α5-β1抗体和它们的用途的制作方法

专利名称：α5-β1抗体和它们的用途的制作方法
α5_β1抗体和它们的用途本申请要求对2008年2月5日提交的美国临时申请案61/026，027和2008年9 月9日提交的美国临时申请案61/095，429(其两者以其全文通过引用合并入本文)的优先权。领域本公开内容涉及结合α 5β 1的抗体和其抗原结合部分。本公开内容还涉及编码 此类抗体和抗原结合部分的核酸分子、制备α 5β 1抗体和抗原结合部分的方法、包含此类 抗体和抗原结合部分的组合物和使用抗体、抗原结合部分和组合物的方法。背景整联蛋白α 5β 1是结合纤连蛋白并且参与细胞附着和血管生成的异二聚体细胞 表面蛋白。该异二聚体由α 5亚基和β 1亚基组成。整联蛋白α 5β1称为“经典纤连蛋 白受体”，其在基质附着、迁移、增殖、分化和存活中起着至关重要的作用。虽然几种整联蛋 白结合纤连蛋白(FN)，但α 5β1对于FN具有选择性，因为其需要FN的第9 (PHSRN)和第 10 (RGDS) III型重复上的肽序列来进行配体识别和最佳相互作用。(Danen等人J. Biol. Chem. 270 (37) :21612_21618 (1995) ；Redick 等人 J. Cell Biol. 149(2) :521_527 (2000)； Takagi等人BMBO J. 22 :4607_4615 (2003))。整联蛋白介导的细胞至FN的附着可触发钙流、 激活酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶以及肌醇脂质代谢，并且调控控制肌动蛋白细胞骨 架和细胞周期进程的小GTP酶的Rho家族的活性。在大多数胚胎组织中观察到α 5β 1的表达，但水平在出生后以与终末细胞分化 一致的方式减少(Muschler & Horwitz Development 113(1) :327_337 (1991))。在野生型 成年小鼠中，表达主要存在于脉管系统和结缔组织中，虽然低水平的受体广泛分布。α 5β 1 和FN的表达在人肿瘤的血管上和在生长因子及细胞因子刺激的组织中得到显著地和协 同地增强。血管生成细胞因子(angiogenic cytokine)例如bFGF、VEGF，IL-8，TGF-β和 TNF-α在体外和体内上调内皮细胞上的α 5β1表达，然而此类分子在正常人血管和组织 中以最低限度表达(Kim 等人 Am. J. Path. 156(4) 1345-62 (2000) ；Enaida 等人 Fukushima J.Med· Sci 44(1) :43_52(1998) ；Klein 等人 Mol Biol. Cell4(10) :973_982 (1993))。高水平的α 5β1表达不限定于脉管系统中，因为在许多类型的癌症中也频繁 观察到肿瘤细胞表达α5β1。肿瘤缺氧与增加的肿瘤α5β1表达相关联(Mousa等人 J. Cell. Biochem. 74 135-143 (1999))。整联蛋白据认为对于肿瘤内渗入新形成的毛细血管 和外渗至远距离部位，从而导致肿瘤扩散和转移性疾病是非常重要的。总的说来，α5β1 的表达模式与在促进癌症(通过介导基质和肿瘤细胞的活性)中的多个作用相符。多种临 床研究已使肿瘤细胞上α 5 β 1的上调与人黑素瘤、口腔鳞状细胞癌和B细胞白血病的进 Mffi^K (Jin & Varner， Br. J. Cancer 90 561-565 (2004) ；Danen ^A Histopathology 24(3) 249-256(1994) ；Shinohara 等人，Am. J. Clin. Pathol 111(1) :75_88 (1999))。概述本公开内容提供了展示对人整联蛋白α 5β 1的高亲和力结合的分离的单克隆抗 体，特别地人单克隆抗体。本公开内容中描述的抗体通常是人抗体，虽然在备选情况下抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一个方面，本公开内容涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗体 (a)以IxlO-7M或更小的Kd结合人整联蛋白α 5β 1 ；和(b)能够诱导抗体依赖性细胞毒性。 例如，在一种情况下，抗体属于能够诱导ADCC的亚类例如IgGl或IgG3。在另一种情况下， ADCC活性是向Fc区域导入糖修饰例如改变的糖基化模式(与天然糖模式相比较)的结果。在某些情况下，抗体以5x10_8M或更小，2x10_8M或更小，1χ10_8Μ或更小，5xlO_9M或 更小，4x10_9M或更小，3x10_9M或更小，或2. 7xlO_9M或更小的Kd结合人整联蛋白α 5 β 1。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗 体(a)以1x10_7M或更小的Kd结合人整联蛋白α5β1;禾Π (b)显示与可比较的抗体相比 增强的ADCC活性。例如，在一种情况下，与野生型Fc区域相比较，具有增强的ADCC活性的 抗体在Fc区域中包含至少一个突变，并且增强的ADCC活性是相对于相同的但包含野生型 Fc区域的抗体而言的。在某些实例中，抗体以5xlO_8M或更小，2xlO_8M或更小，1x10_8M或更 小，5x10_9M或更小，4x10_9M或更小，3x10_9M或更小或2. 7x10、或更小的Kd结合人整联蛋白 α5β 1。在另外的实例中，相对于可比较的抗体，抗体显示增强的ADCC活性，所述ADCC活 性与可比较的抗体相比，为至少1. 1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.5倍、至少2倍、至 少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、 至少200倍、至少500倍或至少1000倍，其中可比较的抗体是相同的但具有野生型Fc区域 的抗体。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中抗 体(a)以1x10_7M或更小的Kd结合人整联蛋白α5β1 ；和(b)与野生型Fc区域相比较在 Fc区域中包含至少一个突变。例如，在一种情况下，抗体的亚类是IgGl并且IgGl亚类的 Fc区域中至少一个氨基酸被突变。在另外的实例中，至少一个突变在IgGl亚类的Fc区域 中的位点丝氨酸247、丙氨酸338或异亮氨酸340上发生。在另外的实例中，至少一个突变 选自S247D、A338L和I340E。在另外的实例中，抗体包含突变S247D、A338L和I340E。本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与 包含下列的抗体交叉竞争或竞争与人整联蛋白α 5β 1的结合(a)重链可变区，其含有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或其保守修饰形式；和(b)轻链可变区，其含有SEQ ID NO 8的氨 基酸序列，或其保守修饰形式。本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为人 Vh 4-39基因的产物或源自人Vh 4-39基因的重链可变区，其中抗体特异性结合人整联蛋白 α 5β 1。本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为 人VKL6基因的产物或源自人VKL6基因的轻链可变区，其中抗体特异性结合人整联蛋白 α 5β 1。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :1或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl。在另一个方面，本公开内容提供 了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :2或其保守修饰形式的重 链可变区CDR2。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其 包含含有SEQ ID NO :3或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :4或其保守修饰形式 的轻链可变区CDR1。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部 分，其包含含有SEQ ID NO :5或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2。在另一个方面，本公 开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :6或其保守修 饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原 结合部分，其包含(a)含有SEQ ID NO=I或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl ；(b)含有SEQ ID NO 2或其保守修饰形式的重链可变区⑶R2 ；(c)含有SEQ ID NO 3或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3 ；(d)含有SEQ ID NO 4或其保守修饰形式的轻链可变区⑶Rl ；(e)含有SEQ ID NO 5或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2 ；和(f)含有SEQ ID NO 6或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R3。