抗真菌的方法

专利名称：抗真菌的方法
抗真菌的方法与相关申请的交叉参照本申请要求来自于2008年2月1日提交的美国临时申请序列号61/025，655和于 2008年8月1日提交的美国临时申请序列号61/085，682的优先权。2个申请都引入本文
作为参考。联邦基金的致谢不可用。领域本发明涉及用于保护植物不受经由致病体特别是真菌的感染或侵袭，以及不受与 其相关的疾病病状的策略。背景本文引用参考文献以指示本技术领域的现状，并且不视为与本发明的专利性的特 别关联性的承认。由作者提及的出版物的书目细节在说明书末尾提供。由于通过真菌性病原体感染的农作物损失是农业生产中的主要问题，并且每年在 杀真菌剂应用上花费数百万美元以制止这些损失(0erke，2003)。自然界是抗微生物肽的丰 富来源，其中许多显示出抗真菌活性。抗微生物肽已进化为保护生物体不受病原体。它们的特异性看起来在很大程度上 依赖于它们源于其的生物体，可能是由于由各种病原体对这些生物体给予的进化压力。像 这样，与真菌性病原体相比较，从哺乳动物物种中分离出的肽一般显示出针对细菌性病原 体的更高程度的活性，推测是由于由细菌感染的更高风险。相比之下，由于由植物面对的真 菌感染的更高风险，植物抗微生物肽一般显示出更高的抗真菌活性。植物防御素代表一类抗微生物肽(由Lay和Anderson (2005)综述)。存在具有 不同空间和时间表达模式以及活性谱的广泛多样的防御素。这些包括来自萝卜的RsAFPl 和RsAFP2、来自七叶树(Aesculushippocatanum)的Ah_AMP4、和来自苜蓿的AlfAFP、来自豌 豆的 pI39 和 pI230、和来自大丽花的 DmAMPl、以及 ZmESR6、PhD2、PhDl、BSDl、RsAFP4、WTl、 RsFP3、AhAMP 1、CtAMP 1、HsAFP 1、HvAMP 1、PsD 1、AX2、AX1、SoD2、VaD 1、gD 1、NaD2、J1 -2、SD2 和EGADl，且优选花的防御素，例如来自花烟草(Nicotiana alata)的NaDl和NaD4、以及来 自 Lycopersicumcerasiforme 的 Tomdef2 和 Tomdef3。这些肽的特异性的潜在机制仍是未知的，尽管推测涉及与细胞表面的相互作用。 因为膜透化是许多抗微生物肽的共同活性，并且各种细胞类型的膜组成也是高度可变的， 所以特异性脂质的存在假定在某些情况下负责肽敏感性。特别地，细菌细胞的质膜在外层 中包含带负电荷的磷脂，而哺乳动物细胞则不是(MatSUZaki，1999)。这些带负电荷的脂质 可以与带正电荷的抗微生物肽相互作用。为支持这个假设，体外研究已证实带负电荷的脂 质的存在对于许多抗微生物肽的膜透化活性是重要的(Matsuzaki等人，1995 ；Matsuzaki, 1999 ；Ladokhin 和 White，2001 ；Epand 等人，2006)。膜透化已暗示为关于某些植物防御素的机制，尽管透化的机制仍未得到研究。在植物防御素RsAFP2和DmAMPl的情况下，提出透化涉及在细胞表面上的特定受体。特定鞘 脂在质膜中的存在也是这些防御素的活性所需的，可能作为结合位点(Thevissen等人， 2000a, b ；Thevissen 等人，2004 ；Thevissen 等人，2005，Ramamoorthy 等人，2007)。化学杀真菌剂相当常用于在农业和园艺背景中。甲氧基丙烯酸酯类 (Strobilurins)和三唑类对于在这些工业中的使用是特别重要的。甲氧基丙烯酸酯类包括甲氧基丙烯酸酯A到H、腈嘧菌酯、苯氧菊酯、啶氧菌酯、 氟嘧菌酯、肟醚菌胺(oryzastrobin)、醚菌胺、唑菌胺酯、苯氧菌胺和肟菌酯。关于杀真菌 甲氧基丙烯酸酯类的综述，参见Bartlett等人(2002)。作为类别，甲氧基丙烯酸酯类是 Q0I (Quinoneoutside inhibitors)交叉抗性组的部分，并且它们通过结合细胞色素b且抑 制电子转运和ATP合成来抑制敏感生物体。三唑杀真菌剂被表征为脱甲基酶抑制剂，并且它们干扰敏感真菌中的固醇合成。 三酯杀真菌剂在例如美国专利号4，767，777中描述。本领域需要改善的农业生产经济和农作物产量的改善。真菌病是产量损失的重要 来源，并且用于真菌控制的目前策略是昂贵的且对环境是潜在性损害的。需要用于保护农 业和观赏植物不受疾病特别是真菌病的新系统。本文公开的是用于减少经济损失的系统， 所述经济损失起因于由致病体例如真菌因子引起的对农作物和观赏植物的损害。除明显减 少植物损害外，通过化学农药的减少使用还可以降低生产成本。概述本发明尤其提供了用于保护植物不受真菌侵袭或感染和/或用于减少与病原体 相关的疾病发生率或严重度的系统。在一个实施方案中，病原体是真菌因子，并且疾病是 真菌病。该系统最低限度包括2种组分——不由植物天然表达的植物防御素，和化学试剂 特别是化学杀真菌剂。该系统令人惊讶的性质是如本文所描述的在抗真菌防御素和化学 杀真菌剂的组合中可观察到的协同作用性质。作为本文公开的许多中的一个例子，通过至 少一种植物防御素例如NaDl或其抗真菌变体和各种化学杀真菌剂中的至少一种的组合， 所述各种化学杀真菌剂包括但不限于甲氧基丙烯酸酯和三唑，存在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) (Fov)的协同抑制。与通过单独使用的 任一组分相比较，通过使用组合可以更有效地控制对通过系统的组分各自的抑制个别敏感 的任何真菌，尽管在组合方法中使用更低浓度的化学杀真菌剂。如果可以显示每种组分个别地发挥针对真菌的抑制活性，或组合中的组分发挥协 同的组合抑制效应，那么真菌对经由系统的个别组分各自“的抑制是敏感的”。