本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测家族性高胆固醇血症易感性相关的snp位点的引物及其检测方法。
背景技术：
家族性高胆固醇血症又称家族性高β脂蛋白血症，是儿童期最常见的遗传性高脂血症，也是脂质代谢疾病中最严重的一种，可导致各种危及生命的心血管疾病并发症的出现，是冠状动脉疾病的一种。该病的临床表现为低密度脂蛋白胆固醇水平增高、黄色瘤、角膜弓和早发性冠心病。随着生活水平的提高，越来越多的人对自身健康也十分注重。家族性高胆固醇血症其症状严重，因此对家族性高胆固醇血症患者早期基因检测和筛查十分必要,通过检测与家族性高胆固醇易感性相关的snp，就能够帮助高胆固醇易感人群了解其患上高胆固醇的风险，提前做好预防工作，避免家族性高胆固醇血症的发生。单核苷酸多态性(snp)目前已成为继限制性片段长度多态(rflp)标志和微卫星串联重复(str)标志后的第三代遗传标记。为了实现家族性高胆固醇血症的早发现、早预防和早控制，通过单核苷酸多态性(snp)检测高胆固醇易感性已成为国内外的研究热点，有全基因组关联研究表明，这4个snp(rs41291161，rs12720772，rs12084215，rs2922126，)位点与高胆固醇易感性密切相关，通过检测与高胆固醇易感性相关的snp位点的多态性，可以评估患家族性高胆固醇血症的易感风险，为高胆固醇的疾病预防提供指导。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测家族性高胆固醇血症snp位点的引物及其检测方法，其引物特异性好，检测方法准确性高，可用于家族性高胆固醇血症的风险评估，为高胆固醇的疾病预防提供指导。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测家族性高胆固醇血症易感性相关的snp位点的引物，引物包括rs41291161位点的引物、rs12720772位点的引物、rs12084215位点的引物和rs2922126位点的引物，其各引物具体序列如下：
rs41291161-f：5’-cttcacaaatacacacctg-3’；(seqidno.1)
rs41291161-r：5’-tgtcctatctgaaccttagc-3’；(seqidno.2)
rs12720772-f：5’-aagtacacacttggaaggaa-3’；(seqidno.3)
rs12720772-r：5’-gtccacacctatctctaactat-3’；(seqidno.4)
rs12084215-f：5’-gacacagattagttctggat-3’；(seqidno.5)
rs12084215-r：5’-aagatgatgtgaccactgt-3’；(seqidno.6)
rs2922126-f：5’-agtctcacgcagttatagg-3’；(seqidno.7)
rs2922126-r：5’-cttctacttctcaacagcaac-3’。(seqidno.8)
一种家族性高胆固醇血症易感性相关的snp位点多态性的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取患者基因组dna；
(2)以步骤(1)中所得dna为模板，采用权利要求1中所述引物进行pcr扩增；
(3)回收扩增产物，并进行浓度测定，计算模板量，再次进行pcr扩增并对扩增产物进行纯化，最后通过序列分析仪对snp分型进行分析确定。
进一步地，步骤(2)中pcr扩增体系为：dna模板100～150ng、浓度为5pmol/μl的正向引物3.0μl、浓度为5pmol/μl的反向引物3.0μl、primestarmax25.0μl，最后用ddh2o补足体积至50μl。
进一步地，步骤(2)中pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环，最后72℃延伸5min后于4℃保存。
进一步地，步骤(3)中pcr扩增体系为：dtcsmastermix2.5μl、浓度为5pmol/μl的反向引物1.0μl、dna模板20ng，最后用ddh2o补足体积至10μl。
进一步地，步骤(3)中pcr反应条件为：94℃预变性30s，94℃变性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30个循环，最后60℃延伸20min。
本发明的有益效果为：
本发明提供了分别检测家族性高胆固醇血症的相关基因的rs41291161，rs12720772，rs12084215，rs2922126位点单核苷酸多态性的引物及检测方法，其引物特异性好，检测方法准确性高，可用于家族性高胆固醇血症的风险评估，为高胆固醇的疾病预防提供指导。
附图说明
图1为pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2、图3、图4为rs41291161位点多态性检测的测序结果图；
图5、图6、图7为rs12720772位点多态性检测的测序结果图；
图8、图9、图10为rs12084215位点多态性检测的测序结果图；
