：
N-十二烷酰肌氨酸(尤其是Na盐) 约0.15%-约1% (重量/体积)
或十二烷基硫酸钠， 相同
十二烷基硫酸锂， 相同
甘氨胆酸钠， 相同
脱氧胆酸钠， 相同
牛磺脱氧胆酸钠，或 相同
胆酸钠 约0.1%-约1% (重量/体积)
3. 还原剂，例如：
TCEP 约0.5 mM-约30 mM
或β-ME、DTT、甲酰胺或DMSO 约0.05 M-约0.3 M
4. 螯合剂，例如：
柠檬酸钠 约0.5 mM-约50 mM
或 EDTA、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA或APCA 约0.01 mM-约1 mM
5. 缓冲剂(例如TRIS、HEPES、MOPS、MES、Bis-Tris等) 约1 mM-约1 M
6. 酸(例如HCl或柠檬酸) 适量调整到pH约6-7，优选6.4-6.8
7. 不含核酸酶的水 适量调整到所需最终体积
任选以下一种或多种：
8. 表面活性剂/消泡剂，例如：
Antifoam A®或Tween® 约0.0001%-约0.3% (重量/体积)
9. 烷醇(例如甲醇、乙醇、丙醇等) 约1%-约25% (体积/体积)
10. RNA或DNA 约1 pg-约1 µg/mL。
用于生物样品的多重分析的组合物和方法
在一些实施方案中，期望提供试剂混合物，所述试剂混合物包括超过一对扩增引物和对于给定目标核酸序列特异性的检测探针。例如，当期望确定两种或更多种不同类型的病原体的存在时，可以配制本发明的组合物以含有第一对扩增引物(其特异性结合一种病原体特异性多核苷酸的至少第一目标区域)和第二对扩增引物(其特异性结合另一种病原体特异性多核苷酸的至少第一目标区域)。
可替代地，当期望确定两种或更多种不同菌株的存在时，可以配制本发明的组合物以含有第一对扩增引物(其特异性结合特定病原体特异性多核苷酸的至少第一目标区域)和第二对扩增引物(其特异性结合第二种不同的病原体特异性多核苷酸的至少第一目标区域)。
此外，当期望确定一种或多种额外微生物的存在，即，鉴定患者是否被其他细菌或真菌或病毒感染所共感染，例如，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、人免疫缺陷病毒、肺炎球菌、流感、鼠疫杆菌(Yesinia pestis)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、链球菌属(Streptococcus sp.)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)、冠状病毒(Coronavirus)、腺病毒(Adenovirus)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)等。
在一些情况下，期望测试结核分枝杆菌复合群特异性多核苷酸内的耐药基因或突变。多药耐药(MDR)-TB菌株可能作为赋予对单一试剂的耐受的突变的相继积累的结果，或通过单一步骤过程诸如获得MDR元件而产生。已经鉴定了一系列赋予对利福平、INH、链霉素、乙胺丁醇、ETH、PZA、卡那霉素、喹诺酮类的耐药性的不同基因突变。出现了这些MDR分离株中的一些，因为通过亚治疗药物水平选择了编码个别抗微生物剂的目标的基因中的随机突变，所述亚治疗药物水平由治疗错误、对治疗方案的依从性差或其他因素所导致。
在这些实施方案中，可以配制本发明的组合物以含有第一对扩增引物(其特异性结合特定病原体特异性多核苷酸的至少第一目标区域)和第二对扩增引物(其特异性结合在例如多药耐药菌株或广泛耐药菌株中发现的耐药多核苷酸的至少第一目标区域)。例如，这可以包括对利福平和/或异烟肼的耐药性(对这些一线抗TB药物的耐药性典型地定义了多药耐药[MDR]病结核)，以及对喹诺酮家族中的一个或多个成员，或卡那霉素、卷曲霉素或阿米卡星或它们的任何组合的耐药性。
对于从此类组合物产生的特定扩增产物的检测，该组合物还将进一步包括：第一检测探针(其特异性结合从第一对扩增引物产生的扩增产物)和第二不同的检测探针(其特异性结合从第二对扩增引物产生的扩增产物)。在此类组合物中，优选的是，存在于制剂中的两种、三种或四种检测探针是不同的，从而使得各探针(如果特异性结合所得扩增混合物中的目标)可以使用常规方法单独地检测到。此类探针独特性是常规技术中容易实现的，使用，例如，包括检测部分的检测探针，所述检测部分在两种、三种或四种明显不同波长发荧光。
在本发明的一些方面，目标核酸的扩增和/或检测可以相继进行，而在其他方面，期望同时扩增和/或检测多个目标核酸。例如，首先可以筛选给定生物样品中结核分枝杆菌特异性目标序列的存在，并且如果没有发现，然后第二次筛选样品中牛分枝杆菌(M. bovis)、非洲分枝杆菌(M. africanum)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、M. cannetti、M. caprae和M. pinnipedi特异性目标序列的存在。
示例性定义
按照长期使用的专利法律惯例，当用于包括权利要求在内的本申请中时，单词“一个”和“一种”表示“一种或多种”。
本文所用术语“约”和“接近”可互换，通常应该理解为指给定数值附近的数值范围以及数值的所述范围内的所有数值(例如除非另外指出，否则“约5-15”意指“约5-约15”)。此外，本文所有数值范围应该理解为包括范围内的每一个整数。
本文所用术语“核酸”包括一种或多种以下类型：聚脱氧核糖核苷酸(含有 2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有 D-核糖)和任何其他类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。本文所用术语“核酸”也包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，核糖核苷或脱氧核糖核苷通常经由亚单位之间的磷酸二酯键但在某些情况下经由硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等共价键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。示例性核酸包括但不限于：gDNA；hnRNA；mRNA；rRNA、tRNA、微小RNA (miRNA)、小干扰RNA (siRNA)、核仁小RNA (snORNA)、核内小RNA (snRNA)和小时序RNA (stRNA)等及它们的任何组合。
在两种核酸背景下的术语“基本上相同”，是指以下两个或更多个序列或子序列，其当用序列比较算法或通过目视检查来比较和比对最大一致性时，具有以下核苷酸残基同一性：至少约90%、优选91%、最优选约92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更多。通常认为此类“基本上相同”序列是“同源的”，而不必参考实际的祖先。