在本文描述的特定研究中，测量该系统的组分对真菌细胞的透性的作用。采用可 以鉴定其定位的物质，无论在真菌细胞内部还是外部。物质在本文中有时称为“透性指示剂 化合物”。透性指示剂化合物是其在细胞内部或外部的存在，可以依靠具有可检测性质进行 可检测测量的化合物，所述可检测性质例如荧光、放射性标记、免疫学特征等。此外，透性指 示剂化合物是在正常条件下保留在细胞外，并且除非细胞透性已从细胞的正常生理条件改 变，否则无法在细胞内检测出的化合物。原则上，透性的指示剂可以是通常保留在细胞内， 仅在异常条件下泄漏的那种，但前面一种类型的指示剂是更常见的。透性指示剂化合物的 例子包括与核酸结合的荧光染料，例如SYT0X Green或碘化丙啶。其他例子包括其位点 通过用显微镜检查可见的FITC标记的右旋糖酐或免疫金标记的抗体。加上荧光标签的防御素其自身可以用作透性指示剂化合物。术语“可检测的量”意欲传达透性指示剂化合物的 量中的差异可以半定量地进行评估，对于比较目的足够。为了比较植物防御素对真菌细胞 透性的可能作用的目的，植物防御素NaDl用作用于比较的基础。如本文所描述的，给定防 御素对真菌细胞的透性的作用可以定量为通过使用透性指示剂化合物的“相对透性指数”。本发明的实施方案包括其中防御素是具有针对至少一种植物致病性真菌的杀真 菌和/或抑制真菌活性的任何防御素的那些。此类抗真菌防御素的例子包括但不限于来自 萝卜的RsAFPl和RsAFP2、来自七叶树(原文为Aesculus hippocatanum)的Ah_AMP4、和来 自苜蓿的AlfAFP、来自豌豆的ρ139和ρ1230、和来自大丽花的DmAMP 1、以及ZmESR6、PhD2、 PhDl、BSDl、RsAFP4、WTl、RsFP3、AhAMPl、CtAMPl、HsAFPl、HvAMPl、PsDl、AX2、AXl、SoD2、 VaDl、gDl、NaD2、Jl-2、SD2和EGADl，且优选花的防御素，例如来自花烟草的NaDl和NaD4、 以及来自Lycopersicumcerasiforme的Tomdef2和Tomdef3。保留抗真菌活性的嵌合防御 素分子和/或防御素变体也可以在呈现的系统中用于植物保护。在本发明的实施方案中有用的化合物包括但不限于来自下述类别的完全或局部 系统性(局部渗透剂)抗真菌化合物甲氧基丙烯酸酯类、三唑类、嘧啶胺类、缬氨酰胺氨基 甲酸酯类、苯咪唑类、托布津类(thiophanates)、酰基丙氨酸类、氨基甲酸酯类、乙基膦酸酯 类、二甲酰亚胺类和甲酰胺类。有用的甲氧基丙烯酸酯类的例子包括但不限于，腈嘧菌酯、 苯氧菊酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、肟醚菌胺(原文为oryzastrobin)、醚菌胺、唑菌胺酯、苯氧 菌胺、肟菌酯、烯肟菌酯。有用的三唑类的例子包括但不限于，阿扎康唑、联苯三唑醇(原 文为biteranol)、糠菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、烯唑醇、氧环唑、腈苯唑、氟喹唑、氟硅唑、 粉唑醇、己唑醇、亚胺唑、种菌唑、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑 醇、四氟醚唑、三唑酮、三唑醇、灭菌唑。有用的嘧啶胺类的例子包括但不限于，嘧霉胺、嘧 菌环胺、嘧菌胺。有用的缬氨酰胺氨基甲酸酯类的例子包括但不限于，丙森锌、苯噻菌胺和 valiphenalo有用的苯咪唑类的例子包括但不限于，苯菌灵、多菌灵、麦穗宁、噻苯哒唑。有用的 托布津类的例子包括但不限于，硫芬酯、甲基托布津。有用的酰基丙氨酸类的例子包括但不 限于，甲霜灵-M、苯霜灵、甲霜灵、呋霜灵。有用的氨基甲酸酯类的例子包括但不限于，霜霉 威、iodocarb、硫菌威。有用的乙基膦酸酯类的例子包括但不限于，三乙膦酸铝。有用的二甲 酰亚胺类的例子包括但不限于，乙菌利、异菌脲、腐霉利、伐菌唑灵(原文为viclozolin)。 有用的甲酰胺类的例子包括但不限于，麦锈灵、灭锈胺、氟酰胺、甲呋酰胺、噻氟酰胺、啶酰 菌胺、氧化萎锈灵、萎锈灵、吡噻菌胺(原文为penthioopyrad)和福拉比。可以通过本发明的系统保护不受真菌感染的植物包括对真菌敏感的那些，所述 真菌对化学杀真菌剂和植物防御素敏感，所述化学杀真菌剂特别是甲氧基丙烯酸酯或三 唑，所述植物防御素可以作为转基因在那种植物中表达的或包括防御素的组合物可以应用 于其。优选地，植物可以是单子叶植物，特别是来自禾本科(P0aceae)的植物，以及谷类， 例如玉蜀黍、大麦、小麦、稻等，或双子叶植物，特别是来自茄科(Solanaceae)、十字花科 (Brassicaceae)、锦葵科(Malvaceae)禾口豆科(Fabaceae)的植物。来自许多真菌性病原体特别是其为丝状真菌的那些的感染和损害，使用呈 现的系统可以在许多植物物种中得到控制。可控制的真菌和卵菌纲病原体的例子包 括但不限于，镰刀菌属(Fusarium)、轮枝孢属(Verticillium)、腐霉菌属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、核盘菌属(Sclerotinia)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、 疫霉属(Phytophthora)、毛盘孢属(Colletotrichum)、色 二孢属(Diplodia)、尾 抱属(Cercospora)、曲霉菌属(Aspergillus)、壳球抱属(Macrophomina)、瓶霉菌 属(Phialophora)、间座菌属(Diaporthe)、根串珠霉属(Thielaviopsis)、链格孢属 (Alternaria)、茎点霉属(Phoma)、Phymatotrichopsis,以及锈菌和黑粉菌，例如柄锈菌属 (Puccinia)、层锈菌属(Phakopsora)和黑粉菌属(Ustilago)。