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :7的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。例如，本公开内容提供了 包含重链可变区的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区与SEQ ID NO :7中所示的氨基 酸序列至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%同一。 在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。例如，本公开内容提供了包含轻 链可变区的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区与SEQ ID NO :8中所示的氨基酸序列 至少80 %，至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一。在另外 的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO 7 的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区和含有SEQ ID NO :8的氨基酸序列或其保守 修饰形式的轻链可变区。例如，本公开内容提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的 单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区与SEQ ID NO :7中所示的氨基酸序列至少 80%，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一，所述轻链可 变区与SEQ IDNO 8中所示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少90%、至少95%、至少 97%、至少98%或至少99%同一。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO: 13或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl。在另一个方面，本公开内容提 供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :14或其保守修饰形式的 重链可变区CDR2。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其包含含有SEQ ID NO 15或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3。在另一个方面，本公开 内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:16或其保守修饰 形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结 合部分，其包含含有SEQ ID NO :17或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2。在另一个方面， 本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:18或其保 守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其 抗原结合部分，其包含(a)含有SEQ ID NO 13或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl ；
(b)含有SEQ ID NO 14或其保守修饰形式的重链可变区⑶R2 ；(c)含有SEQ ID NO 15或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3 ；(d)含有SEQ ID NO 16或其保守修饰形式的轻链可变区⑶Rl ；(e)含有SEQ ID NO 17或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2 ；和(f)含有SEQ ID NO 18或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R3。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面，本公开 内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:20的氨基酸序列 或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或 其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :19的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区 和含有SEQ ID NO :20的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :23或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl。在另一个方面，本公开内容提 供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :24或其保守修饰形式的 重链可变区CDR2。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其包含含有SEQ ID NO :25或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3。在另一个方面，本公开 内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:26或其保守修饰 形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结 合部分，其包含含有SEQ ID NO :27或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2。在另一个方面， 本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:28或其保 守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其 抗原结合部分，其包含(a)包含SEQ ID NO 23或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl ；(b)包含SEQ ID NO 24或其保守修饰形式的重链可变区⑶R2 ；(c)包含SEQ ID NO 25或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3 ；(d)包含SEQ ID NO 26或其保守修饰形式的轻链可变区⑶Rl ；(e)包含SEQ ID NO 27或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2 ；和(f)包含SEQ ID NO 28或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R3。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :29的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面，本公开 内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:30的氨基酸序列 或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或 其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :29的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区 和含有SEQ ID NO :30的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :33或其保守修饰形式的重链可变区⑶Rl。在另一个方面，本公开内容提 供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :34或其保守修饰形式 的重链可变区CDR2。