微生物(包括但不限于原核生物，诸如古细菌和真细菌；蓝细菌；真菌、酵母、霉菌、放线菌；螺旋菌和支原体)；病毒(包括但不限于正嗜肝病毒属[包括例如甲、乙和丙型肝炎病毒]、人乳头瘤病毒、黄病毒属[包括例如登革病毒]、狂犬病毒属[包括例如狂犬病毒]、麻疹病毒属[包括例如麻疹病毒]、单纯病毒属[包括例如单纯疱疹病毒]、多瘤病毒属、腮腺炎病毒属[包括例如腮腺炎病毒]、风疹病毒属[包括例如风疹病毒]、水痘病毒属[包括例如水痘病毒]、轮状病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒、细小病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒等)、藻类、原生动物、原生生物、植物、苔藓类植物等及任何前述任何组合。
本发明也可用于监测在一种或多种全球人群之内、间或之间疾病爆发、进展、传播或一种或多种其他流行病学统计，包括但不限于，分枝杆菌感染的传播、结核性疾病的临床体征的发展和/或与一种或多种额外感染的伴随现象，所述额外感染诸如，但不限于，消耗综合征、登革热、埃博拉病毒、HIV、SARS、和一种或多种细菌或病毒感染，包括但不限于肺炎、流行性感冒等。在某些实施方案中，样品优选为哺乳动物来源，更优选人来源。
本文所用术语“基本上不含”或“本质上不含”，通常意味着组合物含有小于约10%重量，优选小于约5%重量，更优选小于约1%重量的化合物。在优选实施方案中，这些术语是指小于约0.5%重量，更优选小于约0.1%重量或甚至小于约0.01%重量。所述术语也包括完全不含化合物或其他规定性质的组合物。关于降解或变质，术语“基本上”也可指上述重量百分比，使得防止基本上的降解应指小于约15%重量、小于约10%重量、优选小于约5%重量等因降解而损失。在其他实施方案中，这些术语仅指百分比而不是重量百分比，诸如关于术语“基本上非致病的”，其中术语“基本上”是指留下小于约10%、小于约5%等致病活性。
本文所用术语“异源的”是就与预定参考核酸序列的关系来定义。例如，关于结构基因序列，将异源启动子定义为天然不存在于参考结构基因邻近但以一种或多种实验室操作人工放置的启动子，所述操作为由分子生物学领域普通技术人员常规采用的操作。同样，将异源基因或核酸区段定义为天然不存在于参考序列、启动子和/或增强子元件等邻近的基因或核酸区段。
本文所用“同源的”当提及多核苷酸时意指尽管由不同来源产生但具有基本上相同的核苷酸序列的序列。通常同源核酸序列来源于具有一个或多个基本上相似的基因组序列的紧密相关基因或生物体。相比之下，“同功的”多核苷酸为与来自不同物种或生物体的多核苷酸共有相同的功能的多核苷酸，但其可具有显著不同的一级核苷酸序列，所述一级核苷酸序列编码实现相似功能或具有相似生物学活性的一种或多种蛋白质或多肽。同功多核苷酸通常可源自非紧密相关(例如遗传或系统发生上)的两种或更多种生物体。
在两种或更多种核酸或多核苷酸序列背景下术语“相同的”或“同一性”百分比，指以下两个或更多个序列或子序列，其当在比较窗口内比较并比对最大一致性时，为相同的或具有规定百分比的相同核苷酸，如用序列比较算法或通过手工比对和目视检查来测定。
本文所用术语“基本上同源的”，包括在一级核苷酸序列水平上彼此显著相似的两个或更多个生物分子序列。例如，在两个或更多个核酸序列背景下，“基本上同源的”可指至少约75%、优选至少约80%和更优选至少约85%或至少约90%同一性，甚至更优选至少约95%、更优选至少约97%相同，更优选至少约98%相同、更优选至少约99%相同、甚至更优选完全相同(即100%或“不变的”)。
同样，本文所用术语“基本上相同的”包括在核苷酸水平上彼此表现高度同一性的两个或更多个生物分子序列(特别是多核苷酸序列)。例如，在两个或更多个核酸序列背景下，“基本上相同的”可指彼此至少约80%、更优选至少约85%或至少约90%相同的序列，甚至更优选至少约95%、更优选至少约97%相同、更优选至少约98%相同、更优选至少约99%相同和甚至更优选完全相同(即100%同一或“非简并的”)的序列。
本文所用术语“可操作地连接的”是指呈功能关系的两种或更多种多核苷酸或两个或更多个核酸序列的连接。当将核酸置于另一核酸序列的功能关系中时其为“可操作地连接的”。例如，启动子或增强子如果影响编码序列的转录，则为可操作地连接所述编码序列。“可操作地连接的”意指连接的核酸序列通常邻接或基本上邻接，并在需要将两个蛋白质编码区连接时，为相邻的且在读框中。因为增强子通常在与启动子相隔几千个碱基时起作用，并且内含子序列长度可变化；所以另一方面，一些多核苷酸元件可可操作地连接但不相邻。
以下实施例说明本发明的实施方案，但不应该被看作限制本发明的范围。
实施例
实施例1 -生物样品的收集、核酸提取和下游分子处理
在本发明的实施中，采集疑似患有结核病感染的受试者的口咽、鼻、气管和/或支气管的样品，通常为痰或灌洗样品的形式。本实施例描述使用PrimeStore® (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX, USA) (还详细描述于美国专利申请公开号:2009/0312285，其专门通过明确对其引用而整体并入本文)，这是一种专门配制用于下游分子诊断测试的临床或环境样品收集系统。
从痰库(University of Pretoria, South Africa)获得通过光镜观察而定性分级为+、++或+++的四份涂片阳性痰样本，并且通过使患者吐痰入样本杯而收集不同粘度。典型痰液体积为约5mL至约20mL的痰。将痰样品关于它们是否是血性、脓性、泡沫状、多泡状或唾液状进行定性观察。分级为“脓性”的样品是观察含有脓的样品，而分级为“唾液状”的样品含有比其他组分诸如粘液更大量的唾液。然后使用植绒拭子(Copan Italia S.p.A., Brescia, Italy)来通过在每个痰样本容器内旋转拭子五次而收集少量痰。在擦拭之前和每次擦拭之后将痰样本称重，以估计获得的痰的体积。每个拭子含有约25 mL至500 mL痰。将个别拭子转移到收集管中，每个收集管含有1.5 mL本发明的收集和保存制剂(“PrimeStore®”)。对各痰样品一式三份实施擦拭程序。还以1:1的比例将PrimeStore®添加至痰样本的剩余部分作为对照，并且然后放置在-4℃直到处理。将每个收集管中悬浮在PrimeStore®中的拭子保持在室温下约12小时，然后取出样品用于通过核酸提取和实时PCR进行核酸处理。根据制造商的说明使用AMPLICOR® MTB呼吸试剂盒(Roche)从对照剩余痰样本和拭子管的100 µL等分试样提取DNA。将所有样本以最大速度涡旋10秒，以提取核酸。根据制造商的说明使用NanoDrop® 1000分光光度计(Thermo Scientific, DE, USA)测量提取后的DNA浓度，计算结果显示在表2中。使用4 μl提取的DNA用于使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒(Roche Diagnostics, USA)的实时PCR。
PrimeStore®微生物灭活和微生物核酸的保存
显示PrimeStore®对于用于从生物样品制备核酸用于DNA和/或DNA提取技术和下游分子分析是有效的。如从表2中可以看出，每次擦拭后收集的体积范围为约0.05 mL至约0.5 mL。提取后的DNA浓度范围为约231至281 ng/µL。当比较对照样品的DNA浓度与通过使用拭子获得的样品的DNA浓度时，没有获得显著差异。
表 2
收集和在PrimeStore®中保存后痰样品的DNA浓度
实时PCR对于所有样本都是阳性的，除了其中发生PCR抑制的一份样本。结果显示于表3和图1中。
表 3