图11、图12、图13为rs2922126位点多态性检测的测序结果图；
图14、图15、图16为rs41291161位点多态性检测结果的荧光验证图；
图17、图18、图19为rs12720772位点多态性检测结果的荧光验证图；
图20、图21、图22为rs12084215位点多态性检测结果的荧光验证图；
图23、图24、图25为rs2922126位点多态性检测结果的荧光验证图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
1、确定与家族性高胆固醇血症易感性相关的snp位点
本发明筛选出4个与高胆固醇易感性相关snp位点，具体为：rs41291161、rs12720772、rs12084215和rs2922126，其位于人类染色体2p24.1上apob基因的rs41291161易感性位点为a，rs12720772易感性位点为a，位于人类染色体的1p24.1上pcsk9基因的rs12084215易感性位点为a，位于人类染色体3q26.31上ghsr基因的rs2922126易感性位点为a。
2、设计引物
用以上snp位点的序列为模板，采用引物设计软件oligo7(molecularbiologyinsights，usa)，通过比较影响引物的几个重要因素，筛选出好的引物序列，其具体序列如下：
rs41291161-f：5’-cttcacaaatacacacctg-3’；(seqidno.1)
rs41291161-r：5’-tgtcctatctgaaccttagc-3’；(seqidno.2)
rs12720772-f：5’-aagtacacacttggaaggaa-3’；(seqidno.3)
rs12720772-r：5’-gtccacacctatctctaactat-3’；(seqidno.4)
rs12084215-f：5’-gacacagattagttctggat-3’；(seqidno.5)
rs12084215-r：5’-aagatgatgtgaccactgt-3’；(seqidno.6)
rs2922126-f：5’-agtctcacgcagttatagg-3’；(seqidno.7)
rs2922126-r：5’-cttctacttctcaacagcaac-3’。(seqidno.8)
通过成都秦科生物有限公司合成上述引物序，合成的引物干粉稀释至5pmol/μl备用，然后通过pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳验证(图1)，发现目的条带清晰，无杂带，且片段大小与设计的大小一致，表明设计的引物特异性好。
3、与高胆固醇易感性相关的snp位点多态性的检测
(1)dna的提取及纯度鉴定
以人抗凝全血为样本，使用全自动核酸提取仪，提取基因组dna，其具体过程如下：
将300μl全血和60μl(1mol/l)dtt加入至lab-aid804核酸提取mini试剂内后，开启全自动核酸提取仪，运行约45min，取出提取得到的dna，然后将提取的dna加入至微量离心管内，使用超微量核酸蛋白浓度分析仪进行dna纯度鉴定和浓度的测定。
(2)pcr扩增及回收
以提取得到的dna为模板，使用上述引物分别对其进行pcr扩增，其反应体系见表1，扩增程序见表2。
表1pcr反应体系
primermix：在将引物加入至体系前，需将引物干粉稀释至100μmol/ml，再以1:1:8的比例将上游引物、下游引物和灭菌超纯水混合成混合引物(primersmix)。
表2pcr扩增程序
电泳、胶回收：采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为电压120v，时间30min；电泳完成后在凝胶电泳图像分析仪下切取含有目的片段的凝胶，将凝胶块装入ep管中，胶回收的方法参照takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0试剂盒的说明书，最后对胶回收的产物进行浓度测定，4℃保存备用。
(3)标记及纯化
标记：取一只干净的0.2mlpcr管，依次加入：dtcsmastermix、测序引物、灭菌超纯水、模板dna，在标记反应体系中模板dna的用量(xμl)根据模板dna的核酸浓度确定，反应体系(10μl)与扩增程序分别见表3、表4。
表3标记反应体系
表4标记扩增程序
纯化：取一只干净的pcr管，将浓度为3mol/l，ph值为5.2的醋酸钠缓冲液、0.1mol/l，ph值为8.0的na2edta缓冲液和glycogen以体积比为2:2:1配制为终止液；
取上述终止液5μl加入到标记反应的ep管中，充分混匀，瞬时离心；将然后将液体转移至一只新的1.5mlep管中，并加入50μl预冷的无水乙醇，充分混匀，于-20℃冷冻10min；然后在12000rpm离心5min，弃上清；再向ep管加入150μll预冷的70％乙醇，放入高速离心机中，于12000rpm离心2min，弃上清；稍离心，用移液器吸干ep管内剩余的液体；打开ep管盖，37℃晾干至白色沉淀变透明；然后向ep管中加入25μlsls(sampleloadingsolution)溶解dna，静置8min；瞬时离心。