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部 分，其包含含有SEQ ID NO :35或其保守修饰形式的重链可变区⑶R3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:36或其保守修 饰形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原 结合部分，其包含含有SEQ ID NO :37或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2。在另一个方 面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:38或 其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体 或其抗原结合部分，其包含(a)包含SEQ ID NO :33或其保守修饰形式的重链可变区CDRl ； (b)包含SEQ ID NO 34或其保守修饰形式的重链可变区⑶R2 ； (c)包含SEQ ID NO 35或 其保守修饰形式的重链可变区CDR3;(d)包含SEQ ID NO :36或其保守修饰形式的轻链可 变区⑶Rl ； (e)包含SEQ ID NO 37或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R2 ；和(f)包含SEQ ID NO 38或其保守修饰形式的轻链可变区⑶R3。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 含有SEQ ID NO :39的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面，本公开 内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID N0:40的氨基酸序列 或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或 其抗原结合部分，其包含含有SEQ ID NO :39的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区 和含有SEQ ID NO :40的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面，提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其结合与本文中公开的任 何抗体相同的人整联蛋白α 5β1上的表位和/或与这样的抗体竞争对人整联蛋白α5β1 的结合。在一个实施方案中，本公开内容提供了以保藏号ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的材料。在 另一个实施方案中，本公开内容提供了以保藏号ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的材料。在另一个实 施方案中，本公开内容提供了包含以保藏号ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的重链可变区的分离的 抗体。在另一个实施方案中，本公开内容提供了包含以保藏号ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的轻链 可变区的分离的抗体。在另一个实施方案中，本公开内容提供了包含以保藏号ΡΤΑ-9377保 藏在ATCC的重链可变区的分离的抗体，但其中已在VH区域产生了种系突变I30S和N33S。 在另外的实施方案中，本公开内容提供了包含分别以保藏号ΡΤΑ-9377和ΡΤΑ-9378保藏在 ATCC的重链和轻链可变区的分离的抗体，或其中已在VH区中产生了种系突变I30S和N33S 的所述抗体。在另外的实施方案中，本公开内容提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含以 保藏号ΡΤΑ-9377保藏在ATCC的重链可变区的重链⑶R1、⑶R2和⑶R3区，或当所述重链可 变区包含种系突变I30S和N33S时包含所述⑶R1、⑶R2和⑶R3。在另外的实施方案中，本 公开内容提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含以保藏号ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的轻链 可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在另外的实施方案中，本公开内容提供了分离的抗 体，所述分离的抗体包含分别以保藏号ΡΤΑ-9377和ΡΤΑ-9378保藏在ATCC的重链和轻链可 变区的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3区和重链⑶R1、⑶R2和⑶R3区，或当所述重链可变区包含 种系突变I30S和N33S时，包含所述CDRU CDR2和CDR3区。本公开内容的抗体可以是，例如全长抗体，例如IgGl或IgG4亚类的全长抗体。备 选地，抗体可以是抗体片段例如Fab或Fab' 2片段或单链抗体。在一种情况下，本公开内 容提供了上述任何抗体，其是亚类IgGl的人全长抗体，其中IgGl亚类的Fc区域中的至少 一个氨基酸被突变。在另外的情况下，至少一个突变发生在位点丝氨酸247、丙氨酸338或异亮氨酸340上。在另外的情况下，至少一个突变选自S247D、A338L和I340E。在另外的 情况下，抗体包含突变S247D、A338L和I340E。在另外的方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO 9或其保守修饰形式中显示的 重链的分离的单克隆抗体。例如，抗体包含与SEQ IDNO 9中所示的氨基酸序列至少80%， 至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的重链。在另外的 方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO :10或其保守修饰形式中显示的轻链的分离的单克 隆抗体。例如，抗体包含与SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一的轻链。在另外的方面，本公开内容 提供了包含SEQ ID NO :9或其保守修饰形式中显示的重链和SEQ ID N0:10或其保守修饰 形式中显示的轻链的分离的单克隆抗体。例如，抗体包含与SEQ ID NO :9中显示的氨基酸 序列至少80 %，至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一的重 链和与SEQ ID NO :10中显示的氨基酸序列至少80%，至少85%、至少90%、至少95%、至 少97%、至少98%或至少99%同一的轻链。在一些实施方案中，所述的本公开内容的任何抗α 5β 1抗体的重链的C末端赖氨 酸被切割，从而不存在。例如，在一些实施方案中本公开内容的抗体包含SEQ ID Ν0:43中 显示的IgGl重链恒定区，但其中C末端赖氨酸不存在。在多种情况下，抗α 5β 1抗体的重 链和轻链可任选地包含信号序列。在另外的方面，本公开内容提供了包含本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分 和可药用载体的组合物。在另外的方面，本公开内容提供了包含连接至治疗剂的本文中描述的任何抗体或 其抗原结合部分的免疫缀合物。在一种情况下，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。在另外 的方面，本公开内容提供了包含本文中描述的任何免疫缀合物和可药用载体的组合物。本 公开内容还提供了包含连接至第二功能性部分的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子， 所述第二功能性部分具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。还提供了包含本公开内容的抗体或其抗原结合部分，或免疫缀合物或双特异性分 子以及可药用载体的组合物。本公开内容还包括编码抗体或其抗原结合部分的核酸分子以及包含此类核酸的 表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。一个方面，例如，是包含SEQ ID Ν0:11中显示 的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子，或表达载体。另外的方面是包含SEQ ID NO 12中显示的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子或表达载体。另外的方面是包含选 自SEQ ID N0:21、22、31、32、41和42的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子或表达载 体。本公开内容还提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠(其中小鼠表 达本公开内容的抗体)以及从这样的小鼠制备的杂交瘤(其中杂交瘤产生本公开内容的抗 体)。本公开内容还提供了包含本文中所述的任何表达载体的宿主细胞。在另外的方面，本公开内容提供了用于制备抗整联蛋白α 5β1抗体的方法，其包 括在本文中描述的任何宿主细胞中表达抗体和从宿主细胞分离抗体。