在PrimeStore®中浸没和使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒之后的实时PCR结果
*剩余样本(对照) -1/-2/-3表示擦拭顺序。
擦拭程序是用于直接从收集的痰样本收集样本用于下游分子处理的有用方法。在该研究中，提取后的DNA浓度显示出擦拭的和剩余的痰样本(对照)组分两者的类似范围。稀释在1.5 mL PrimeStore®中体积低至约50 µL的痰对于PCR分析是足够的。然而，在所述样本中的两份中，已经注意到Cτ值的~3 logs的延迟。在单抑制的情况下，这可能是由于作为从DNA提取过程至PCR的残留的结果的残留PrimeStore®溶液导致的。
从单次痰收集进行直接从PrimeStore®处理的擦拭样本的简单快速分子诊断处理以及日常常规检测。通过拭子转移至PrimeStore®获得的来自少量的涂片阳性TB样本的分子处理结果是可行且准确的。
实施例2 - 使用PrimeStore®失活结核菌素样品中的微生物
为了评价当暴露于PrimeStore®时痰样品内结核细菌的灭活程度，进行三项研究：
在第一项研究中，使结核分枝杆菌的已知MDR菌株在MGIT®基于液体的系统(Mycobacteria Growth Indicator Tube, Becton Dickinson, USA)中生长。该菌株的分离株是抗酸(AF)和涂片阳性的，并且使用Line Probe测定(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)证实多药耐受性(MDR)。将0.15 mL或0.5 mL已知MDR结核病菌株的接种物置于1.5 mL PrimeStore®中用于孵育2或10分钟。然后将各溶液涡旋，并且根据制造商的说明在MGIT®基于液体的系统中进一步培养。将未暴露于PrimeStore®的对照样品也置于MGIT®液体培养物中。
第二项研究将已知涂片阳性的痰样品(>10个抗酸杆菌[AFB]/每个高倍视野[hpf])置于1.5 mL PrimeStore®中持续1分钟或5分钟，随后进行Auramine O和Ziehl-Neelsen染色以观察细胞壁形态和完整性。
第三项研究使用105至106浓度的参考分枝杆菌菌株，即H37rv (University of Pretoria, South Africa)，来进行时间-杀死测定。将该菌株的0.5 mL接种物置于1.5 mL PrimeStore®持续5秒、10秒、20秒、40秒、80秒或160秒，然后将2滴获得的溶液各亚培养到Middlebrook 7H11琼脂(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)上。将未暴露于PrimeStore®的对照样品也同样铺板。在一个对照中，将0.5 mL H37rv菌株置于1.5 mL盐水中。在另一个对照中，将0.5 mL H37rv接种物直接置于Middlebrook 7H11琼脂上。将板保持在环境条件下30分钟，然后密封，并且在有氧条件下在37℃下孵育六周。一式两份进行该研究。
在第一项研究中，对于储存在PrimeStore®中的任何MDR结核样品都没有观察到在MGIT®液体培养物中的生长，甚至在42天孵育之后。未暴露于PrimeStore®的对照样品在9天后显示阳性生长。储存在PrimeStore®中的两份样品的进一步提取和扩增表现出良好分带，并且证实该核酸在PrimeStore®中的稳定性。
在第二项研究中，在任一暴露时间，在任何PrimeStore®孵育的样品中都没有观察到AFB。
在第三项研究中，在任何时间点在孵育42天后都没有观察到生长。7天之后，在对照板上检测到菌落形成单位。
PrimeStore®在非常短的暴露时间内杀死多种结核分枝杆菌菌株，从而证实PrimeStore®允许安全且快速的护理即时收集(point-of-care collection)且转运怀疑含有结核分枝杆菌的生物样品。
实施例3 - 结核菌素样品的储存、核酸提取、分子处理和结核病的诊断
使用如实施例1中所述的相同擦拭技术以及使用1：1 PrimeStore®比痰比例处理痰样品。在这些实验中使用的痰样品是如以前一样从痰库获得的，并且先前已经通过涂片镜检和培养结果进行分类。所有样品初始进行抗酸性表征(即，在涂片镜检上+、++、或+++的指示)，并且随后通过培养分类为阳性、阴性或稀疏的。
在范围为6天至6周的各个时间点从PrimeStore®中的痰样品提取DNA。如表4中显示，将PrimeStore®中的样本保持在环境温度下持续不同时间期间，然后进行核酸提取。根据制造商说明书分别进行经由QiaAmp® DNA迷你试剂盒(Qiagen®, Hilden, Germany)和MagNA Pure 96™系统(Roche Diagnostics, USA)的提取。将所有核酸提取物保持在-20℃直到进行处理用于扩增。
DNA提取物通过LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒(Roche)或使用本发明的母液混合物(下文中称为“Prime Mix Universal TB试剂盒”、“PrimeMix Universal TB试剂盒” 或简称为“PrimeMix”)来扩增。使用4 微升提取的核酸溶液和Prime Mix Universal TB试剂盒。所有上述系统都是实时PCR平台，其中在机上(onboard)检测产物。一式三份地进行Qiagen®提取物的扩增，以确定LightCyler®分枝杆菌检测试剂盒和Prime Mix Universal TB试剂盒的再现性。
如从表4可见，四份样品是涂片阳性的，七份样品是涂片阴性的，并且三份样品是稀疏的。
表 4
在核酸提取前样本在PrimeStore®中的持续时间
表 5
对于擦拭样本的使用各种提取试剂盒的涂片和实时PCR结果(Cτ值)
X表明没有进行该实验；(-)表明表示结果是阴性的。
分析结果的总结(获得Cτ值的数量/测试样品的数量)
表 6
对于以1:1比例浸没在PrimeStore®中的样品的使用各种提取试剂盒的涂片和实时PCR结果(Cτ值)
(-)表明没有获得结果。
如表5中可见，对于擦拭痰样品，使用QiaAmp® DNA迷你试剂盒或MagNA Pure™ 96系统提取DNA，然后使用本发明的PrimeMix®处理，当涂片样品呈弱阳性结果(即，“+”)时检测引起结核的细菌DNA的存在，不像使用QiaAmp® DNA迷你试剂盒或MagNA Pure™ 96系统提取的DNA那样，并且然后使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒进行处理，其没有检测到任何引起结核病(TB)的细菌特异性核酸。重要的是，与LightCycler®分枝杆菌试剂盒能够检测相比，PrimeMix®测定法能够检测更多涂片阴性、培养阳性样本中引起结核的细菌核酸。当分析更大量的痰时，使用PrimeMix®和Lightcycler®程序两者同样检测引起结核病的细菌DNA。
总体而言，与LightCycler®试剂盒的不同结果相比，擦拭技术的表现和使用PrimeStore®显示与使用PrimeMix®一致的结果。PrimeStore®显示与不同提取系统相容性，在任何情况下都不抑制PCR(这是阴性结果的原因)。
实施例4 - PrimeStore®与诊断测定法的相容性