重要的应用包括但不限于， 所用化学杀真菌剂化合物和抗真菌防御素的协同作用组合，例如以保护卡诺拉油菜不受黑 腿病，玉米或小麦(或其他谷类)不受禾谷镰刀菌，以及棉花不受尖孢镰刀菌。本发明进一 步提供了第一组分和第二组分对植物的用途，所述第一和第二组分各自是给定敏感真菌的 抑制剂，第一组分是不由所述第一次所提及植物天然表达的植物防御素，第二组分是抑制 真菌的化学杀真菌剂，当相组合与所述植物上的真菌相接触时。附图简述图IA到E是显示防御素NaDl和杀真菌剂的组合在体外对禾谷镰刀菌生长的作用 的图解表示法。通过在生长培养基接种后44、45或68小时时达到的在595nm(A595)处的 光密度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对横轴上的杀真菌剂浓度(mg/L)进行标绘。 实线与在O μ M NaDl的存在下获得的样品结果有关；虚线、点线和点-虚线代表如图上指示 的各种NaDl浓度。误差条指示95%置信区间。

图1Α. NaDl和丙环唑的组合。在44小时时 的生长。图IB. NaDl和戊唑醇的组合。在44小时时的生长。图1C. NaDl和氟硅唑的组合。 在44小时时的生长。图ID. NaDl和腈嘧菌酯的组合。在45小时时的生长。图IE. NaDl和 啶氧菌酯的组合。在45小时时的生长。图IF提供了在图IA-E中举例说明的真菌生物测 定法中来自附加应答(Ee)与观察到的应答(Io)的预期效应的比较。图1G. NaDl和丙环唑 的组合。在45小时时的生长。图1Η. NaDl和丙环唑的组合。在68小时时的生长。图2Α到F和图2Η到I显示防御素NaDl和杀真菌剂的组合在体外对尖孢镰刀菌萎 蔫专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum) (Fov)生长的作用。通过在生长培养 基接种后45、45. 5、47或48小时时达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生 长(纵轴)，并且针对横轴上的杀真菌剂浓度(mg/L)进行标绘。实线与在O μ M NaDl的存 在下获得的样品结果有关；虚线、点线和点-虚线代表如图上指示的各种NaDl浓度。误差 条指示95%置信区间。图2Α. NaDl和腈嘧菌酯的组合。在47小时后的生长。腈嘧菌酯浓 度O-lmg/L。图2B. NaDl和腈嘧菌酯的组合。在47小时后的生长。腈嘧菌酯浓度0_4mg/L。 图2C. NaDl和啶氧菌酯的组合。在48小时后的生长。啶氧菌酯浓度O-lmg/L。图2D. NaDl 和氟嘧菌酯的组合。在45. 5小时后的生长。氟嘧菌酯浓度O-lmg/L。图2E. NaDl和丙环 唑的组合。在45小时后的生长。丙环唑浓度0-4mg/L。图2F. NaDl和丙环唑的组合。在 47小时后的生长。丙环唑浓度O-lmg/L。图2G.在图2A-F中举例说明的真菌生物测定法 中来自附加应答(Ee)与观察到的应答(Io)的预期效应的比较。图2H. NaDl和啶氧菌酯的 组合。在47小时后的生长。啶氧菌酯浓度0-0. 125mg/L。图21. NaDl和啶氧菌酯的组合。 在47小时后的生长。啶氧菌酯浓度O-lmg/L。图3A和B是显示在经由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)感染后，氟嘧菌酯和NaDl的 组合在转基因棉花植物中的效应的制表表示法。图3A，温室生物测定法和图3B，生长箱生 物测定法，评估氟嘧菌酯和NaDl防御素的组合对于棉花由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)的感染。非转基因柯克棉315和表达NaDl的转基因柯克棉315 (品系35. 125. 1，美国专利申 请12/105，956)的种子连同和不连同氟嘧菌酯种子包衣。结果代表对于温室测试在8周后 和对于生长箱测试在5周后的死亡百分率和平均疾病得分。48粒和30粒种子分别用于温 室和生长箱测试。图3C-3F举例说明在田间试验生物测定法中获得的结果，以评估在经由 尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)感染后，在棉花(转基因品系35. 125. 1)中表达防御素NaDl 的转基因和用各种化学杀真菌剂种子包衣的组合的效应。结果代表发芽后14-57天的死亡 百分率。对于每种处理获得约1100-1400粒发芽种子并且进行监控。误差条指示95%置信 区间。非转基因柯克棉315和表达NaDl的转基因柯克棉(品系35. 125. 1)的种子连同和 不连同分别地图 3C Jockey 、图 3DDynasty 、图 3ERedigo 禾口图 3F HEC5725 的种 子包衣。图3G.在图3C-F中举例说明的田间生物测定法中来自附加应答(Ee)与观察到的 存活改善(Io)的预期存活改善的比较。图4A到C是显示防御素NaDl和杀真菌剂的组合在体外对大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae)生长的作用的图解表示法。通过在生长培养基接种后118小时时 达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对横轴上的杀真 菌剂浓度(mg/L)进行标绘。