在另外的方面，本公开内容提供了用于抑制表达整联蛋白α5β1的肿瘤细胞生 长的方法，所述方法包括将细胞与抗体或其抗原结合部分(其以IxlQ-7M或更小的Kd结合人整联蛋白α 5β 1并且能够诱导抗体依赖性细胞毒性)接触。在一种情况下，抗体是全长 人抗体。在另外的情况下，抗体或其抗原结合部分经工程改造增强了其诱导抗体依赖性细 胞毒性的能力。在另外的情况下，通过Fc区域中至少一个氨基酸残基的突变来获得增强。在另外的方面，本公开内容提供了抑制表达整联蛋白α 5β1的肿瘤细胞生长的 方法，包括将细胞与有效地抑制肿瘤细胞生长的量的本文中所述的任何抗体或其抗原结合 部分接触。在另外的方面，本公开内容提供了本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分用于 制造用于治疗异常细胞生长的药剂的用途。在另外的方面，本公开内容提供了本文中描述 的任何抗体或其抗原结合部分，其用于治疗和/或诊断异常细胞生长。在该方法的一个实 施方案中，异常细胞生长是癌症，包括，但不限于，间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)肿瘤、原发性 或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头 颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、胃肠(胃、结直肠和 十二指肠)癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌(carcinoma of the vulva)、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾 上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血 病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿 瘤、原发性CNS淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干神经胶质 瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌症、胆囊癌(gall bladder cancer)、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤 维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或一种或多种上述癌症的组合。本公开内容还提供了基于本文中提供的抗α 5β1抗体的序列制造“第二代”抗 α5β1抗体的方法。例如，本公开内容提供了用于制备抗α5β1抗体的方法，其包括(a) 提供⑴包含SEQ ID NO :1、13、23或33中显示的CDRl序列、SEQ ID NO :2、14、24或34中 显示的⑶R2序列和/或SEQ ID NO :3、15、25或35中显示的⑶R3序列的重链可变区抗体 序列；和 / 或(ii)包含 SEQ ID N0:4、16、26 或 36 中显示的 CDRl 序列、SEQ ID N0:5、17、 27或37中显示的CDR2序列和/或SEQ ID NO :6、18、28或38中显示的CDR3序列的轻链 可变区抗体序列；(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个 氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和(c)将改变的抗体序列表达为蛋白质。根据下列不应当被解释为限定的详细描述和实施例，本公开内容的其他特征和 有利方面将变得显然。在整个本说明书中引用的所有参考资料、Genbank条目(Genbank entry)、专利和公布的专利申请的内容明确地通过引用合并入本文。附图概述图IA显示22B5重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 11)；图IB显示22B5重链可 变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)_⑶R区以下划线标示；图IC显示22B5轻链可变区的DNA 序歹丨J (SEQ ID NO 12)；图ID显示22B5轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID N0:8)_CDR区以 下划线标示；图IE显示24C7重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 21)；图IF显示24C7重 链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)-CDR区以下划线标示；图IG显示24C7轻链可变区 的 DNA 序歹Ij (SEQ ID NO 22)；图IH显示24C7轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :20)-⑶R区以下划线标示； 图II显示1D9重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 31)；
图IJ显示1D9重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :29)-⑶R区以下划线标示。 图IK显示1D9轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 32)；图IL显示1D9轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :30)-⑶R区以下划线标示； 图IM显示2D2重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 41)；图IN显示2D2重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :39)-⑶R区以下划线标示；

图10显示2D2轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO 42)；图IP显示2D2轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :40)-⑶R区以下划线标示； 图IQ显示IgGl重链恒定区的氨基酸序列，突变S247D、A338L和I340E以下划线标示；和图 IR显示IgGl轻链恒定区的氨基酸序列。图2显示22B5重链可变结构域(Vh)与相应的种系序列的比对。还显示的是22B5 轻链可变结构域(Vk)与相应的种系序列的比对。CDR区域以下划线标示，相同的残基由虚 线表示，点表示缺失。图3显示通过在固定的22B5/DLE的上方注射不同浓度的α 5 β 1重组细胞外结构 域获得的传感图的叠加。在4. OmM CaCl2存在的情况下收集该数据。注射的顺序是从低浓 度至高浓度。图4显示通过FACS获得的22B5/DLE对HUVEC的剂量依赖性结合。图5显示比较人与小鼠Fcy受体的平衡解离常数，“wt 〃是指22Β5野生型 IgGl ； “ DLE"是指 22B5/DLE。图6显示HUVEC细胞附着阻断测定的结果。结果显示22B5和不同亚类的变体以及 阴性对照(BHA2 IgGl)对HUVEC附着至纤连蛋白的抑制的水平。还显示了计算的IC5tl值。图7显示通过Western印迹法测量的HUVEC和20个肿瘤细胞系的人α 5表达。图8显示由22B5/DLE诱导的体外ADCC(与22B5wt IgGl相比)。图8A显示测量 在人PBMC存在的情况下通过22B5/DLE和22B5wt IgGl产生的U87MG细胞的ADCC的基于 LDH的检测测定。图8B显示测量在人PBMC存在的情况下通过22B5/DLE和22B5wt IgGl产 生的HUVEC的ADCC的基于ToxiLight的检测测定。图9显示基于LDH的检测测定，该检测测定显示在广泛的抗原表达水平上高于wt 22B5 IgGl的来自22B5/DLE的显著的ADCC增强。图10显示A549-LUC实验性转移模型中22B5/DLE的抑制活性。图IOA 在第8周通 过BLI测量的肺转移体积(对于对照组η = 11，对于22Β5 IgG2组η = 14以及对于22Β5/ DLE组η = 12)。图IOB 给药后22B5IgG2处理组中肺肿瘤的再生长停止。相比之下，22B5/ DLE处理组几乎不显示再生长。图IOC 各处理组的动物存活率的Kaplan-Meier曲线(终点 =BLI IxlO8个光子/秒)，p < 0. 0001，对照媒介物组与所有其他组比较，以及ρ < 0. 05， 22B5/DLE与22Β5 IgG2组之间的比较。图 11 显示通过 FACS 获得的 1D9、1D9/DLE、24C7/DLE、2D2/DLE、22B5 和 22B5/DLE 对HUVEC的剂量依赖性结合。图 12 显示由 1D9、1D9/DLE、2D2/DLE、22B5/DLE 和 24C7/DLE 诱导的体外 ADCC。图13显示转移性黑素瘤的同基因模型(syngeneic model)中1D9/DLE的ADCC依 赖性抗肿瘤功效。图13A 切取自所有组的肺的大体外观(gross appearance)。图13B 肺 重量的定量(*P < 0. 