从怀疑具有肺结核的患者获得十五份涂片阳性痰样品和十五份涂片阴性痰样品(如通过金胺O染色确定)。使用线探针测定法测试涂片阳性样品，随后培养。还培养涂片阴性样品。然后通常将所有未处理痰样品液化、去污染并且使用NaLc/NaOH (“DTT/NaOH”)程序进行浓缩，如本领域普通技术人员已知的，和如以下中所述的：
其全部内容通过明确引用而整体并入本文。通常，在培养方法和针对结核分枝杆菌进行核酸检测之前使用NaLc/NaOH程序。然后将0.5 mL NaCl/NaOH处理的痰样品的等分试样添加至PrimeStore®，并且储存过夜。还使用对照，其中没有将0.5 mL NaCl/NaOH处理的痰样品的等分试样添加至PrimeStore®。经由AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒(Roche)进行提取。使用两种商业测定法LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒(Roche)和Genotype MTBDRplus (Hain Lifesciences GmbH)来检测结核分枝杆菌特异性核酸的是否存在。发现Genotype MTBDRplus测定法与PrimeStore®接触性未处理的痰样品的使用相容，并且使用该测定法在这些样品中检测到耐药性TB菌株。
表7显示用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒(LC)获得的结果。
表 7
PrimeStore®用于去污染之后分子检测的适宜性
如表7中可见，在PrimeStore®中储存之后，LightCycler®测定法在涂片阴性样品中检测为结核分枝杆菌阳性，当不使用PrimeStore®时没有获得该结果。因此，PrimeStore®可以具有检测较少量的结核分枝杆菌的较高能力。否则，获得的结果是相当的，并且因此PrimeStore®与商业上获得的检测测定法相容。
实施例5 - 在PrimeStore®中储存之后结核分枝杆菌的检测灵敏度
该评价中包括来自痰库(University of Pretoria, South Africa)的七份涂片阴性、培养阳性样本和三份稀疏样本(SC1、SC7和SC9)。然后使用植绒拭子(Copan)来通过在每个痰样本(在冷冻管中500 µL)内旋转拭子而收集少量痰。将个别拭子转移到PrimeStore®收集管中，每个收集管含有1.2 mL PrimeStore®溶液。在擦拭之前和每次擦拭之后将痰标本称重，以估计从样本获得的痰的体积。还以1:1的比例将PrimeStore®溶液添加至痰样本的剩余部分作为对照。将每个收集管中悬浮在PrimeStore®溶液中的拭子保持在室温下约12小时，然后通过实时PCR进行处理。使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒从剩余痰样本(对照)和拭子管提取DNA。还根据常规NaLc/NaOH程序处理从相同培养物获得的痰样本，并且使用AMPLICOR®方案提取。还使用Invitrogen™ iPrep™ Purelink™ Virus Kit (Carlsbad, CA, USA)从这些样本评价来自粗痰的额外提取方法。将所有样本以最大速度涡旋10秒，并且使用100-µL等分试样用于提取程序。使用NanoDrop® 1000仪器测定提取后的DNA浓度。使用4 μl提取的DNA用于使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒的实时PCR。
如从表8中可以看出，每次擦拭后收集的体积范围为约0.05 mL至约0.1 mL。对于拭子、PrimeStore® (1:1)和NaLc/NaOH样本，提取后的DNA浓度范围为约205至706 ng/µL。从Invitrogen™ iPrep™ Purelink™ Virus Kit (Carlsbad, CA, USA)提取的粗痰具有范围为约7.0至约22.6 ng/µL的DNA浓度。
表 8
痰表征、估计的拭子体积和提取后的DNA浓度
*1:1是PrimeStore与临床痰样品的比例。
实时PCR结果可见表9和图2中。
表9
使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒的样品的实时PCR结果
(-)符号表明没有获得结果。
对于拭子样本，在稀疏样本中的两份(即，稀疏1和稀疏9)中没有观察到扩增。与常规NaLc/NaOH 方法相比，当以1:1比例使用PrimeStore®时或通过擦拭观察到对于涂片阴性、培养阳性样品的灵敏度增加100％。事实上，与常规NaLc/NaOH 方法的相比，通过擦拭或以1:1比例使用PrimeStore®导致检测到两份额外的涂片阴性、培养阳性样品。通常，Invitrogen™的试剂盒比AMPLICOR®的更有效，因此PrimeStore®数据和通过使用Invitrogen™获得的之间的任何变化都可以通过该差异来解释。
实施例6 - 含有IPC的PrimeStore®制剂
本实施例描述了非特异性外源性内部阳性对照(IPC)多核苷酸用于跟踪从收集点到使用PrimeStore® (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX, USA)收集系统的分子分析的样本的完整性的用途。
使用用于细菌和真菌回收的膜过滤法来评价PrimeStore®的杀死能力。可以使用大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌[非耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)]、白色念珠菌、枯草杆菌和巴西黑曲霉(Aspergillus brasiliensis)来确定PrimeStore®是否可以有效杀死和灭活的细菌和霉菌的实验对象组(酵母和丝状真菌)。仅在第0天进行在水基质中孵育的阳性对照。将每种细菌菌株的1 × 106 c.f.u.群体在每个时间点接种到0.5 mL PrimeStore®，并且随后在20-25℃孵育。在第0、1、7、14 和28天对容器计数且评价。将接种物无菌通过无菌过滤装置，并且随后用100 mL无菌中和液D[1 g动物组织的肽消化物(蛋白胨)和1 mL 聚山梨醇酯80溶解在1.0 l无菌水中(最终pH 7.1 ± 0.2)]冲洗三次。必要时，进行接种的测试物品的稀释以便递送25-250 c.f.u./每个滤器的目标计数。对于每个时间点，以类似方式处理接种的阴性对照。将用含有细菌的样品接种的滤液铺板到具有卵磷脂和聚山梨醇酯80的胰蛋白酶大豆琼脂(TSAP)上，并且在30-35℃下孵育72小时。用含有酵母或霉菌的样品接种的滤液铺板到沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar, SAB)上，并且在20-25℃孵育不少于72小时，但不超过5天。将菌落计数来计算log10回收率和在微生物攻击期间使用的每种生物体的百分比(%)杀死。
将含有约108 cfu MRSA (ATCC 33592)的储存板转移至TSB，简单涡旋并且在环境温度下孵育10 min。将总共0.1 mL细菌悬浮液转移至0.9 mL PrimeStore®，并且涡旋60秒。将总共0.1 mL悬浮液转移到0.3 mL TSB(1:4稀释)，并且在0、5和15 min之后将100 μL转移到血琼脂平板(TSA中5％绵羊RBC)。阳性对照包括等体积的MRSA和TSB。使板干燥，在37℃下孵育过夜，并且分析cfu/mL。
