本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法。
背景技术：
真菌多糖是具有高度免疫活性的一类多糖，广泛的存在于真菌的子实体和菌丝体中，高纯度的真菌多糖既可以直接用于口服，也可以加工成注射制剂。真菌多糖可有效提高机体免疫力且毒副作用小。在真菌多糖的提取方面，目前国内外主要采用热水浸提法和溶剂提取法。热水浸提法是一种常规的提取方法，其优点是提取条件温和，操作简单、方便；但存在的缺点是多糖得率不高。本领域目前一般仍采用传统的热水浸提法。
溶剂提取法主要采用低浓度的草酸、草酸铵、盐酸、氢氧化钠等溶剂提取。有资料表明，酸、碱在多糖提取率方面均高于常规热水提取。然而，酸对多糖有水解作用，且操作比较繁杂，故多不采用酸提法。而盐对多糖的提取率提高不大。碱法的多糖得率比水提取及酸提取高，但要注意碱浓度不能太高，以免多糖变性；而且碱法提取条件剧烈，容易引起多糖变性，对多糖也有降解作用，且提取液粘稠，不易过滤。鉴于水浸提法存在多糖提取率低的技术缺陷，本领域迫切需要改进真菌多糖的提取技术，以进一步提高真菌多糖的提取率。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有的真菌多糖成本高且产率低的问题，提供一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法，所述方法步骤如下：
步骤一：采购菌株；
步骤二：配制斜面保藏培养基：取200g去皮土豆切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸20~30min，纱布过滤后得到滤液，向滤液中加入20g葡萄糖、1g蛋白胨、1gkh2po4、0.5gmgso4·7h2o、20g琼脂，加热溶解后补水至总体积为1l，ph自然，在115℃下灭菌20~30min；
步骤三：活化菌株：将步骤一的菌株接种于步骤二的斜面保藏培养基上，于22.5~25.5℃温度下培养4~8d，培养后得到菌丝体；
步骤四：液体种子培养基配制及培养：1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8~6.0，115℃灭菌25~30min；
在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗步骤三斜面保藏培养基上的菌丝体制成菌悬液，按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为170~200r/min，培养温度为23~26℃；
步骤五：植物浸提液制备：称取过20目筛的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1：10的质量比加水，搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
步骤六：液体发酵培养基的配制：称取麸皮100~200g，加500ml水，煮沸15~20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5~7g，葡萄糖10~15g，可溶性淀粉5~10g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100~500ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
步骤七：按步骤六液体发酵培养基体积的4~8%接入步骤四得到的种子液，接种后摇匀静置培养4~8h，在摇床上发酵4~6d，培养温度为23~25℃，搅拌转速为180~220r/min。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
（1）本发明通过在液体发酵培养基中加入绿色安全的植物浸提液，使真菌菌丝在培养基中能够保持良好细胞形态和生长状态，维持高密度的生长繁殖和分泌积累发酵产物，发酵液具有芳香味。本发明有效的缩短了发酵周期、提高了原料的利用率、具有工艺简单、操作方便、高产胞外多糖及容易实现产业化的特点。
（2）本发明通过大量实验，优化了真菌多糖液体发酵培养基和发酵条件，在原发酵培养基中添加10~50%植物干燥粉末的水浸提液，有效地促进发酵液中真菌菌丝增殖，生物量增加68.76%~116.87%，胞外多糖产量提高67.75%~99.81%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法，所述方法步骤如下：
步骤一：采购菌株，购于福建省古田县兴华真菌研究所；
步骤二：配制斜面保藏培养基：取200g去皮土豆切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸20~30min，纱布过滤后得到滤液，向滤液中加入20g葡萄糖、1g蛋白胨、1gkh2po4、0.5gmgso4·7h2o、20g琼脂，加热溶解后补水至总体积为1l，ph自然，在115℃下灭菌20~30min；
步骤三：活化菌株：将步骤一的菌株接种于步骤二的斜面保藏培养基上，于22.5~25.5℃温度下培养4~8d，培养后得到菌丝体；
步骤四：液体种子培养基配制及培养：1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8~6.0，115℃灭菌25~30min；
在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗步骤三斜面保藏培养基上的菌丝体制成菌悬液，按液体种子培养基体积的3~8%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为170~200r/min，培养温度为23~26℃；
步骤五：植物浸提液制备：称取过20目筛的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1：10的质量比加水，搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
步骤六：液体发酵培养基的配制：称取麸皮100~200g，加500ml水，煮沸15~20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5~7g，葡萄糖10~15g，可溶性淀粉5~10g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100~500ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
步骤七：按步骤六液体发酵培养基体积的4~8%接入步骤四得到的种子液，接种后摇匀静置培养4~8h，在摇床上发酵4~6d，培养温度为23~25℃，搅拌转速为180~220r/min。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法，步骤一中，所述的菌株为香菇881、杏鲍菇90、茶树菇2号、金针菇991或竹荪d02。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种真菌菌丝发酵高产真菌多糖的方法，步骤五中，所述的植物浸提液所用植物为樟科润楠属植物。