05，1D9 IgGlDLE对1D9 IgG2)。图13C 肺表面上可见的转移集落的数目的定量。使用ANOVA和Bonferroni ‘ s多重比较检验进行统计分析(*p < 0. 05，1D9 IgGl DLE 对 1D9 IgG2 ；*p < 0. 05，1D9 IgGlDLE 对抗 KLH IgG2)。详细描述本公开内容涉及以高和亲力特异性结合α 5β1的分离的单克隆抗体，特别地人 单克隆抗体。在某些情况下，本公开内容的抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或 包含特定的结构特征例如含有特定氨基酸序列的CDR区。本公开内容提供了分离的抗体、 制备此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫缀合物和双特异性分子以及包含本公开内容的 抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本公开内容还涉及使用抗体例如检测 α 5 β 1以及治疗与α 5 β 1的表达相关的疾病例如异常细胞生长(例如癌症)的方法。因 此，本公开内容还提供了使用抗α 5β1抗体或其抗原结合部分治疗各种类型的异常细胞 生长例如癌症的方法。为了可以更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。另外的定义示于整个详 细描述中。除非在本文中另外定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语将具有本 领域技术人员通常所理解的意义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数并 且复数术语将包括单数。一般地，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、 微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名和技术是本领域内熟知的，且 常用于本领域。除非另外指出，否则通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和论述的 各种一般和更特别的参考资料中描述的方法进行本公开内容的方法和技术。此类参考资 料包括，例如，Sambrook 禾口 Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Approach. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY(2001)，Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular BiologyiJohn Wiley & Sons，NY(2002)，以及 Harlow 禾口 Lane Antibodies A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY(1990)。如在本领域通常进行的或如本文中描述的，按照厂商的说明书进行酶促反应和 纯化技术。结合本文中描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名以 及实验室方法和技术是本领域内熟知的，且常用于本领域。标准技术用于化学合成、化学分 析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。如本文中所使用的，每一个下列术语在该部分具有与其相关的意义。冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对 象。例如，“an element”是指一个元素或多于一个元素。如本文中所使用的，20个常规氨基酸和它们的缩写遵从习惯用法。参见 Immunology-Α Synthesis (第 2 版，E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。术语“α 5β1”和“整联蛋白a 5 β 1 ”可互换使用，并且包括人α5β1的变体、同 种型和物种同源物。天然人α5β1，例如，由a 5亚基(其来源于随后切割成通过二硫键 连接的两条链的前体序列)(Genbank登录号P08648)和β 1亚基(其来源于随后加工成成 熟形式的前体序列)(Genbank登录号Ρ05556-1)组成。β 1亚基已知以通过选择性剪接产 生的数个同种型的形式存在(参见，例如，Genbank登录号Ρ05556-2，Ρ05556-3, Ρ05556-4和P05556-5)。本公开内容的人α5β 1抗体可以，在某些情况下，与来自除人以外的物种的 α5β1交叉反应。在其他情况下，抗体可以完全特异于人α 5β1，且可以不展示物种或其 他类型的交叉反应性。“免疫应答”，如本领域技术人员所理解的，包括，但不限于，任何可检测的辅助T细 胞或细胞毒性T细胞应答的抗原特异性或同种异体(allogenic)激活、抗体的产生、T细胞 介导的变态反应的激活等。该术语包括例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和 由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致 对侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌性细胞或在自身免疫或病理性炎症的情 况下正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体清除。“信号转导途径”是指在信号从细胞的一个部分传递至细胞的另一部分中起作用 的许多信号转导分子之间的生物化学关系。如本文中所使用的，短语“细胞表面受体”包括， 例如，能够接收信号并且将这样的信号传递穿过细胞质膜的分子和复合物。本公开内容的 “细胞表面受体”的实例是α5β1整联蛋白。术语“抗体”，如本文中提及的，包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即，“抗原结 合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键链间连接的至少两条重(H)链和两条轻(L) 链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(在本文中缩写为Vh)和重链恒定区 组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和Ch3组成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写 为VJ和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域Q组成。V1^nt区还可进一步细分 成与较保守的区域(称为构架区(FR))相间的称为互补决定区(CDR)的高变区。各Vh* Vl由3个CDR和4个FR组成，其以下列顺序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基 端至羧基端排列。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区 可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典 补体系统的第一补体(Clq))的结合。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12个或 更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见， Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul，W.，ed.，第 2 片反· Raven Press，N. Y. (1989))。术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)，如本文中所使用的，是指保留 特异性结合抗原(例如，α5β1)的能力的一个或多个抗体片段。已显示可通过全长抗体 的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”包括的结合片段的实例 包括(i)Fab片段，由Vl、VH、Cl和Chi结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通 过铰链区上的二硫桥连接的2个Fab片段的双价片段；(iii)Fd片段，其由Vh和Cm结构域 组成；(iv)Fv段，其由抗体的单臂的八和Vh结构域组成，(v)dAb片段(Ward等人，(1989) Nature341 :544_546)，其由Vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管 Fv片段的两个结构域\和Vh由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的连接体将 它们连接起来，所述合成的连接体使得它们能够形成其中\和Vh部分配对形成单价分子的 单个蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包 括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用任何合适的技术，包括本领域技 术人员已知的常规技术获得，并且可以以与对于完整抗体所进行的相同的方式就效用筛选 片段。