显示PrimeStore®迅速灭活微生物，包括真菌、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌和病毒。使用用于定量细菌和真菌的膜过滤技术进行抗菌有效性测试。在第一次测试期间(24小时)，与阳性对照相比，100％的细菌和真菌被杀死。对于这些微生物，PrimeStore®符合如USP第1类产品(注射剂、乳剂、眼用产品、无菌鼻产品和用碱水溶液或媒介物制备的眼用产品)中所述的灭活标准。此外，使用USP 51中所述的方法攻击枯草芽孢杆菌孢子，以进一步评价微生物群体的PrimeStore®灭活。枯草芽孢杆菌孢子在暴露的24小时之内减少99％。在将MRSA 接种进PrimeStore®的时间-杀死研究中，在最早研究时间(接种后5 min)或在任何随后的评价时间都没有检测到活细菌(100％杀死)。数据还表明，PrimeStore®快速杀死来自临床痰样品的结核分枝杆菌。
在说明性实施方案中，已经描述了一种独特的IPC ssRNA，可以将所述IPC ssRNA预先添加(例如，约3 × 105目标拷贝/0.5 mL)到PrimeStore®中，并且用作内部对照，以验证从样品收集时间到提取和检测的样品稳定性。此外，IPC ssRNA可用作载体物种(特别是含有非常低水平目标核酸的样品)，并且充当用于从收集点到核酸分析监测核酸提取的完整性、效率和保真度的对照。适用于配制在PrimeStore®中的示例性IPC包括，但不限于，外源和/或合成产生(体外)的ssDNAs或ssRNAs，并且优选地包括与哺乳动物宿主或其中含有的一种或多种病原体或正常菌群中存在的多核苷酸序列非同源(例如，如通过BLAST基于计算机的分析确定)的那些聚合物。
已经显示PrimeStore®通过改进初始收集的样本中目标微生物核酸的质量而有利于初始临床样品的标准测序和宏基因组分析，甚至当它们在几小时或者甚至几天之后到达分析实验室时，包括在低于理想的条件，甚至在周围环境条件下储存和/或运输的那些。从在环境温度下在PrimeStore®中保存和运输几周的病毒RNA已经观察到超过1400个碱基的RT-PCR扩增片段的回收。在严苛条件下，即38℃孵育，从PrimeStore®保存病毒观察到574-bp和825-bp片段的RT—PCR扩增，其中从商业VTM中的储存病毒没有观察到扩增。
重要的是，已经证明PrimeStore®与许多商业核酸提取试剂盒相容。根据标准制造商的方案直接从PrimeStore®提取核酸，其中只有在基于柱的试剂盒或基于珠粒的试剂盒之间观察到Cτ值的细微差异。此外，PrimeStore®作为完整Longhorn Influenza A/H1N1-09 Prime RRT-PCR Assay™的部分获得FDA紧急使用授权。PrimeStore®是接受EUA FDA批准的第一种分子运输介质，并且首次含有IPC作为对照以监测从收集到检测的样本降解。
实施例7 - PrimeStore®用于微生物样品和RNA分离物的延长保护
本实施例证明了PrimeStore®制剂灭活致病生物体、但保留从此类灭活生物体分离的RNA的长期储存和保留的有用性。作为示例性实施方案，使用PrimeStore®来收集含有A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)流感病毒的生物样品。结果表明，该制剂不仅灭活收集样品中的H5N1和A/Mexico/4108/09 (H1N1，临床分离株)病毒，而且保存着微生物RNA用于后续PCR分析。本研究证明，PrimeStore®试剂(1:100稀释)至Madin-Darby犬肾细胞单层的细胞病变效应(CPE)或CPE样反应的缺乏，PrimeStore®灭活活H5N1病毒(1.26 × 107 TCID50)的功效，和PrimeStore®在环境条件下保存来自H5N1和H1N1的病毒RNA长达62天用于实时PCR分析(导致RNA产物丰度的检测)的能力。
本研究的第1部分由两部分组成：(1) 在Madin-Darby犬肾(MDCK)上皮细胞上PrimeStore®试剂的体外毒性评价和(2)PrimeStore®试剂针对H5N1的灭活测试的功效。本研究的第2部分评价作为在PrimeStore®中长期储存流感病毒的直接结果受影响的H5N1和H1N1 RNA的质量。
第1部分的体外毒性评价通过用0.1-mL病毒储存缓冲液(完整细胞培养基或最低必需培养基 + 10%胎牛血清)一式三份装载样品收集拭子而进行，置于含有1.5 mL PrimeStore®的5-mL管中，并且在室温(环境温度)下孵育10、30或60分钟。孵育后，使用两种方法处理拭子：(1) 取出来自病毒储存缓冲液+ PrimeStore®样品的等分试样，并且在含有MDCK细胞单层的96-孔板中在完全细胞培养基中连续稀释(10-倍)至1040。使细胞孵育长达96小时，然后肉眼检查细胞病变效应(CPE)的存在，并检查表现出确定没有观察到的CPE的稀释度。(2) 从PrimeStore®取出每种病毒储存缓冲液装载的拭子，并放置在含有10 mL完全细胞培养基的50-mL锥形管中。将拭子以200 rpm搅拌15 min，取出每种提取物的等分试样，并且在含有MDCK细胞单层的96-孔板中在完全细胞培养基中连续稀释(10-倍)。使细胞孵育长达96小时，然后肉眼检查CPE的存在，并检查表现出确定没有观察到的CPE的稀释度。
基于来自体外毒性评价的结果进行第1部分的灭活功效研究。样品收集拭子(n = 6)用0.1 mL H5N1 (1-5 × 107 TCID50/mL)或病毒储存缓冲液(阴性对照，n = 3)装载，置于含有1.5 mL PrimeStore®的5-mL管中，并且在环境条件下孵育10、30或60 min。孵育后，使用从体外毒性试验确定的最适当方法处理拭子。使细胞孵育长达96小时，然后肉眼检查细胞病变效应(CPE)的存在，并确定总TCID50。与未处理的对照相比，在log减少的方面计算灭活功效。
第2部分的延长的环境储存研究涉及在室温下将H5N1和H1N1 RNA在PrimeStore®中保存长达62天。时间点是第0天(H5N1接种到PrimeStore®的那天)、从接种日起+1、+2、+5、+7、+14、+30、和+62天。在接种到PrimeStore®之前，将H5N1和H1N1病毒稀释至1 × 105TCID50。在每个时间点，对在PrimeStore®中储存的H5N1和H1N1样品两者进行使用RNAqueous-Micro Kit (Ambion目录号AM1931, Austin, TX, USA)的RNA分离。将所得RNA储存在< -80℃，直到分离所有时间点的RNA。在Applied Biosystems (Forster City, CA, USA) 7900HT (Fast Real-Time PCR System)上进行实时PCR。