实施例1：
（1）活化茶树菇菌种：将茶树菇母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂2g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种，制成菌悬液，按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮100g，加500ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉15g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液茶树菇菌丝数为1.08×103个/ml，比对照提高84.72%，胞外多糖产量提高70.72%。
实施例2：
（1）活化金针菇菌种：将金针菇母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂2g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种，制成菌悬液，按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮100g，加500ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉15g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液金针菇菌丝数为1.35×103个/ml，比对照提高85.25%，胞外多糖产量提高75.25%。
实施例3：
（1）活化香菇菌种：将香菇母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂2g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种，制成菌悬液，按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮100g，加500ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉15g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液香菇菌丝数为1.44×103个/ml，比对照提高91.14%，胞外多糖产量提高81.14%。
实施例4：
（1）活化杏鲍菇菌种：将杏鲍菇母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂2g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种，制成菌悬液，按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮100g，加500ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉15g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液杏鲍菇菌丝数为1.31×103个/ml，比对照提高80.06%，胞外多糖产量提高70.06%。
实施例5：
（1）活化竹荪菌种：将竹荪母种接种于由以下组成的斜面保藏培养基上。去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂2g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗下在斜面保藏培养基上活化生长的菌种，制成菌悬液，按液体种子培养基体积的6%接种量接入菌悬液，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮100g，加500ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5g，葡萄糖5g，可溶性淀粉15g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液100ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按液体发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液竹荪菌丝数为1.42×103个/ml，比对照提高91.32%，胞外多糖产量提高71.32%。
实施例6：
（1）斜面保藏培养基配制和菌种活化：去皮土豆200g切成小块，加蒸馏水800ml，煮沸30min，纱布过滤后得到滤液，加入葡萄糖20g，蛋白胨1g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂20g，加热溶解后补水至1l，ph自然，在115℃下灭菌25min。将茶树菇母种接种后，于24℃温度下培养5d。
（2）液体种子的培养：在1l水中加入20g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母膏，3gk2hpo4，1.5gmgso4·7h2o，用1mol/l的hcl或naoh调节ph值为5.8，115℃灭菌30min。在无菌操作条件下，用10ml无菌生理盐水荡洗活化的菌种，制成菌悬液，按6%接种量接入液体种子培养基中，摇床培养2~4d，转速为180r/min，培养温度为23~26℃；
（3）植物浸提液制备：称取20目筛筛下物的植物干燥粉末，按照植物干燥粉末：水=1:10的质量比加水，间歇搅拌均匀，浸提24h，过滤的滤液即为植物浸提液；
（4）配制液体发酵培养基：称取麸皮150g，加600ml水，煮沸20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨6g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，kh2po44g，mgso4·7h2o2g，植物浸提液150ml，以水补足1l，溶解后调节ph为5.5~6.0，在115℃下灭菌30min；
（5）按发酵培养基体积的5%接入液体种子液，接种后摇匀静置培养6h，在摇床上发酵5d，培养温度为25℃，转速为200r/min。
（6）在液体发酵培养基中以等量水替代植物浸提液，其余所有操作相同进行发酵培养，作为对照。当发酵结束时，采用血球计数板直接计数方法测定发酵液中菌丝数量。取与对照同体积的发酵液，分别加入2%的nacl，溶解后5000rpm离心15min；上清液加三倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃静置16h后，5000rpm离心20min，收集沉淀物，用蒸馏水溶解并定容，进行多糖测定，测定方法为苯酚－硫酸法，发酵液茶树菇菌丝数为1.38×103个/ml，比对照提高98.14%，胞外多糖产量提高88.64%。