实线与在ΟμΜ NaDl的存在下获得的样品结果有关；虚线、点 线和点_虚线代表如图上指示的各种NaDl浓度。误差条指示95%置信区间。图4Α. NaDl 和丙环唑的组合。图4Β. NaDl和戊唑醇的组合。图4C. NaDl和氟硅唑的组合。图4D.在图 4A-C中举例说明的真菌生物测定法中来自附加应答(Ee)与观察到的应答(Io)的预期效应 的比较。图5提供了显示种子包衣Dynasty (注册商标)(Syngenta)和NaDl在转基因 棉花植物中在田间对经由大丽轮枝菌感染的作用的制表表示法。图5A.评估非转基因柯克 棉315和表达NaDl的转基因柯克棉315 (品系35. 125. 1，美国专利申请12/105,956)的种 子连同和不连同Dynasty (注册商标)种子包衣和工业标准Sicala V2与Dynasty (注册商标)种子包衣的田间试验的结果。结果代表在4周后的发芽百分率，在18周后发 芽植物的存活百分率和在试验结束时(30周)未受感染的植物的百分率。轮枝孢属等级在 收获进行测定。对于每种处理使用500粒种子。图5B.来自图5A中所述植物的棉铃和棉 绒的得率。图6A和B是显示防御素NaDl和杀真菌剂的组合在体外对十字花科小球腔菌 (Leptosphaeria maculans)生长的作用的图解表示法。通过在生长培养基接种后96小时 时达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对横轴上的 杀真菌剂浓度(mg/L)进行标绘。在加入NaDl和杀真菌剂的组合前，使十字花科小球腔菌 孢子在液体V8培养基中预出芽48小时。实线与在ΟμΜ NaDl的存在下获得的样品结果有 关；虚线、点线和点-虚线代表如图上指示的各种NaDl浓度。误差条指示95%置信区间。 图6Α. NaDl和丙硫菌唑的组合。图6Β. NaDl和氟喹唑的组合。图6C.在图6Α-Β中举例说明 的真菌生物测定法中来自附加应答(Ee)与观察到的应答(Io)的预期效应的比较。某些值 是负的(即，比对照更多的生长)，因为“OuM NaDl,0. 25mg/L丙硫菌唑”具有比“OuM NaDl, Omg/L丙硫菌唑”更多的生长，与“0. 5uMNaDl,0mg/L丙硫菌唑” 一样。图7A是在用pHEX3转化的品系CAT13. 26的T3代的叶中，如通过ELISA测定的 NaDl水平的图解表示法。来自花烟草的经纯化的NaDl用作标准。
图7B和7C是显示用十字花科小球腔菌感染的转基因卡诺拉油菜的温室生物测定 法的结果的条线图。非转基因RI64和表达NaDl的转基因RI64(CAT13. 26)的30粒种子在 温室中生长10天。随后用十字花科小球腔菌的孢子接种子叶，并且在第10天(图7B)和 第17天(图7C)时测量损伤面积。图8A是来自番茄花的蛋白质的RP-HPLC洗脱图。收集已与SP-S印harose结 合的蛋白质，并且在分析型Zorbax 300SB-C8 RP-HPLC柱上进行分离，使用Agilent Technologies 1200系列系统和40分钟线性梯度(0-100%缓冲液B)。经洗脱的蛋白质通 过在215nm处的吸光度进行检测。图8B是来自花烟草花的蛋白质的RP-HPLC洗脱图。已与SP-S印harose结合的 蛋白质在制备型Vydac C8 RP-HPLC柱上进行进一步分馏，使用Beckman Coulter System Gold和40分钟线性梯度(0-100%缓冲液B)。图8C是列出植物来源和种子质量以及所测试的花防御素的表。图8D是由各种NaDl浓度诱导的摄取到禾谷镰刀菌菌丝内的SYTOXGreen的图解 表示法。图8E是由各种NaDl浓度诱导的来自禾谷镰刀菌菌丝的ATP释放的图解表示法。图8F是防御素各自对禾谷镰刀菌菌丝的相对膜透化活性以及相对抗真菌活性的 图解表示法。根据在各种防御素添加后诱导的相对ATP释放来估计相对透化(柱形图，左 轴)。通过在生长培养基接种后24小时时达到的在595nm (Abs 595)处的光密度中的增加 测量真菌生长(线轴，右轴)。关于防御素的鉴定参见图8C。图8G-8L是显示与杀真菌剂组合的各种防御素在体外对禾谷镰刀菌生长的作用 的图解表示法。通过在生长培养基接种后24小时时达到的在595nm(Abs 595nm)处的光密 度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对横轴上的杀真菌剂浓度(mg/L)进行标绘。实 线与在不存在NaDl的情况下获得的样品结果有关；虚线、点线和点-虚线代表如图上指示 的各种NaDl浓度。误差条指示平均值的标准误差。图8M是在图8G-8L中举例说明的真菌生物测定法中来自附加应答(Ee)与观察到 的应答(Io)的预期效应的比较。图8N是显示在8C中列出的防御素的相对透性指数以及其对禾谷镰刀菌的相对抗 真菌活性和与杀真菌剂戊唑醇的相对协同作用。透性指数(PI)定义为与得到PI 1的用 1 μ M NaDl获得的发光相比较，用1 μ M防御素在10分钟内获得的发光的相对量。图9显示所提出的植物防御素分类法。使用MEGA 4. 0构建植物防御素成熟结构 域的邻近连接系统树。指出了超过50%的自举复制。基于分支长度将防御素分成组和亚组 (在右侧上指出)。分支标度=置换/残基。NaDl由箭头指出。图10显示指出已知功能的个别肽的植物防御素系统树。这是图9中构建的系统 树的圆形视图。代表不同组的分支在外圆上指出。已知功能的个别肽由个别形状指出(参 见图例)。详述各种术语根据其一般公认的含义使用。