本发明属于鹿茸加工领域，尤其涉及一种连续提取、纯化鹿茸寡肽、硫酸软骨素的方法。
背景技术：
鹿茸作为哺乳动物的组织组成部分，是独特的一类可再生的、生长速度快的组织。在《本草纲目》关于鹿茸的定义描述是：“生精补髓，养血益阳，强筋健骨，治一切虚损”。鹿茸的药理作用主要有：抵抗药物造成的损伤、抗机体氧化、增加耐受力等作用。
鹿茸含有多种生物活性物质，能够促进机体的生长发育和新陈代谢，增强机体的免疫功能，对神经系统和心血管系统具有良好的调节作用，对骨折及创伤愈合有促进作用。目前已知的促进组织和细胞生长的活性物质多为蛋白质及多肽类，而鹿茸中蛋白质及多肽的含量高达50％以上，相比于分子量较大的多肽，寡肽更容易消化吸收。鹿茸多糖主要以蛋白聚糖的形式存在，hoon等测得鹿茸中硫酸软骨素类约占多糖的88％。
鹿茸寡肽和硫酸软骨素取分离的方式目前有水提醇沉法、酶法、超声波、层析法等。但是，这些方法仍存在用时长、提取率不高、提取不连续等缺点，因此，有必要探索一种高效分离制备鹿茸寡肽和鹿茸硫酸软骨素的技术方法。
卫生部2014年公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中将鹿茸首次归入了药食同源类，为鹿茸系列产品开发研究提供新方式。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用酶解法从鹿茸中提取纯化鹿茸活性硫酸软骨素的方法。
1.一种利用酶解法从鹿茸中提取纯化鹿茸活性寡肽、硫酸软骨素的方法，该方法至少包括以下步骤：
步骤一：新鲜鹿茸去皮，清洗，按照料液重量比1:10～1:50加入蒸馏水配成鹿茸水溶液，调节溶液ph在9～11，在75～95℃加热20～40min；
步骤二：将上述溶液加入碱性蛋白酶酶解2～4h，加酶量为1％～5％，之后加入木瓜蛋白酶酶解，调节酶解的ph为6～8，酶解2～4h，加酶量为1％～5％，酶解后灭活；
步骤三：酶解灭活后的鹿茸溶液离心，分离出上清液和沉淀；
步骤四：将上述分离出来的沉淀，按照料液重量比1:10～1:50加入蒸馏水配成水溶液，加入碱性蛋白酶，进行二次酶解，调节ph9～11，酶解时间30～60min，加酶量为1％～5％，酶解后灭活，离心取上清液；
步骤五：将步骤三、四所得到的上清液合并，加入无水乙醇，使得溶液中乙醇浓度在60～80％，于4℃静置10～14h后，采用4000～10000r/min离心，分别收集上清液和沉淀；
步骤六：将步骤五所得到的沉淀，进行脱色，除蛋白，浓缩，干燥得到鹿茸硫酸软骨素粉；
步骤七：将步骤五所得到的上清液采用纳滤除去无机盐离子，超滤浓缩，经喷雾干燥制得鹿茸寡肽粉。
制备的鹿茸寡肽进行分子量鉴定，鹿茸寡肽分子量为200～400da。
有益效果：
本发明中，在提取鹿茸寡肽的过程中，同时提取了鹿茸硫酸软骨素，实现了对鹿茸中活性成分的有效利用；且采用复合蛋白酶结合二次酶解提取，相比于单酶单次提取或水提得率显著提高。其中，鹿茸寡肽得率提高20～40％，鹿茸硫酸软骨素得率提高30～50％。
鹿茸多肽具有增强免疫力、抗氧化、抗衰老等功效，鹿茸寡肽相比于鹿茸多肽，具有更利用人体消化吸收的特点；鹿茸硫酸软骨素具有保护胃黏膜、促进细胞代谢、降血糖血脂、改善骨骼质量等功效。本发明工艺简单，提取得率高，适用于推广和发展。
