本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法。
背景技术
维生素b12又名钴胺素，是一种重要的动物和人类营养因子，广泛应用于饲料、食品和医药卫生领域，其在很多方面都有显著作用，如促进红细胞的发育和成熟，预防恶性贫血；维护神经系统健康；以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；也可促进蛋白质的合成，对婴幼儿的生长发育有重要作用；还能消除烦躁不安、集中注意力、增强记忆及平衡感，而且维生素b12参与神经组织中一种脂蛋白的形成，是神经系统功能健全不可缺少的维生素。
采用化学合成生产维生素b12的方法成本高，副产物多，难以提纯。维生素b12的工业制造主要是通过微生物发酵法制得，应用于工业生产的菌株主要有厌氧费氏丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌及耗氧的脱单假单孢杆菌。通过厌氧发酵生产维生素b12的产率较低，实际生产主要进行好氧发酵。好氧发酵的菌株主要是脱单假单孢杆菌，培养基以甜菜糖蜜、麦芽糖、蔗糖为碳源，以玉米浆及酵母膏为氮源，添加无机盐及co，并添加5,6-二甲基苯并咪唑及甜菜碱作为前体。通过控制发酵工艺，生产维生素b12，如何提高维生素b12的产量及生产效率以满足市场需求是该领域的不断追求。
技术实现要素：
针对上述情况，本发明的目的是提供一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法，通过对发酵过程中的ph值进行调控，实现维生素b12产量的提高。
本发明提供一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法，包括以下步骤：
1）将维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌接种到发酵培养基中，在温度为25～30℃的条件下发酵，采用的发酵培养基的组成为：甘蔗糖蜜70～85g/l、酵母膏90～110g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.05～0.2g/l、磷酸氢二铵0.3～1g/l、硫酸锌0.01～0.1g/l、碳酸钙0.1～2g/l、甘油磷酸0.1～1g/l、氧化镁0.01～0.1g/l、氯化钴0.05～2g/l、尿素0.05～0.2g/l、甜菜碱10～30g/l、精氨酸0.05～0.2g/l和硫胺素0.01～0.5g/l，发酵培养基的ph为7-7.4；在发酵过程中，以甘蔗糖蜜和尿素控制发酵液的ph值为7，直至发酵结束；
2）从发酵液中分离纯化出维生素b12。
优选情况下，维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌通过以下方法制得：将脱氮假单胞杆菌菌悬液进行甲磺酸乙酯化学诱变筛选，将筛选出来的菌株再进行低能离子注入诱变筛选，得到维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌。
具体地，将脱氮假单胞杆菌菌悬液中加入0.05mol/l甲磺酸乙酯，混匀后置于恒温振荡箱中振荡50分钟，随后，立即加入0.1mol/l硫代硫酸钠溶液终止反应；然后用0.2mol/l、ph7.0～7.4磷酸盐缓冲液将诱变后的菌悬液稀释，再于平板培养基中培养，培养温度32℃，培养5～6天；经初筛、复筛，得到化学诱变后的菌株；从化学诱变得到的菌株斜面培养基上刮取菌落接至种子培养基中培养后，制得细胞悬液，取0.5ml菌悬液均匀涂布于无菌培养皿中，无菌风制成菌膜后在低能离子注入机上进行等离子体诱变；采用能量为10kev，剂量分别为(1～9)×1014ions/cm2，采用脉冲式注入，每个脉冲为5s，间隔为30～50s，离子注入诱变后的样品用无菌生理盐水洗涤后进行稀释，再于平板培养基中培养，培养温度32±1℃，培养6天，经初筛、复筛，得到起步效价、放瓶发酵单位和od值均较高的菌种。
优选地，发酵过程中的温度为28℃，发酵的0～65小时，控制溶氧量为25-40mmol·l-1·h-1，发酵的66～180小时，控制溶氧量为15-20mmol·l-1·h-1。
本发明中通过流加甘蔗糖蜜和尿素来实现发酵过程中ph值的控制，具体地，发酵过程中，ph值高于7时，滴加甘蔗糖蜜，ph值低于7时，滴加尿素，控制发酵液ph值为7。
根据本发明，发酵培养基的组成优选为：甘蔗糖蜜75～80g/l、酵母膏100～110g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.08～0.15g/l、磷酸氢二铵0.5～1g/l、硫酸锌0.05～0.1g/l、碳酸钙0.8～1.5g/l、甘油磷酸0.5～0.8g/l、氧化镁0.05～0.1g/l、氯化钴0.15～0.5g/l、尿素0.1～0.15g/l、甜菜碱15～25g/l、精氨酸0.05～0.1g/l和硫胺素0.1～0.2g/l，发酵培养基的ph为7-7.2。
进一步优选地，发酵培养基的组成为：甘蔗糖蜜80g/l、酵母膏100g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.1g/l、磷酸氢二铵0.8g/l、硫酸锌0.08g/l、碳酸钙1g/l、甘油磷酸0.6g/l、氧化镁0.08g/l、氯化钴0.2g/l、尿素0.1g/l、甜菜碱20g/l、精氨酸0.08g/l和硫胺素0.15g/l，发酵培养基的ph为7.2。
另外，本发明中未加以限定的其它发酵条件均可根据现有技术进行选择。
本发明中，从发酵液中分离纯化出维生素b12可采用现有技术中常规使用的分离纯化方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益点：