为了清楚起见，下文进一步解释了下述术语。“敏感真菌”是可以通过本发明的每种组分分开或通过2种组分的组合抑制的真菌菌株。在某些情况下，考虑到所采用的测定法系统，通过单独的组分之一的抑制可能是 无法检测的，但当与其他组分相组合时将发现明显地促成毒性。参见例如，图1G，当在不 存在杀真菌剂的情况下0. 24 μ M NaDl对于禾谷镰刀菌的毒性极低时，但当与lmg/L丙环 唑相组合时，这得到显著增强。上述例子还证实当防御素和杀真菌剂组合应用时可观察 的协同作用。可以被例如NaDl抑制的任何真菌菌株都可以是敏感真菌，如果该真菌还可 以被甲氧基丙烯酸酯、三唑或其他杀真菌剂抑制。NaDl已显示抑制一批代表性丝状真菌 的生长，包括但不限于尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌石竹专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)、尖键抱菌番爺专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、爺腐键刀菌(Fusariumsolani)、Fusarium pseudograminearum、异方宠抱腔 菌(Cochliobolusheterostrophus)、芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicola)禾口禾顶 囊壳小麦变禾中(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、烟草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和十字花科小球腔菌。相关防御素已显 示在抑制禾谷镰刀菌方面是活跃的，包括优选地花的防御素，例如但不限于NaD4、Tomdef2 和Tomdef3。因此，植物防御素和化学杀真菌剂的大量协同作用组合，可用于针对许多真菌 病特别是由丝状真菌引起的那些的植物保护。在某些情况下，在所采用的测试条件下，给定杀真菌剂或防御素的抑制效应可以 低于关于给定测定法的检测极限。Greco等人，1995已限定了协同作用的不同范畴，根据 在不存在另一种组分的情况下进行测定时，2种组分之一、两者还是无一具有可测量的活 性。本文采用的定义包括所有此类情况，前提是2种组分一起作用的组合效应能够大于个 别组分单独作用的总和。应当理解可以产生超过仅在特定条件下的附加活性的2种或更多 种组分的协同作用组合，例如当组分中的一种或多种以低于对于个别功效最大的浓度存在 时。组分的组合被视为协同作用的，如该术语在本文中预期的，如果存在一组条件包括但不 限于浓度，当组分一起作用的组合效应大于个别组分单独作用的总和时。在一个实施方案 中，存在用于保护农作物植物不受真菌病的系统，包括第一组分和第二组分，所述第一和第 二组分各自是给定敏感真菌的抑制剂，组合是协同作用的。Richer(1987)已描述了用于证 实且估计协同作用的定量方法。其中描述的是用于比较在2种抑制组分X和Y的组合存在 下所观察到的抑制水平(Io)的Limpel公式，其中预期的附加效应(Ee)起因于X或Y以与 用于测量其组合效应相同的分别浓度各自分开作用。附加抑制百分比Ee作为X+Y-XY/100 进行计算，其中X和Y表示为抑制百分比。当Io > Ee时，存在协同作用。Ee和Io的值 已根据本文公开的数据进行计算，基于上述表达。备选方法可以在特定情况下使用，如由 Richer (1987)描述的。Limpel的公式也已由Harman等人，美国专利6，512，166采用，以证 实协同作用。真菌抑制包括杀真菌和抑制真菌活性，如通过与对照相比较，真菌生长(或活力 丧失)的减少测量的。真菌生长可以通过本领域已知的许多不同方法进行测量。测量丝状 真菌生长的常用方法需要在合适的生长培养基使孢子发芽，温育足以达到可测量生长的时 间，并且在指定温育时间后测量在培养物中增加的光密度。光密度随着增加的生长而增加。 一般地，真菌生长是发病机理所需的。因此，真菌生长的抑制提供关于保护不受真菌病的合 适指示剂，即抑制越大，保护就越有效。
在本文背景中，“预防感染”意指当与未用化学杀真菌剂处理也不表达防御素转基 因或用防御素处理的植物相比较时，用本发明的系统处理的植物避免病原体感染或疾病症 状或两者，或显示出减少或降到最低或更不频繁的病原体感染或疾病症状或两者，这是植 物_病原体相互作用的天然结果。即，致病性真菌被预防或减少不引起疾病和/或相关疾 病症状。与未用本文教导的系统如此处理的植物相比较，感染和/或症状减少至少约10%、 20%、30%、40%、50、60%、70%或80%或更多。在备选方案中，本发明的系统导致对化学杀 真菌剂和防御素敏感的植物致病性真菌的孢子形成减少，因此减少真菌繁殖和疾病传播。植物保护(疾病抗性或减少)可以通过本领域已知的方法进行估计。参见，Potter 等人，(1993) ；Gorlach等人，(1996) ；Alexander等人，(1993)。技术人员应认识到用于测 定经由植物病原体的植物感染和疾病的方法依赖于待测试的病原体和植物。术语“植物防御素”已是文献中定义明确的(参见例如Lay和Anderson (2005))。植 物防御素是小的富含半胱氨酸的蛋白质，一般具有45-54个氨基酸。半胱氨酸残基形成特 征性的、确定的二硫键模式。NaDl是从花烟草的花组织中分离出的植物防御素。NaDl的氨 基酸和编码序列公开于美国专利7，041，877中，所述专利通过引用合并入本文。