第1部分的体外毒性评价中使用的第一种方法(取出来自病毒储存缓冲液+ PrimeStore®样品的等分试样，并且连续稀释，然后添加至96-孔板)导致在所有时间点(10、30和60 min)在1:10,000的IVIDCK细胞单层中观察到CPE或CPE样反应。第1部分的体外毒性评价中使用的第二种方法(从PrimeStore®取出每种病毒储存缓冲液装载的拭子，并放置在含有10 mL完全细胞培养基的50-mL锥形管中，将拭子搅动15 min，取出每种提取物的等分试样并且连续稀释)导致在所有时间点在1:100的MDCK细胞单层中观察到CPE或CPE样反应。因此，第1部分的体外毒性评价确定样品提取的第二种方法导致PrimeStore®对MDCK细胞的CPE或CPE样反应，并且第二种方法被认为对于第1部分的灭活测试的功效是适合的。选择60-min时间点(即，记录的最长时间点)用于功效试验，因为它没有确定CPE或CPE样反应是否对应任何时间点。时间最长点的CPE或CPE样反应等同于最短时间点(10 min)，这清楚地表明，CPE或CPE样反应是稀释度(1:100)和提取方法(第二种方法)依赖性的。
第1部分的灭活测试的功效导致没有可检测的活H5N1，因为病毒回收率等同于阴性对照(即，没有添加病毒的PrimeStore®)。然而，阳性对照(即，没有添加PrimeStore®，使用细胞培养基以代替PrimeStore®试剂，添加病毒) 如预期导致优异的H5N1回收率(67.59％平均回收率)。结果表明，PrimeStore®试剂在60 min时能够将高滴度的H5N1 (1.26 × 107 TCID50)灭活下降至阴性对照的水平。
来自第2部分的延长环境储存研究的实时PCR结果显示，来自从在62天的最长时间点提取的RNA的所有四种测定的目标检测(BBRC H1N1、BBRC H5N1、Longhorn H1N1、和Longhorn H5N1)证明和在第0天(接种日)的最短时间点一样敏感(所有平均Cτ <26.00)。结果表明，PrimeStore®试剂在环境条件下在延长储存期间过程中对RNA没有有害作用。
实施例8 - 含有分枝杆菌特异性核酸的样本的分析
通用物种特异性测定靶向IS6110基因的高度保守区域，所述区域是结核分枝杆菌复合群的成员中几乎唯一发现的插入元件。可以在结核分枝杆菌复合群的成员的基因组中不同位置发现多个拷贝的IS6110元件，所以这些引物也可以帮助菌株的基因分型。所有引物和探针从Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)购买。
基于实验室的LightCycler® 2.0仪器(Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)和其轻巧便携(50-lb)版本, Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (R.A.P.I.D., Idaho Technologies, Salt Lake City, UT, USA)都是采用类似组件和操作软件的32孔毛细管实时仪器。将R.A.P.I.D.配置在硬化盒中，并且可以远程利用(例如，在现场，或者在护理点)。
引物和探针序列如上显示。引物对熔点在2℃之内并且在58-60℃退火/延伸。相应的探针退火/延伸温度比引物高8-10℃。热循环以退火和延伸的快速、2-温度形式运行，各自在60℃持续总共至少约30秒，相应扩增子的短性质促进了这一点。
实时扩增以单步骤、单反应容器形式进行。使用PrimeMix® Universal MTB测定法(Longhorn Vaccines & Diagnostics, USA)，将2 µL、3 µL、4 µL 或5 µL核酸分别添加至18 µL、17 µL、16 µL 或15 µL的含有以下所示终浓度的组分的母液混合物(即PrimeMix®)中：(a) 含有50 mM Tris(pH8.0)、70 mM KCl、3 mM MgSO4、45 mM甜菜碱、0.05 μM ROX™、0.025 μg/μL超纯BSA、0.2 mM dNTPs、和0.1 mM EDTA的1X反应缓冲液；(b) 含有20 μM每种引物、1个单位Taq聚合酶和20 μM标记探针的1X酶混合物。用于扩增结核分枝杆菌目标序列的正向引物由以下序列组成：。用于扩增结核分枝杆菌目标序列的反向引物由以下序列组成：。用于检测结核分枝杆菌目标序列的存在的标记探针由以下序列组成：。图5显示，添加更多模板结核分枝杆菌DNA，即，5 μL而不是2 μL提取的患者DNA，导致产生稍好的RT-PCR扩增和检测结果，即对于2 μL，25.1的平均Cτ值，相比之下，对于5 μL，23.4的平均Cτ值。
如下进行热循环：在95℃下初始热启动5 min，随后40个循环的95℃变性10秒，和在60℃下组合退火和延伸32秒。根据以下公式使用Cτ斜率法确定扩增效率：E = [10(-1/斜率)- 1] × 100。此处描述的所有测定都表现出大于98.5%扩增效率。
对于每次分析，包括“无模板”和“阳性”对照。将每次分析的基线荧光手动调整至各自“无模板”对照反应的荧光。‘阳性'对照引起相对于无模板基线的荧光强度增加。未知‘阳性'被定义超过基线荧光的扩增，其中相应Cτ值在40个循环运行中不超过36。
样品通过在痰样本周围旋转Copan拭子五次而收集，并且浸泡在含有1.5 mL PrimeStore®溶液的PrimeStore®收集管中。还如上所述使用1:1的样品对PrimeStore®的比例。在该评价之前，使用AMPLICOR®呼吸样本制备提取试剂盒提取擦拭材料，并且使用LightCycler®分枝杆菌检测试剂盒进行扩增。将样本保持在环境温度下约6 – 30天，然后提取核酸并且如上所述使用PrimeMixTM Universal MTB测定法进行扩增。在4℃将PrimeMixTM Universal MTB测定法从美国运到实验室(4天)，并且一旦收到，就维持在室温下48小时，然后储存在-20℃。
根据制造商说明书使用QIAamp® DNA迷你试剂盒(Qiagen®, Hilden, Germany)提取核酸。将200µl在PrimeStore®中的擦拭材料简单涡旋(例如，5至10秒)，并且用作开始原料用于提取程序。
使用PrimeMixTM Universal MTB测定法进行核酸扩增。用于扩增结核分枝杆菌目标序列的正向引物由以下序列组成：。用于扩增结核分枝杆菌目标序列的反向引物由以下序列组成：。用于检测结核分枝杆菌目标序列的存在的标记探针由以下序列组成：。PCR反应液含有18µl PrimeMixTM Universal MTB和2 µL提取的核酸。扩增概况由以下组成：在95℃下初始热启动5 min，随后40个循环的95℃变性10秒，和在60℃下组合退火和延伸32秒，如上所述。扩增在LightCycler® 480平台(Roche)上进行，并且由于探针的FAM标记而检测扩增子。
类似于上述实施例，使用以下方案进行比较研究：(1) NaLc/NaOH去污染程序，随后通过使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒的提取并且使用LightCycler®分枝杆菌扩增(MTB)试剂盒来扩增；(2) 将培养物擦拭到PrimeStore®的程序，然后通过使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒来提取，并且使用LightCycler® MTB试剂盒来扩增；(3) 1:1样本比PrimeStore®的比例，然后通过使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒来提取，并且使用LightCycler® MTB试剂盒来扩增；(4) 将培养物擦拭到PrimeStore®的程序，然后通过使用AMPLICOR®呼吸样本制备试剂盒来提取，并且使用PrimeMix® Universal MTB试剂盒来扩增；并且(5) 将培养物擦拭到PrimeStore®的程序，然后通过使用QIAamp® DNA迷你试剂盒来提取，并且使用LightCycler® MTB试剂盒来扩增。