“分离的抗体”，如本文中所使用的，意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他 抗体的抗体(例如，特异性结合α 5β1的分离的抗体基本上不含特异性结合除了 α5β1 外的抗原的抗体)。然而，特异性结合α 5β1的分离的抗体可以具有与其他抗原例如来自 其他物种的α 5β1分子的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和
/或化学药品。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，如本文中所使用的，是指单分子组成 的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对于特定表位的单结合特异性和亲和力。术语“人抗体”或“完全人抗体”，如本文中所使用的，意在包括具有其中构架区和 CDR区都来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒 定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开内容的人抗体或其抗原结合部分可包括不由 人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或定点诱变或由体内体细胞 突变导入的突变)。然而，术语“人抗体”，如本文中所使用的，不希望包括其中已将来源于 另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列移植至人构架序列的抗体。术语“人单克隆抗体”或“完全人单克隆体”是指展示单结合特异性的抗体，所述 抗体具有其中构架区和CDR区都来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案 中，人单克隆抗体由包含从转基因非人动物例如转基因小鼠(其具有包含人重链转基因和 轻链转基因的基因组)获得的B细胞的杂交瘤产生，其中B细胞被融合至永生化细胞。术语“重组人抗体”，如本文中所使用的，包括通过重组方法制备、表达、产生或分 离的所有人抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或 由其制备的杂交瘤(在下文中进一步描述)分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主 细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过任何 其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述方法牵涉人免疫球蛋白基因序列与其他DNA 序列的拼接。此类重组人抗体具有其中构架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的 可变区。然而，在某些实施方案中，可使此类重组人抗体经历体外诱变(或，当使用人Ig序 列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，从而重组抗体的Vh和\区的氨基酸序列是这样的 序列，其来源于人种系Vh和\序列且与其相关，但可能不天然地存在于体内人抗体种系库 (repertoire)中。如本文中所使用的，“同种型”或“类型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类型 (例如，IgM或IgG)。抗体的恒定结构域不参与对抗原的结合，但展示不同的效应子功能。 取决于重链恒定区的氨基酸序列，可将给定的人抗体或免疫球蛋白分配至5个主要类型的 免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的一个类型。不同类型的免疫球蛋白的结构和三 维构型是熟知的。在各种人免疫球蛋白类型中，只有人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM已知 活化补体。人IgGl和IgG3已知介导人中的ADCC。如本文中所使用的，“亚类”是指重链恒定区基因的同种型中的进一步分类，例如， IgG同种型中的IgGU IgG2、IgG3或IgG4亚类。如本文中所使用的，术语“化合物”或“药物化合物”包括抗体、其抗原结合部分、 免疫缀合物和双特异性分子。短语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结 合抗原的抗体”互换使用。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中非特异性细胞 毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等)识别靶细胞上结合的抗体，然后引起 靶细胞裂解。介导ADCC的此类细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的原代细 胞(NK细胞)表达Fc y RIII，而单核细胞表达Fc y RI,Fc γ RII、Fc γ RIII和/或Fc γ RIV0 造血细胞上的 FcR 表达概述于 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol.，9 :457_92 (1991)中。 为了估计分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利5，500，362或5，821，337 中描述的测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤 (NK)细胞。备选地或另外地，可以例如在动物模型例如Clynes等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95 =652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述结合抗体的Fc区域的受体，其中Fc区域包含 重链的铰链区和Ch2及Ch3结构域。例如FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是结合IgG 抗体的FcR( γ受体)，包括Fc γ RI、Fc γ RII、Fc γ RIII和Fc γ RIV亚类的受体，包括此类 受体的等位基因变体和选择性剪接形式。Fc γ RII受体包括Fc γ RIIA( “活化受体”)和 Fc y RIIB( “抑制受体”)，其两者具有主要不同在于其细胞质结构域的相似的氨基酸序列。 活化受体Fc γ RIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑 制受体Fc y RIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参 见，Daeron, Annu. Rev. Immunol.，15 :203_234 (1997))。 FcR 综述于 Ravetch 禾口 Kinet， Annu. Rev. Immunol, 9 457-92 (1991) ；Capel 等人，Immunomethods，4 :25_34 (1994)；禾口 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med.，126 330-41 (1995)中。其他 FcR，包括将来鉴定的 FcR，由本 文中的术语“FcR”包括。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母源IgG转移至胎儿 (Guyer 等人，Immunol，117 587(1976)和 Kim 等人，J. Immunol, 24 :249(1994))。免疫球蛋 白Fc片段上的主要FcR结合部位存在于ChI与CH2结构域之间的铰链区中。该铰链区与 各种白细胞上的FcRl-3相互作用并且触发此类细胞攻击靶(Wines等人，J. Immunol, 164 5313-5318(2000))。铰链区包括，但不限于，美国专利6，165,476中描述的序列。术语“能够诱导抗体依赖性细胞毒性”是指试剂例如抗体展现ADCC的能力，如通 过本领域技术人员已知的测定法测量的。这样的活性通常特征在于Fc区域与不同FcR的 结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员将认识到，抗体显示ADCC的能力可以例 如，通过其亚类(例如IgGl或IgG3)，通过导入Fc区域的突变或通过对抗体的Fc区域中的 糖模式的修饰来获得。此类修饰描述于例如美国专利申请案2007-0092521中。术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如，抗体与另一种试剂或抗 体的缀合物。术语“人源化的抗体”意指其中已将来源于另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系 的CDR序列移植至人构架序列上的抗体。可在人构架序列中进行另外的构架区修饰。术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另 一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗 体。短语“特异性结合”，如本文中所使用的，意指识别并且结合特定分子但基本上不 识别或结合相同样品中的其他分子的化合物，例如，蛋白质、核酸、抗体等。例如，抗体或肽 抑制剂(例如，与相关抗原α 5 β 1结合的抗α 5 β 1抗体)识别和结合样品中的相关配体