其他抗真 菌防御素是本领域众所周知的，包括但不限于萝卜的RsAFPl和RsAFP2、来自七叶树(原文 为 Aesculus hippocatanum)的 Ah_AMP4、和来自苜蓿的 AlfAFP、来自豌豆的 pI39 和 pI230、 和来自大丽花的 DmAMP 1、以及 ZmESR6、PhD2、PhD 1、BSDl、RsAFP4、WTl、RsFP3、AhAMP 1、 CtAMP 1、HsAFP 1、HvAMP 1、PsDl、AX2、AX1、SoD2、VaD 1、gDl、NaD2、J1-2、SD2 和 EGAD 1，且优 选花的防御素，例如来自花烟草的NaDl和NaD4、以及来自Lycopersicum cerasiforme的 Tomdef2和Tomdef3。植物防御素的结构域功能在美国专利申请号12/105，956中讨论，所 述专利于2008年4月18日提交，并且通过引用合并入本文。NaDl或具有C末端尾部的另 一种防御素的C末端尾部可以经由重组DNA技术掺入其他防御素的结构内，以便减少对表 达转基因的植物的(潜在)毒性。此外，另一种防御素或来自另一种植物蛋白质的液泡靶 向序列的C末端尾部可以取代NaDl的那种。术语“化学杀真菌剂”在本文中用于包括用作杀真菌剂的无机和有机化学化合物， 以保护植物不受真菌病。许多有用的杀真菌剂在上文段落
和W20]中阐述。当2种或更多种组分产生大于每种组分单独作用的个别结果的总和的组合结果 时，协同效应发生。如本文所描述的，在其他方面等同的条件下，在至少一种植物防御素和 至少一种化学杀真菌剂的组合存在下测量的协同真菌生长抑制大于在每种组分(防御素 和杀真菌剂)单独地存在下测量的抑制总和。应当理解无需用2种组分的每一种浓度组 合观察到超过附加效应，以便视为协同作用的。可以在特定浓度组合而不在其他中观察到 2种组分的协同效应。例如，如果进入细胞内的入口限制杀真菌剂活性，那么防御素的存在 可以导致协同作用，特别是如果单独应用的杀真菌剂的浓度就抑制而言是次于最大的。同 样，如果一种或两种组分以如此高的水平存在，以便导致最大可观察的抑制，那么协同作用 可以被掩蔽。关于防御素杀真菌剂组合的一般系统因此被称为“协同作用的”，因为存在关 于协同作用的可能性，即使协同作用在所有条件下都未观察到。植物防御素和化学杀真菌 剂之间的协同作用提供比通过任一组分单独作用可以获得的更大的真菌抑制，对于至少某 些剂量。在某些情况下，并非可测量地有效针对特定病原体的杀真菌剂在防御素的存在下 变得有效。因此，本发明提供了不受真菌病的增加的植物保护，伴随对化学杀真菌剂减少的
11依赖性。优点包括对种植者的输入成本减少，针对植物病原体的更广泛的活性谱，和对于环 境损害的可能性减少。此外，关于杀真菌剂抗性的真菌菌株发展的选择压力极大减少，这允 许市场寿命延长以及抗性真菌菌株的增殖减少和多重抗性菌株出现的可能性减少。关于使用本发明的系统的方法可以适用于待保护的植物和待抑制的一种或多种 真菌菌株的个别组合，如本领域充分理解的。真菌的感染机制，对真菌攻击敏感的植物的一 个或多个部分，以及当真菌病可能发生时植物的生长阶段，是待考虑的重要因素。例如，如 果成熟植物的叶或果实是真菌生长的主要部位，那么杀真菌剂作为叶(表面)喷雾的应用 可以是递送化学杀真菌剂的优选方法。在棉花中由Fov引起的真菌病的情况下，最显著的 损害在幼苗中发生。在这种情况下，杀真菌剂组分优选掺入土壤或其他生长介质内，包被在 种子上或喷射在出现的籽苗上。由于植物与化学杀真菌剂的接触，可以存在杀真菌剂遍及 植物的系统转运。杀真菌组合物的有效应用率可以受许多因素包括环境影响，并且应在实际使用条 件下决定。优选地，应用率为约o.llb/英亩-约IOlb/英亩化学杀真菌剂。目的化学杀真 菌剂可以以组合物的形式应用于待保护和处理的植物，所述组合物具有载体、表面活性剂、 佐剂或在配制技术中照例采用的其他应用促进化学制品。合适的载体、表面活性剂等可以 是固体或液体，并且是在配制技术中通常采用的物质，例如天然或再生矿物质、溶剂、分散 剂、湿润剂、增粘剂、增稠剂、粘合剂和/或肥料。杀真菌剂组合物可以应用于待保护不受真菌攻击的植物的地上部分，特别是叶 (叶敷)。应用频率和比率依赖于病原体的生物学和气候情况。组合物还可以经由土壤或 经由水通过根渗透植物(系统作用)，如果植物的部位用液体制剂或溶解于水中的那种(例 如，稻培养)浸渍，或如果组合物以固体形式引入土壤内，例如以粒剂的形式(土壤应用)。 为了处理种子，组合物可以通过浸渍块茎或种子而应用于块茎或种子(包衣)，或通过用液 体制剂浸渍或通过用组合的湿或干制剂包被而应用于种子。关于应用的其他策略也是本领 域众所周知的。在本发明的一个方面，提供了用于保护植物不受真菌病的系统，并且预防或处理 导致关于植物或植物部分的杀真菌剂处理的需要减少，因此降低材料成本、劳动力和环境 污染，或延长此类植物的产物(例如，果实、种子等)的保存期。术语“植物”包括完整植物 及其部分，包括但不限于枝条营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构 (例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成 熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及 其后代。可以使用本发明的系统加以保护的植物包括高等和低等植物，包括被子植物(单 子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓 植物和多细胞藻类。