PrimeMix® Universal MTB测定的结果可见于表10和表11中。
表 10
样本信息
表11
使用不同处理方法的PCR结果的比较
(-)符号表明没有获得结果。
PrimeMixTM Universal MTB测定法检测71%的涂片阴性病例以及100%的涂片阳性病例。PrimeMixTM Universal MTB测定法检测到比使用LightCycler® MTB更高数目的培养阳性样品。PrimeMixTM Universal MTB测定法与使用PrimeStore®溶液相容。
实施例9 - PrimeMix® Universal MTB测定法的稳定性
如上所述PrimeMix® Universal MTB组分从-20℃温度储存中取出，并且在室温下放置不同次数，即，1、3、5和10次，以确定组合试剂的稳定性和重复融冻是否会抑制PrimeMix® Universal MTB测定法在检测核酸样品中的结核分枝杆菌复合群中的表现。单一管中的所有测定组分在室温下融化约三至约五分钟。然后将管放置在-20℃温度约一小时以开始下一次冻融循环。最后冻融循环之后，如上所述使用先前鉴定的MDR-TB菌株(University of Pretoria, South Africa)进行RT-PCR用于PrimeMix® Universal MTB测定法。一式三份进行实验用于每次冻融循环，并且将所得Cτ值取平均值。
在许多冻/融循环之后PrimeMix® Universal MTB测定法的结果可见于图3中。如从该图可以看出，PrimeMix® Universal MTB测定法显示PCR扩增没有减少，如所得Cτ值(其彼此没有显著不同，甚至当PrimeMix® Universal MTB测定组分融化和再冷冻10次时彼此也没有显著不同)所指明的。一次融冻循环(Cτ = 23.6)和十次融冻循环(Cτ = 23.7)之后的平均Cτ值没有显著不同。因此，PrimeMix® Universal MTB测定法含有在不同温度条件不会降解的稳定组分，使得它特别适合在远离传统实验室设置的现场使用。
实施例10 - 检测一种或多种IPC以监测在PrimeMix测定中样品完整性/核酸保真度。
待置于PrimeStore®中的内部阳性对照连同检测其的引物和探针的设计
如上所述，在某些实施方案中，期望包括核酸载体分子和/或IPC序列以有助于制备、稳定和定量分离的多核苷酸。本发明IPC可用常规方法直接化学合成，或可替代地，用重组DNA技术制备。期望配制出既是非基因组的又不能与哺乳动物基因组或目的病原体物种基因组显著杂交的IPC序列。具体组合物和使用方法可见申请人共同在审查中的美国专利申请公开号2009/0233309 (2009年4月20日提交)，其内容通过引用而整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明人采用包含SEQ ID NO:8序列的单链RNA分子
作为内部阳性对照来监测被测定的核酸的保真度和完整性。通常，将约0.02 pg/mL单链DNA目标置于PrimeStore®中。在示例性实施方案中，选择的扩增引物和标记的寡核苷酸检测探针优选各自结合至少第一分离的核苷酸序列SEQ ID NO:8。使用以下特异性扩增引物，所得扩增产物为约100-bp长：
正向引物：
反向引物：。
作为对该扩增产物特异性的说明性寡核苷酸检测探针，本发明人选择序列。
可用于本发明实施中的IPC不必包含本文所述的说明性序列之一，IPC甚至也不必与本文包括的任何IPC序列基本上同源。为了说明这一点，以下序列代表尽管具有序列简并性但也作为载体DNA/IPC序列起作用的SEQ ID NO:8变体：
本发明IPC不必按照本文如SEQ ID NO:8公开的准确的说明性DNA扩增子来制备。可用于体外制备合适载体RNA分子的DNA序列的另外实例包括但不限于以下序列中的一个或多个。在每一种情况下，以单下划线显示聚合酶转录位点，同时以双下划线显示示例性正向和反向PCR引物结合结构域的序列。以粗体显示合适的标记的分子探针结合的示例性序列结构域。
其中X为任何核苷酸，n为0 -约500的任何整数。
实施例11 - IPC DNA荧光探针检测
IPC检测探针可以包括放射性标记、发光标记、化学发光标记、荧光标记、酶标记、磁性标记或自旋共振标记、或它们的组合。荧光标记可以包括荧光素、6-羧基荧光素(6-FAM)或6-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(6-FAMSE)、VIC™染料等、或它们的组合。
一旦进行RT-PCR，通过本领域普通技术人员已知的方法用6-FAM (FAM)或VIC™染料标记IPC检测探针(SEQ ID NO:11)，以评价它们对样品中IPC的检测的作用。含有这些探针以及IPC引物(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)的PrimeMix®用于扩增，然后检测IPC的存在。对于每种类型的标记探针，该实验进行4次。使用ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems™, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA)进行检测。如图4中可见，在用VIC™染料标记的IPC检测探针的Cτ值(Cτ值= 32.5)和用6-FAM标记的Cτ值(Cτ值= 31.5)之间没有显著差异。因此，所用探针标记类型在分析和评价IPC的存在和数量中具有最小影响至没有影响。
实施例12 - 多重测定：内部阳性对照组合PrimeMix® Universal MTB测定
如上所述，期望配制出既是非基因组的又不能与哺乳动物基因组或目的病原体物种基因组显著杂交的IPC序列。这是为了避免IPC引物和探针检测存在于提取的患者样品中的其他核酸，诸如来自患者自身或来自可能存在于样品中不是感兴趣的其他微生物的DNA的可能性。
为了确保本发明的IPC、IPC引物和IPC探针不会影响或抑制样品中结核分枝杆菌序列的扩增或检测，将单链DNA IPC置于含有约33 ng/μL先前鉴定的MDR-结核分枝杆菌DNA的PrimeStore®中。然后使用QIAamp® DNA迷你试剂盒(Qiagen®)提取核酸，并且如上所述，将含有结核分枝杆菌的引物和探针和IPC的PrimeMix®用于多重PrimeMix® Universal MTB测定法中。作为比较，对相同结核分枝杆菌菌株进行相同程序，但是不添加IPC、IPC引物或探针。对于多重和单重程序，一式三份进行该实验。如图6中可见，结核分枝杆菌核酸的扩增和检测没有受多重程序的显著影响，即多重程序的平均Cτ值(“MTB多重”)为24.6，而用于单重程序的Cτ值(“MTB”)为23.6。
实施例13 - 单重和多重测定：不同浓度的IPC