(4)测序
将上一步溶解后的dna液体全部加入一块干净的96孔样品板孔中，在加入的过程中不能产生气泡，再加入半滴矿物油；取一块新的96孔板，在对应孔中加入10滴分离缓冲液；向胶槽加入超纯水至液体接近指示线；将96孔样品板、96孔缓冲液板和胶槽装入测序仪，选择相应的程序进行测序。
(5)测序结果分析
通过序列分析软件(genomelabtmgexp(geneticanalysissystem))，将所测序列与标准序列进行比对，寻找snp位点，通过snp位点处碱基的类型，就可以得到snp位点的基因型，并保存分析图谱和原始检测结果。
其中，图2、图3、图4为rs41291161位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为aa、at、tt；其中，aa和at为rs41291161位点的易感基因型，tt为rs41291161位点的非易感基因型。
图5、图6、图7为rs12720772位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为gg、ag、aa；其中，aa和ag为rs12720772位点的易感基因型，gg为rs12720772位点的非易感基因型。
图8、图9、图10为rs12084215位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为cc、ac、aa；其中，aa和ac为rs12084215位点的易感基因型，cc为rs12084215位点的非易感基因型。
图11、图12、图13为rs2922126位点多态性检测的测序结果图，基因型依次为aa、at、tt；其中，aa和at为rs2922126位点的易感基因型，tt为rs2922126位点的非易感基因型。
上述测序结果图均无套峰、背景峰、杂峰、飘峰等现象，表明通过本发明检测snp位点多态性的方法，其特异性好、准确性高，因此，检测机构可以根据上述snp位点的多态性，评估受检者患高胆固醇的风险，为高胆固醇的疾病预防提供指导。
4、与高胆固醇易感性相关的snp位点多态性检测结果的验证
采用荧光定量pcr探针法对上述检测结果进行验证，其中，图14、图15、图16为rs41291161位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为aa、at、tt；其中，aa和at为rs41291161位点的易感基因型，tt为rs41291161位点的非易感基因型。
图17、图18、图19为rs12720772位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为gg、ag、aa；其中，aa和ag为rs12720772位点的易感基因型，gg为rs12720772位点的非易感基因型。
图20、图21、图22为rs12084215位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为cc、ac、aa；其中，aa和ac为rs12084215位点的易感基因型，cc为rs12084215位点的非易感基因型。
图23、图24、图25为rs2922126位点多态性检测结果的荧光验证图，基因型依次为aa、at、tt；其中，aa和at为rs2922126位点的易感基因型，tt为rs2922126位点的非易感基因型。
上述荧光探针法检测结果与测序法检测结果100％一致，进一步验证了采用测序法检测snp位点多态性的特异性和准确性。
序列表
<110>成都中创清科医学检验所有限公司
<120>一种用于检测家族性高胆固醇血症易感性相关的snp位点的引物及其检测方法
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cttcacaaatacacacctg19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tgtcctatctgaaccttagc20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aagtacacacttggaaggaa20
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gtccacacctatctctaactat22
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gacacagattagttctggat20
<210>6
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
aagatgatgtgaccactgt19
<210>7
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
agtctcacgcagttatagg19
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
cttctacttctcaacagcaac21