15但基本上不识别或结合样品中的其他分子。因此，在指定的测定条件下，指定的结合部分 (例如抗体或其抗原结合部分)优先结合特定靶分子例如α 5β1，并且不以显著的量结合 存在于测试样品中的其他成分。可使用许多种测定形式来选择特异性结合目的分子的抗 体。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore、FACS和Western印迹分析是可用于鉴 定与α 5β1特异性反应的抗体的测定。通常，特异性或选择性反应为背景信号或噪声的至 少2倍，并且更常见地是背景的10倍以上，甚至更特别地，当平衡解离常数(Kd) < 1 μ Μ，例 如彡IOOnM和另外地例如彡IOnM时，抗体被认为“特异性”结合抗原。如本文中所使用的，“特异性结合人整联蛋白α5β1”的抗体意指以1χ10_7Μ或更 小，5χ10_8Μ或更小，3Χ10_8Μ或更小，1Χ10_8Μ或更小或5χ10_9Μ或更小的Kd结合人整联蛋白 α 5β 1的抗体。术语“k。n”，如本文中所使用的，意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率 (on-rate)或缔合速率(association rate)，而术语“k。ff”，如本文中使用的，意指特定抗 体-抗原相互作用的解离速率(off-rate)或分解速率。术语“KD”，如本文中所使用的，意 指解离常数，其获自k。fjik。n的比(即k。ff/k。n)并且以摩尔浓度(M)表示。可使用本领域 内良好建立的方法测定抗体的Kd值。用于测定抗体的Kd的一个方法是使用表面等离子共 振术，通常使用生物传感器系统例如Biacore 系统。如本文中所使用的，术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原具有IxlO-7M或 更小，5xlO_8M或更小，或5xlO_9M或更小的Kd的抗体。然而，对于其他抗体同种型，“高亲力” 结合可变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10、或更小，IO-7M或更小，或 10_8M或更小的Kd的抗体.如本文中所使用的，关于抗体的术语“竞争”，是指第一抗体或其抗原结合部分与 第二抗体或其抗原结合部分竞争结合，其中与在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合 相比较，第一抗体与其关联表位的结合在第二抗体存在的情况下发生可检测的减少。其中 第二抗体对其表位的结合在第一抗体存在的情况下也可检测地减少的备选情况可以存在 但不是必须存在。即，第一抗体可抑制第二抗体对其表位的结合，而该第二抗体没有抑制第 一抗体对其各自表位的结合。然而，在各抗体可检测地抑制其他抗体与其关联表位或配体 的结合的情况下，不论达到相同、更大或更小的程度，抗体都被认为彼此之间“交叉竞争”对 它们各自表位的结合。例如，交叉竞争抗体可结合本文中公开的抗体所结合的表位或表位 的部分。竞争和交叉竞争抗体的用途包括在本公开内容中。无论此类竞争或交叉竞争籍以 发生的机制是什么(例如，位阻、构象变化或对共同表位或其部分的结合等)，本领域技术 人员基于本文中提供的教导将理解，这样的竞争和/或交叉竞争抗体包括在并且可用于本 文中公开的方法中。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。 表位决定簇(Epitopic determinant)通常由分子的化学上活跃的表面基团例如氨基酸或 糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位 的区别在于对前者(而非后者)的结合在变性溶剂存在的情况下丧失。“糖形”是指包含多种糖单位的连接的复杂低聚糖结构。此类结构描述于例如， Essentials of Glycobiology Varki 等人，eds·，ColdSpring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY(1999)(其还提供了标准糖生物学命名法的综述)中。此类糖形页
包括但不限于G2、Gl、GO、G-I和G-2(参见，例如，国际专利公开案WO 99/22764)。“糖基化模式”定义为共价连接至蛋白质的糖单位(例如，糖形)的模式以及糖形 共价连接至蛋白质(更特别地免疫球蛋白)的肽主链的位点的模式。由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗体彼此相比，可能将具有不同的糖形和 /或糖基化模式。然而，无论此类抗体的糖基化如何，由本文中提供的核酸分子编码的或包 含本文中提供的氨基酸序列的所有抗体是本公开内容的一部分。如本文中所使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括 所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、 两栖动物、爬行动物等。如本文中所使用的，“治疗”是指减少患者经历疾病症状(即，肿瘤生长和/或转 移，或由免疫细胞的数量和/或活性等介导的其他效应)的频率。该术语包括施用本公开内 容的化合物或试剂以预防或延迟疾病的症状、并发症或生物化学指标(indicia)的发作， 减轻疾病、病状或病症的症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预 防性的(以预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或减 轻疾病表现后的病状。在下列小部分更详细地描述本公开内容的各个方面。抗α 5 β 1 抗体本公开内容的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。例如，抗体特异性结 合人α 5β 1。优选，本公开内容的抗体以高亲和力例如以IxlO-7M或更小的Kd结合α 5β 1。优选，抗体以5χ10_8Μ或更小，2Χ10_8Μ或更小，5Χ10_9Μ或更小，4Χ10_9Μ或更小， 3x1 O^9M或更小或2. 7χ10_9Μ或更小的Kd结合人α 5 β 1。估计抗体对α 5 β 1的结合能力的 测定在本领域内是已知的，包括例如，ELISA、Western印迹法、RIA和流式细胞术分析。合 适的测定法详细地描述于实施例中。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)还可通过本 领域内已知的测定法例如通过Biacore分析来估计。本公开内容的抗α 5 β 1抗体还能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，可以 通过使用特定亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3)(包括可进一步增强抗体的ADCC活性水平的对 Fc结构域的突变)来获得这样的功能性。此类突变和测量ADCC的方法进一步描述于实施 例中。单克隆抗体22B5本公开内容的一个举例说明性抗体是人单克隆抗体22B5，如实施例1和2中所描 述的。22B5 氨基酸序列示于图IB中以及示于SEQID NO :7中。22B5的八氨基酸序列 示于图ID中以及示于SEQ ID N0:8中。如图IB和图2中所示，22B5的重链可变区包含回 复至人种系基因序列的两个突变。即，22B5包含一个在氨基酸残基编号30上从异亮氨酸至 丝氨酸的突变(I30S)和在氨基酸残基编号33上从天冬酰胺至丝氨酸的突变(N33S)。如本 文中所使用的，“22B5”是指其中已产生所述I30S和N33S重链可变区种系突变的抗体。鉴于22B5可结合α 5 β 1，可将Vh和\序列与其他抗α 5 β 1抗体“混合和匹配” 以产生本公开内容的另外的抗α 5β 1结合分子。可使用上述和实施例中的结合测定法(例 如，ELISA)检测此类“混合和匹配的”抗体的α 5 β 1结合。在一种情况下，当将Vh和\链 混合和匹配时，用结构上相似的Vh序列置换来自特定配对的Vh序列。同样地，在另一