具体实施方式
实施例1
新鲜鹿茸去皮，称取去皮后的鹿茸1g，清洗，加入20ml蒸馏水配成鹿茸水溶液，用0.1mol/lnaoh调节溶液ph在9.5，在80℃加热25min。调节ph10，在温度45℃条件下加入0.8g碱性蛋白酶，酶活性≥200000u/g，酶解3h，之后用0.1mol/lhcl调节ph7，在温度65℃条件下加入0.8g木瓜蛋白酶，酶活性50000u/g，酶解3h。酶解后灭活。酶解灭活后的鹿茸溶液离心，分离出上清液和沉淀。沉淀加入10ml蒸馏水配成水溶液，加入0.4g碱性蛋白酶，调节ph10，酶解时间40min。酶解后灭活，离心取上清液。将二次离心后得到的上清液合并，真空旋转蒸发，水分全部蒸干后加入3ml蒸馏水溶解，加入7ml无水乙醇，使得最终溶液中乙醇浓度为70％，于4℃静置12h后，采用8000r/min离心，分别收集上清液和沉淀。沉淀进行脱色，除蛋白，浓缩，喷雾干燥得到鹿茸硫酸软骨素粉。上清液采用纳滤除去无机盐离子，超滤浓缩，经喷雾干燥制得鹿茸寡肽粉。对得到的鹿茸寡肽进行分子量鉴定，确定鹿茸寡肽分子量为300da。
实施例2
新鲜鹿茸去皮，称取去皮后的鹿茸1g，清洗，加入40ml蒸馏水配成鹿茸水溶液，用0.1mol/lnaoh调节溶液ph在10，在75℃加热40min。调节ph9，在温度35℃条件下加入1.2g碱性蛋白酶，酶活性≥200000u/g，酶解2h，之后用0.1mol/lhcl调节ph6.5，在温度55℃条件下加入1.2g木瓜蛋白酶，酶活性50000u/g，酶解2h。酶解后灭活。酶解灭活后的鹿茸溶液离心，分离出上清液和沉淀。沉淀加入10ml蒸馏水配成水溶液，加入0.4g碱性蛋白酶，调节ph9，酶解时间30min。酶解后灭活，离心取上清液。将二次离心后得到的上清液合并，真空旋转蒸发，水分全部蒸干后加入3ml蒸馏水溶解，加入7ml无水乙醇，使得最终溶液中乙醇浓度为70％，于4℃静置12h后，采用7000r/min离心，分别收集上清液和沉淀。沉淀进行脱色，除蛋白，浓缩，喷雾干燥得到鹿茸硫酸软骨素粉。上清液采用纳滤除去无机盐离子，超滤浓缩，经喷雾干燥制得鹿茸寡肽粉。对得到的鹿茸寡肽进行分子量鉴定，确定鹿茸寡肽分子量为450da。
实施例3
新鲜鹿茸去皮，称取去皮后的鹿茸10g，清洗，加入300ml蒸馏水配成鹿茸水溶液，用1mol/lnaoh调节溶液ph在10，在85℃加热30min。调节ph9.5，在温度45℃条件下加入9g碱性蛋白酶，酶活性≥200000u/g，酶解2h，之后用1mol/lhcl调节ph7，在温度60℃条件下加入9g木瓜蛋白酶，酶活性50000u/g，酶解2h。酶解后灭活。酶解灭活后的鹿茸溶液离心，分离出上清液和沉淀。沉淀加入100ml蒸馏水配成水溶液，加入4g碱性蛋白酶，调节ph10，酶解时间30min。酶解后灭活，离心取上清液。将二次离心后得到的上清液合并，真空旋转蒸发，水分全部蒸干后加入10ml蒸馏水溶解，加入40ml无水乙醇，使得最终溶液中乙醇浓度为80％，于4℃静置12h后，采用10000r/min离心，分别收集上清液和沉淀。沉淀进行脱色，除蛋白，浓缩，喷雾干燥得到鹿茸硫酸软骨素粉。上清液采用纳滤除去无机盐离子，超滤浓缩，经喷雾干燥制得鹿茸寡肽粉。对得到的鹿茸寡肽进行分子量鉴定，确定鹿茸寡肽分子量为400da。