置于PrimeStore®中的IPC浓度不同。将10-5、10-6、10-7、和10-8 ng/μL IPC置于相同量的PrimeStore®中。根据是否进行单重或多重反应，还将结核分枝杆菌复合群特异性的引物组和探针置于PrimeMix®中。没有将结核分枝杆菌复合群特异性的核酸添加至到PrimeStore®溶液中。如图7中可见，在多重PrimeMix® Universal MTB测定(“IPC Vic在多重中”)改变IPC在PrimeStore®中的浓度显示当与单重PrimeMix®测定(仅对于IPC) (“IPC Fam”和“IPC Vic”)中相同浓度的IPC相比时没有显著差异。此外，当IPC浓度变化时，用6-FAM标记的IPC探针和VIC™染料标记的探针之间没有显著差异。
实施例14 - 单重和多重测定：不同浓度的结核分枝杆菌样品
如图8中可见，将如初始储存在1.5 mL PrimeStore®中的结核分枝杆菌样品的初始量从15 μL增加至150 μL (10倍差异)略微改善了从单重PrimeMix® Universal MTB测定法(15 μL样品的平均Cτ值= 26.5，150 μL样品的平均Cτ值= 24.1)和多重PrimeMix® Universal MTB测定法(15 μL样品的平均Cτ值 = 26.8，150 μL样品的平均Cτ值 = 24.2)获得的结果。IPC的检测如预期不受影响。如单重和多重PrimeMix® Universal MTB测定之间的Cτ值所测量，在MTB PCR扩增中几乎没有可观察到的差异。
实施例15 - 单重和多重测定：结核分枝杆菌菌株的检测
通过与上述程序类似的程序使用单重(“MTB单重”)和多重(“MTB在多重中”) PrimeMix®测试各种分枝杆菌菌株(即，五种不同结核分枝杆菌菌株，两种不同的鸟分枝杆菌菌株，一种胞内分枝杆菌菌株，一种岗地分枝杆菌菌株和一种堪萨斯分枝杆菌菌株)。根据约80至约180 ng/μL的痰样品的含量，核酸提取量有变化。如图9中可见，单重和多重测定都容易检测五种不同结核分枝杆菌菌株，但无法容易检测其他非MTB菌株。这表明PrimeMix®测定容易检测导致结核病的生物体而非其他分枝杆菌种类。用于MTB检测的单重和多重测定的结果之间没有检测到显著差异，表明单重和多重测定之间几乎没有灵敏度损失至没有灵敏度损失。在所有多重测定中容易检测到IPC，无论使用何种分枝杆菌菌株。
实施例16 - 单重和多重测定：结核分枝杆菌目标病原体的稀释
如图10中可见，改变来自特定纯化的菌株的结核分枝杆菌目标序列浓度的量(即10-4、10-3、10-2、10-1代表10倍稀释，其中10-1代表330 ng/μL的DNA浓度，10-2代表33 ng/μL的DNA浓度，10-3代表3.3 ng/μL的DNA浓度，且10-4代表0.33 ng/μL的DNA浓度)显著增加了PrimeMix®测定在单重和多重测定两者中结核分枝杆菌的能力。对于每种测定，IPC目标序列浓度为0.02 pg/mL。如在多重测定(其中目标序列的浓度通常比IPC目标的浓度高得多)中的表现所通常预期的，IPC检测受最高浓度的结核分枝杆菌核酸的影响最小。这可以通过增加测定中IPC目标序列的浓度或进一步摩尔优化多重反应中IPC引物和/或探针加以解决。
实施例17 - 多重测定：结核分枝杆菌菌株的稀释
如图11中可见，改变来自特定纯化的菌株的结核分枝杆菌核酸的量(即10-4、10-3、10-2、10-1代表10倍稀释，其中10-1代表33 ng/μL的DNA浓度，10-2代表3.3 ng/μL的DNA浓度，10-3代表0.33 ng/μL的DNA浓度，且10-4代表0.033 ng/μL的DNA浓度)对当使用6-FAM或VIC™染料标记的IPC探针时IPC的检测没有显著影响。用6-FAM标记的探针的确显示出整体更低的Cτ值，但两种检测方法同样有效。
实施例18 - 在各种BSA浓度的实时PCR循环阈值的变化
PCR DNA和/或RNA酶和10X PCR缓冲液通常提供在单独管中并保持在恒定的-20摄氏度。“母液混合物”制剂通常通过融化并组合酶和10X PCR缓冲液以及用于扩增的引物而制备。本发明是包括所有的掺合物，其在1x一次性管中包括用于实时扩增的缓冲液、盐、酶、引物和探针，所述包括所有的掺合物比本领域中的PCR缓冲液相当更热稳定。例如，与和Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, 目录号10966-018和10966-026)一起提供的商业10X PCR缓冲液相比，本发明包括添加BSA用于稳定反应中的PCR酶。
牛血清白蛋白(BSA)通常用于限制性内切酶反应中用于在DNA消化过程中稳定一些酶，并防止酶结合到反应管，特别是用于PCR的玻璃毛细管。因为其在延伸的，即，过夜限制性酶反应的稳定特征，BSA同样可以增强在PCR和RT-PCR扩增中使用的DNA和RNA聚合酶的稳定性和完整性，特别是当这些酶被储存在低于-20摄氏度的温度时。BSA据报道通过干扰抑制性物质和DNA污染物而稳定反应。BSA以0.1-0.5 mg/mL浓度的最终反应浓度的存在对下游聚合酶链式反应(PCR)没有有害影响，如通过实时PCR循环阈值所确定的。
甜菜碱改善了前列腺特异性膜抗原mRNA的两种替代剪接变体的共扩增和c-jun 的cDNA的扩增。甜菜碱和阳离子官能化的两性离子化合物通过减少富含GC区域引起的二级结构的形成而改善基因扩增，因此，通常可以适用于改善任何富含GC的DNA序列的扩增。PrimeMix中的甜菜碱保持和稳定个别核苷酸(A、T、C、G)，并且防止PCR引物和探针在PrimeMix溶液中的退火、稳定、水解和氧化降解。如通过实时扩增过程中的循环阈值所确定，以10-100 mM之间的终浓度存在的甜菜碱对PCR扩增具有累加效应。甜菜碱是一种稳定的分子，并且非常适合于保持在高于-20摄氏度的温度的PCR反应混合物中，因为它在扩增期间不促进核苷酸突变，并且它不会像DTT和DMSO那样容易降解。
缓冲液的最终pH对PCR扩增过程中的整体稳定性具有巨大影响。用于PCR的优选pH通常被报道为8.4，尽管碱性如9.0的缓冲液也是有效的。在含有酶、缓冲剂和引物的包括所有的混合物的本发明中，我们已经发现最佳pH为8.2 (+/- 0.1)。显示碱性稍弱的缓冲液增强实时PCR的PCR扩增，特别是当PrimeMix制剂在高于-20摄氏度的温度保持一段时间时。
使用在BSA的0.1-0.5 mg/mL梯度的PrimeMix Universal Influenza A(流感A)扩增流感A(H3N2)病毒(102 TCID50/mL)(参见图12)。如可见，在这些浓度在指出的实时PCR循环阈值没有变化，表明BSA对PCR无抑制。
通过考虑本文公开的本发明的说明书和实施，本发明的其他实施方案和用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本文引用的所有参考文献，包括所有出版物、美国和外国专利和专利申请，通过引用具体且整体并入本文。术语包含，无论在何处使用，意在包括术语由...组成和基本上由...组成。此外，术语包含、包括和含有并非意在进行限制。期望本说明书和实施例被认为仅仅在遵循由权利要求书所指示的本发明的真正范围和精神的情况下是示例性的。
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