17个情况下，用结构上相似的\序列置换来自特定的VH/\配对的\序列。在另一个方面，本公开内容提供了包含22B5的重链和轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3的 抗体。22B5的Vh⑶Rl的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1。22B5的Vh⑶R2的氨基酸序列示 于SEQ ID NO :2。22B5的Vh CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO :3。22B5的\ CDRl的氨 基酸序列示于SEQ ID NO :4ο 22Β5的Vl CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO :5。22Β5的Vl CDR3 的氨基酸序列示于 SEQ ID NO :6。使用 Kabat 系统(Kabat，Ε. Α.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)描绘 CDR 区。鉴于22B5结合α5β 1以及该抗原-结合特异性主要由⑶Rl、⑶R2和⑶R3区域提 供，因此可将Vh CDR1、CDR2和CDR3序列和Vl CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”(即， 可将来自不同α 5β 1抗体的⑶R混合和匹配，虽然各抗体通常将包含乂11⑶R1、⑶R2和⑶R3 以及Vl⑶R1、⑶R2和⑶R3)以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上述 和实施例中的结合测定法(例如，ELISA,Biacore分析)来检测此类“混合和匹配的”抗体 的α5β1结合。在一种情况下，当将Vh⑶R序列混合和匹配时，用结构上相似的⑶R序列 置换来自特定Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列。同样，当将Vl⑶R序列混合和匹配 时，通常用结构上相似的⑶R序列置换来自特定\序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列。对 于本领域技术人员来说显而易见的是，可通过用结构上相似的序列(其来自本文中公开的 ⑶R序列)置换一个或多个Vh和/或\⑶R区序列来产生新型Vh和\序列。因此，在另一个方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其 包含(a)含有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重链可变区⑶Rl ； (b)含有SEQ ID NO 2的 氨基酸序列的重链可变区⑶R2 ； (c)含有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ； (d)含有SEQID NO 4的氨基酸序列的轻链可变区⑶Rl ； (e)含有SEQ ID NO 5的氨基酸序 列的轻链可变区CDR2 ；和/或(f)含有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3 ；其 中抗体特异性结合α 5β 1，优选人α 5β 1。单克隆抗体2D2、24C7和1D9本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体2D2。 2D2的Vh氨基酸序列示于SEQ ID NO 39中。2D2的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 40中。本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体 24C7。24C7的￥11氨基酸序列示于SEQ ID N0:19中。24C7的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 20 中。本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体1D9。 1D9的Vh氨基酸序列示于SEQ ID NO 29中。1D9的Vl氨基酸序列示于SEQ ID NO 30中。鉴于2D2、24C7和1D9可结合α 5 β 1，因此可将此类抗体的Vh和\序列与其他抗 α 5β1抗体“混合和匹配”以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上文 和实施例中描述的结合测定法(例如，ELISA)检测此类“混合和匹配的”抗体的α5β1结 合。在一种情况下，当将Vh和\链混合和匹配时，用结构上相似的Vh序列置换来自特定Vh/ Vl配对的Vh序列。同样地，在另一个情况下，用结构上相似的\序列置换来自特定的VH/VL 配对的\序列。在另一个方面，本公开内容提供了包含2D2、24C7和1D9的重链和轻链⑶Rl、⑶R权利要求
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)以1x10 7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1；和(b)能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
2.权利要求1的抗体，其是亚类IgGl的全长人抗体。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分以5xlO_8M或 更小的Kd结合人整联蛋白α5β1。
4.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以IxlO-7M或更小的Kd结合人整联蛋白 α 5β 1，并且包含与SEQ ID NO 7中所示的氨基酸序列至少90%同一的重链可变区。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合部分，其还包含与SEQID NO :8中所示的氨基酸序 列至少90%同一的轻链可变区。
6.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)含有SEQID NO 1的重链可变区CDRl ；(b)含有SEQID NO 2的重链可变区CDR2 ；(c)含有SEQID NO 3的重链可变区CDR3 ；(d)含有SEQID NO 4的轻链可变区CDRl ；(e)含有SEQID NO 5的轻链可变区⑶R2 ；和(f)含有SEQID NO 6的轻链可变区CDR3。
7.权利要求6的抗体或抗原结合部分，其包含(a)含有SEQID NO 7的氨基酸序列的重链可变区；和(b)含有SEQID NO 8的氨基酸序列的轻链可变区。
8.权利要求1至7的任一项的抗体，其中所述抗体是人全长IgGl抗体，并且其中所述 抗体的Fc区域中至少一个氨基酸被突变，并且其中所述抗体与其中所述至少一个氨基酸 未突变的相同抗体相比，展示更大的ADCC。
9.权利要求8的抗体，其中所述至少一个突变在氨基酸位点丝氨酸247、丙氨酸338或 异亮氨酸340上发生。
10.权利要求9的抗体，其中所述至少一个突变选自丝氨酸247至天冬氨酸的突变 (S247D)、丙氨酸338至亮氨酸的突变(A338L)以及异亮氨酸340至谷氨酸的突变(I340E)。
11.权利要求10的抗体，其中所述抗体包含突变S247D、A338L和I340E。
12.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与SEQID NO :9中所示的氨基酸序列至少 90%同一的重链氨基酸序列。
13.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与SEQID NO: 10中所示的氨基酸序列至少 90%同一的轻链氨基酸序列。
14.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与SEQID NO :9中所示的氨基酸序列至少 90%同一的重链氨基酸序列以及与SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列至少90%同一的轻 链氨基酸序列。
15.组合物，其包含权利要求1至14的任一项的抗体或抗原结合部分以及可药用的载体。
16.分离的核酸分子，其编码权利要求1至14的任一项的任何抗体的重链和/或轻链， 或其抗原结合部分。
17.包含权利要求16的核酸分子的表达载体。
18.包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。
19.用于制备抗α5β 1抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在权利要求18的宿主细 胞中表达所述抗体或抗原结合部分。
20.抑制表达整联蛋白α5β1的肿瘤细胞的生长的方法，其包括将细胞与以有效抑制 肿瘤细胞生长的量存在的权利要求1至14的任一项的抗体或其抗原结合部分接触。
全文摘要
本公开内容提供了以高和亲力特异性结合整联蛋白α5β1的分离的单克隆抗体，特别地人单克隆抗体，或其抗原结合部分。还提供了编码本公开内容的抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于表达本公开内容的抗体的方法。还提供了包含抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物、双特异性分子和药物组合物。本公开内容还提供了使用本文中描述的抗α5β1抗体或其抗原结合部分治疗各种癌症的方法。
文档编号C07K16/28GK101970006SQ200980108185
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月4日 优先权日2008年2月5日
发明者B·德沃克斯, D·D·胡-洛维, D·M·棚町, G·F·卡斯佩森, G·维克曼, K·托伊, M·A·诺斯, M·山中, P·布拉姆斯, S·L·本德, T·W·斯普劳尔, 扬岚, 李刚, 王建英, 蒋欣, 陈海滨, 黄海春 申请人:百时美施贵宝公司;辉瑞大药厂