用于在本发明的系统中使用的植物可以包括任何维管植物，例如单子 叶植物或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于，苜蓿、苹果、拟南芥属(Arabidopsis)、香 蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米(玉蜀黍)、海甘蓝、 越桔、黄瓜、石斛、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、liliacea(百合)、亚麻籽、粟、甜瓜、芥 菜、燕麦、油棕、油料种子油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、 油菜籽、稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草 坪草、小麦和蔬菜作物，例如莴苣、芹菜、椰菜、花椰菜、葫声、洋葱(包括大蒜、分葱、韭和细香葱)；果树和坚果树，例如苹果、梨、桃、橙、葡萄柚、柠檬、酸橙、杏树、山核桃、胡桃、榛子； 藤本植物，例如葡萄、猕猴桃、蛇麻草；果实灌木和荆棘，例如覆盆子、黑莓、醋栗；森林树， 例如岑树、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、populaH白杨)；其中优选苜蓿、卡诺拉油菜、蓖 麻、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油料种子油菜、花生、马铃薯、稻、红花、芝 麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、马铃薯和小麦。更特别地，用于在本发明的方法中使用的植物 包括任何农作物植物，例如饲料作物、油料种子作物、谷类作物、果实作物、蔬菜作物、纤维 作物、香料作物、坚果作物、草皮作物、糖料作物、饮料作物和森林作物。农作物植物可以是 大豆、小麦、玉米、棉花、苜蓿、甜菜、稻、马铃薯、番茄、洋葱、豆类或豌豆植物。“转基因植物”指包含在相同物种、变种或栽培变种的野生型植物中未发现的遗传 材料(即，“外源的)的植物或其种子。遗传材料可以包括转基因、插入诱变事件(例如通 过转座子或T-DNA插入诱变)、活化加标签序列、突变序列、同源重组事件或通过嵌合修复 术(chimeraplasty)修饰的序列。一般地，外来遗传材料已通过人为操作引入植物内，但如 本领域技术人员认识到的，可以使用任何方法。转基因植物可以包含表达载体或盒。表达盒一般包括与允许多肽表达的合适的诱 导或组成性调节序列可操作地连接(即，在其调节控制下)的编码多肽的序列。表达盒可 以通过转化或通过在亲本植物转化后的育种引入植物内。术语转基因植物包括包含表达载 体或盒的后代植物(和种子)。用于在呈现的系统中使用的植物或植物部分包括在植物发育的任何阶段时的植 物。优选地，应用在发芽、籽苗生长、营养生长和生殖生长的阶段过程中发生。更优选地，本 发明的应用在营养和生殖生长的阶段过程中发生。营养和生殖生长的阶段在本文中也称为 “成年”或“成熟”植物。虽然本公开内容提供了使用化学杀真菌剂和抗真菌防御素及其协同作用，用于保 护植物不受真菌感染的系统，但应当理解另外材料可以加入应用的组合物中，以达到就植 物健康而言甚至更多的利益，例如通过掺入杀昆虫或杀线虫化合物，或通过利用超过一种 防御素和/或超过一种化学杀真菌剂。防御素组分优选由待保护的植物供应，尽管在特定情况下可以利用表面喷雾或种 子包被。在特定实施方案中，使用本领域众所周知的方法使植物进行遗传修饰，以表达所需 防御素。在待保护不受由Fov引起的疾病的棉花的例子中，通常对Fov感染敏感的棉花变 种已进行遗传转化，以表达防御素NaDl。在田间试验中已显示，与未经转化的亲本变种相比 较，表达NaDl的转基因棉花变种被明显保护不受Fov感染的病理效应(于2008年4月18 日提交的美国申请12/105，956，引入本文作为参考至与本公开内容不矛盾性的程度)。结 果确定Fov对NaDl敏感，并且如本文所描述的，当与化学杀真菌剂的应用相组合时，可以由 转基因植物表达的防御素例如NaDl的量足以促成协同效应。需要时，经纯化的防御素蛋白质可以与化学杀真菌剂直接组合为混合物，前提是 它们可以通过分开的应用方式一起或顺次配制。在一个进一步的实施方案中，防御素可以 通过在待保护的植物旁边生长的转基因“保育(rmrse) ”植物提供。关于某些植物防御素的膜透化已得到报告，尽管透化的机制仍未得到研究。在植 物防御素RsAFP2和DmAMPl的情况下，透化被认为涉及在细胞表面上的特异性受体。特异性 鞘脂在质膜中的存在也是这些防御素的活性所需的，可能作为结合位点(Thevissen等人，2000a, b ；Thevissen 等人，2004 ；Thevissen 等人，2005)。就针对丝状真菌尖孢镰刀菌(Fov)、大丽轮枝菌、烟草根串珠霉、构巢曲霉菌和十 字花科小球腔菌的抗真菌活性在体外测试NaDl。在1 μ M时，NaDl使Fov和十字花科小球腔 菌的生长延迟50%，而大丽轮枝菌、烟草根串珠霉和构巢曲霉菌全被抑制约65%。在5μΜ NaDl时，所有5个物种的生长都被抑制超过80%。这5个真菌物种都是子囊菌门的成员， 并且分布在亚门盘菌亚门(原文为pezizomycotiria)的3个纲中。这些真菌是农业上重 要的真菌性病原体。迄今为止所测试的所有丝状真菌对经由NaDl的抑制敏感。针对禾谷 镰刀菌的抗真菌活性在本文中对于NaD4、tomdef2和Tomdef3得到证实。在所测试的条件下，NaDl对测试的酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、 白色念珠菌(Candida albicans)和巴斯德毕赤酵母(Pichiap pastoris)，或革兰氏阴性 菌和革兰氏阳性菌的生长没有影响。在其中植物防御素RsAFP2和DmAMPl分别抑制白色 念珠菌和酿酒酵母的相同条件下重复NaDl对酵母的作用。即使在这些条件下，NaDl也不 抑制子囊菌门、酵母亚门的任何酵母的生长。此外，NaDl对于人HeLa细胞或草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) Sf-21 昆虫细胞是无毒的。表1NaDl对各种细胞类型的生长抑制作用