本发明通过流加碳源和尿素实现发酵过程中ph值的控制，另外限定了溶氧量等参数，同时选用了特定的发酵培养基，实现维生素b12产量的提高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1-3用于说明本发明的基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法。
实施例1
一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法，包括以下步骤：
1）将维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌接种到发酵培养基中，在温度为28℃的条件下发酵，发酵培养基的组成为：甘蔗糖蜜80g/l、酵母膏100g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.1g/l、磷酸氢二铵0.8g/l、硫酸锌0.08g/l、碳酸钙1g/l、甘油磷酸0.6g/l、氧化镁0.08g/l、氯化钴0.2g/l、尿素0.1g/l、甜菜碱20g/l、精氨酸0.08g/l和硫胺素0.15g/l，发酵培养基的ph为7.2；发酵的0~65小时，控制溶氧量为30mmol·l-1·h-1，发酵的66~180小时，控制溶氧量为20mmol·l-1·h-1；发酵过程中，ph值高于7时，滴加甘蔗糖蜜，ph值低于7时，滴加尿素，控制发酵液ph值为7；
2）从发酵液中分离纯化出维生素b12。
其中，维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌通过以下方法制得：将脱氮假单胞杆菌菌悬液中加入0.05mol/l甲磺酸乙酯，混匀后置于恒温振荡箱中振荡50分钟，随后，立即加入0.1mol/l硫代硫酸钠溶液终止反应；然后用0.2mol/l、ph7.0～7.4磷酸盐缓冲液将诱变后的菌悬液稀释，再于平板培养基中培养，培养温度32℃，培养5～6天；经初筛、复筛，得到化学诱变后的菌株；从化学诱变得到的菌株斜面培养基上刮取菌落接至种子培养基中培养后，制得细胞悬液，取0.5ml菌悬液均匀涂布于无菌培养皿中，无菌风制成菌膜后在低能离子注入机上进行等离子体诱变；采用能量为10kev，剂量分别为(1～9)×1014ions/cm2，采用脉冲式注入，每个脉冲为5s，间隔为30～50s，离子注入诱变后的样品用无菌生理盐水洗涤后进行稀释，再于平板培养基中培养，培养温度32±1℃，培养6天，经初筛、复筛，得到起步效价、放瓶发酵单位和od值均较高的菌种。
采用上述方法得到的维生素b12的发酵效价为248μg/ml。
实施例2
一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法，包括以下步骤：
1）将维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌接种到发酵培养基中，在温度为25℃的条件下发酵，发酵培养基的组成为：甘蔗糖蜜75g/l、酵母膏100g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.08g/l、磷酸氢二铵0.5g/l、硫酸锌0.05g/l、碳酸钙0.8g/l、甘油磷酸0.5g/l、氧化镁0.05g/l、氯化钴0.15g/l、尿素0.1g/l、甜菜碱15g/l、精氨酸0.05g/l和硫胺素0.1g/l，发酵培养基的ph为7；发酵的0~65小时，控制溶氧量为25mmol·l-1·h-1，发酵的66~180小时，控制溶氧量为15mmol·l-1·h-1；发酵过程中，ph值高于7时，滴加甘蔗糖蜜，ph值低于7时，滴加尿素，控制发酵液ph值为7；
2）从发酵液中分离纯化出维生素b12。
其中，维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌的制备方法同实施例1。
采用上述方法得到的维生素b12的发酵效价为243μg/ml。
实施例3
一种基于ph值控制的脱氮假单胞杆菌生产维生素b12的方法，包括以下步骤：
1）将维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌接种到发酵培养基中，在温度为30℃的条件下发酵，发酵培养基的组成为：甘蔗糖蜜80g/l、酵母膏110g/l、5,6-二甲基苯并咪唑0.15g/l、磷酸氢二铵1g/l、硫酸锌0.1g/l、碳酸钙1.5g/l、甘油磷酸0.8g/l、氧化镁0.1g/l、氯化钴0.3g/l、尿素0.15g/l、甜菜碱25g/l、精氨酸0.1g/l和硫胺素0.2g/l，发酵培养基的ph为7.2。发酵的0~65小时，控制溶氧量为35mmol·l-1·h-1，发酵的66~180小时，控制溶氧量为20mmol·l-1·h-1；发酵过程中，ph值高于7时，滴加甘蔗糖蜜，ph值低于7时，滴加尿素，控制发酵液ph值为7；
2）从发酵液中分离纯化出维生素b12。
其中，维生素b12的生产菌株脱氮假单胞杆菌的制备方法同实施例1。
采用上述方法得到的维生素b12的产量为240μg/ml。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，发酵过程中，不对发酵液的ph值进行控制，其余步骤相同。
采用上述方法得到的维生素b12的发酵效价为215μg/ml。
对比例2
与实施例1的不同之处在于，发酵培养基的组成中不含有精氨酸和硫胺素。
采用上述方法得到的维生素b12的发酵效价为225μg/ml。
对比可知，本发明通过对发酵过程中的ph值进行控制，同时采用特定的发酵培养基，可实现维生素b12产量的提高。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。