权利要求
用于保护植物不受由给定敏感真菌引起的疾病的系统，其包括第一组分和第二组分，所述第一和第二组分各自是给定敏感真菌的抑制剂，所述第一组分是不由所述植物天然表达的植物防御素，所述第二组分是化学杀真菌剂，当相组合与所述真菌相接触时，组合中的所述防御素和所述杀真菌剂就抑制所述真菌而言是协同作用的。
2.权利要求1的系统，其中所述防御素是花的防御素。
3.权利要求1的系统，其中所述防御素与所述敏感真菌相接触时，显示出大于0.12的 相对透性指数。
4.权利要求2的系统，其中所述防御素是茄科植物的防御素。
5.权利要求2的系统，其中所述防御素选自NaDl、NaD4、Tomdef2或Tomdef3。
6.权利要求1的系统，其中所述植物防御素是NaDl或其保留抗真菌活性的变体。
7.权利要求1的系统，其中所述化学杀真菌剂是甲氧基丙烯酸酯或三唑或甲霜灵杀真 菌剂。
8.权利要求7的系统，其中所述防御素是花的防御素。
9.权利要求7的系统，其中所述防御素与所述敏感真菌相接触时，显示出大于0.12的 相对透性指数。
10.权利要求7的系统，其中所述防御素是茄科植物的防御素。
11.权利要求7的系统，其中所述防御素选自NaDl、NaD4、Tomdef2或Tomdef3。
12.权利要求7的系统，其中所述甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂是腈嘧菌酯、啶氧菌酯或氟 嘧菌酯。
13.权利要求7的系统，其中所述三唑杀真菌剂是丙环唑、戊唑醇、氟硅唑、氟喹唑或丙 硫菌唑。
14.权利要求1的系统，其中所述敏感真菌是丝状真菌。
15.权利要求14的系统，其中所述丝状真菌选自镰刀菌属(Fusarium)、核盘菌属 (Sclerotinia)、小球腔菌属(Leptosphaeria)或轮枝孢属(Verticillium)0
16.权利要求1的系统，其中所述植物防御素由表达所述植物防御素的转基因植物提{共。
17.权利要求1的系统，其中待保护的所述植物是表达所述植物防御素的转基因植物。
18.权利要求1的系统，其中所述植物防御素被应用于待保护的所述植物。
19.权利要求1的系统，其中待保护的所述植物是籽苗。
20.权利要求19的系统，其中将所述杀真菌剂应用于种子，并且其中所述植物防御素 由所述籽苗表达。
21.用于鉴定增强化学杀真菌剂的抗真菌活性的防御素的方法，其包括步骤在测试 防御素的存在下和分开地在不存在测试防御素的情况下，使真菌与透性指示剂化合物相组 合；比较在所述测试防御素的存在和不存在下，所述真菌中透性指示剂化合物的任何可检 测的细胞内的量，由此与在不存在所述测试防御素的情况下检测出的指示剂化合物的细胞 内的量相比较，其的存在增加细胞内透性指示剂化合物的量的测试防御素，被鉴定为增强 化学杀真菌剂的抗真菌活性的防御素。
22.权利要求21的方法，其中增强化学杀真菌剂的抗真菌活性的防御素的特征在于， 在其中NaDl的透性指数设为1. O的标度上具有大于0. 12的相对透性指数。
23.具有大于0.12的相对透性指数的防御素，其是如通过权利要求22的方法鉴定的。
24.权利要求16的方法，其中所述透性指示剂化合物是SYT0X |Green。
25.用于保护植物不受由给定敏感真菌引起的疾病的系统，其包括第一组分和第二组 分，所述第一组分是其为所述真菌的抑制剂的化学杀真菌剂，所述第二组分是不由所述植 物天然表达的植物防御素，所述植物防御素通过权利要求21的方法鉴定。
26.权利要求25的系统，其中与在用于组合接触相同的剂量下由任一组分与所述真菌 个别接触提供的抑制相比较，通过所述第一和第二组分相组合与所述真菌相接触提供的真 菌抑制程度是协同作用的。
27.植物防御素，其具有如本文所描述的NaD4的性质。
28.植物防御素，其具有如本文所描述的Tomdef3的性质。
29.第一组分和第二组分对植物的用途，所述第一和第二组分各自是给定敏感真菌的 抑制剂，所述第一组分是不由所述第一次所提及的植物天然表达的植物防御素，所述第二 组分是抑制所述真菌的化学杀真菌剂，当相组合与所述植物上的所述真菌相接触时。全文摘要
用于减少植物的真菌感染的发生率或严重度的系统，其包括可以通过叶或根(土壤或液体营养素)应用提供的化学杀真菌剂组分，连同不由待保护的植物天然表达或以更低的量或在不同组织中表达的抗真菌植物防御素，提供了在针对经由植物致病性真菌的感染的保护中的协同改善，所述植物致病性真菌对防御素和杀真菌剂敏感。杀真菌剂可以是甲氧基丙烯酸酯或三唑，并且防御素可以选自广泛范围的已知防御素，例如NaD1及其他，或它可以是就对植物的低毒性进行改造的嵌合防御素。防御素可以作为蛋白质制剂任选连同杀真菌剂一起提供，或它可以通过在待保护不受真菌感染的植物中的重组表达提供。
文档编号C07K14/415GK101965131SQ200980108323
公开日2011年2月2日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年2月1日
发明者J·麦肯娜, M·A·安德森, N·梵登维尔登, R·L·希思 申请人:赫希玛有限公司