微量生物样本DNA模板的制备方法及眼部HSV感染检测试剂盒与流程

本发明涉及眼部病毒感染的分子检测技术，特别是微量标本dna提取方法及眼部hsv感染检测试剂盒。

技术背景

由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，眼部液体类样本中病毒dna含量极低，而固体样本中病毒dna难以提出，且样本内容物及其复杂，同时受限于取样量极小(其中固体标本一般不超过1mm³；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul)，很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是取自眼部的微量标本的病毒检测技术。

单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus简称hsv)，是人类最常见的病原体。hsv主要有两个血清型：hsv-1和hsv-2。hsv可引起口腔、唇、眼、脑及腰以上部位感染。

由hsv感染所导致的眼病复发率高、致盲率高，是当今最严重的感染性眼病之一。此病多由单纯疱疹i型病毒(hsv-1)感染所致，分为原发和复发两种类型。原发感染常发生于幼儿，表现为唇部疱疹、皮肤疱疹或急性滤泡性结膜炎。原发感染后病毒通常潜伏在三叉神经节或者角膜内，当机体抵抗力下降时，如发烧、疲劳、月经、局部用皮质类固醇或创伤刺激之后，病毒活化，引起多种形式的角膜炎、眼内炎，最大的特点是易反复发作。此病在发达国家的发病率为6/10⁵～20/10⁵，患病率为149/10⁵。复发性hsv-1感染通常表现为溃疡性角膜炎或基质型角膜炎，角膜基质细胞免疫反应引起的炎症常致使角膜新生血管形成、角膜水肿、角膜组织损害、角膜混浊并最终导致失明。

hsv一种高复发率和高致盲性疾病，因为其临床表现常不典型，目前做眼部病毒感染的检测，依然采用血液检测，但是大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因，易漏诊误诊。

获得眼部感染的准确检测结果，是后序采取正确治疗手段的前提；但是目前尚缺乏专门针对眼部组织病毒感染的高灵敏检测手段，也未见到以眼部微量样本为标本，采用常规pcr高灵敏度地检测病毒感染的报道。

技术实现要素：

根据上述领域的空白，临床上急需开发一种适合于眼部微量且多样标本的病毒dna提取方法和高灵敏度病毒检测试剂盒，鉴于此，本发明提供一种适合于眼部各类标本进行hsv病毒检测的方法、荧光探针检测试剂盒及dna提取方法，本发明请求保护的技术方案如下：

一种微量生物样本dna模板的制备方法，包括如下步骤：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理至少10分钟；所述微量生物样本指体积不超过10ul-200ul的液体状样本或体积不超过1mm³的固体状样本；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

样本量＞140μl情况下，重复上述步骤(3)一至二次；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，6000-9000rpm离心0.5-2min得到待测微量生物样本的dna

其中：

所述裂解缓冲液为含10％sds的tris饱和酚；

所述洗脱缓冲液1的配方为：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

所述洗脱缓冲液2为无水乙醇；

所述洗脱缓冲液3为ph8.0，含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

优选地，所述步骤如下：

(1)将待测微量生物样本放入容器中，加入20μl蛋白酶k、200μl裂解缓冲液，于56℃处理至少10分钟；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；如果样本量＞140μl，重复上述步骤(3)；

(4)加入500μl洗脱缓冲液1,8000rpm，离心1min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入500μl洗脱缓冲液2,14000rpm，离心3min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离14000rpm，离心1min,弃滤液及离心管；

(7)换新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置1min，离心8000rpm，1min得到待测微量生物样本的dna。

优选地，所述待测微量生物样本为液体状样本，步骤(1)中于56℃处理10min之后，再放入70℃环境中处理10min。

优选地，所述待测微量生物样本为固体状组织，步骤(1)中于56℃处理5-12个小时。

优选地，其特征在于，所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

本发明的另一方面，公开一种用于制备微量生物样本dna模板的试剂组合，其特征在于，包含如下试剂；

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液，

所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm³的固体类样本；

所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；

所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

本发明的再一方面，公开一种用于检测眼部微量样本hsv感染的pcr扩增试剂，其特征在于：包含以下引物探针组，序列如下：

primer-f：ccataaactgggagtagcggt

primer-r：gtggtcttcaaggagaacatc

探针：cgccccgtacaagttcaagg

所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm³的固体类样本；

所述液体样本指眼部分泌物、房水、泪液和/或玻璃体；

所述固体组织指视网膜、角膜内皮、翼状胬肉、结膜、虹膜和/或眼部肿物。

优选地，用于每个反应的pcr扩增体系含有：

所述pcr扩增试剂在使用前加入眼部微量样本dna模板及蒸馏水使反应总体积达到20个体积单位。优选地，所述体积单位可以是1微升、1.5微升、2微升或2.5微升。

本发明的再一方面，提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部hsv感染的试剂盒，其特征在于：包含

前述任一用于检测眼部微量样本hsv感染的扩增试剂，

以及前述的用于制备用于制备眼部微量样本dna模板的试剂组，

其中所述眼部微量样本指体积不超过10ul-200ul的液体样本或体积不超过1mm³的固体类样本。

优选地，还包含为每个检测反应设置对照反应的对照模版，具体如下：

阳性对照模版:hsv病毒dna片段，用于对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果

阳性对照模版:阳性眼部体液；

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

本发明还提供一种用于通过眼部微量样本检测眼部hsv感染的pcr方法，其特征在于，

采用前述任一制备方法制备眼部微量样本dna模板；

采用前述任一的pcr扩增试剂或者前述任一的试剂盒对所述眼部微量样本dna模板进行实时定量pcr检测。

优选地，所述pcr反应的程序如下：

37℃×2min

94℃×2min，上述两个温度和时间循环40次

93℃×15sec，

60℃检测荧光。

本发明一个主要的贡献在于，提出了以取自眼部的微量样本为材料提取dna制备pcr模板，并采用实时定量pcr(realtime-pcr)检测眼部病毒感染。

由于眼部结构复杂，且受血脑屏障影响，眼部组织标本的很多检测指标与血液的检测指标相关性很低，大量临床数据研究发现，血液检查不能准确反映眼部的真实病因，特别是感染性眼病的病因；另一方面，眼部标本体积微小，标本种类多种多样，包括各种组织、各种体液(玻璃体、房水、泪液等)、各种膜类(视网膜、角膜内皮等)、多部位分泌物等，其中固体标本一般不超过1mm³；除了泪液，眼部液体标本一般能取的量约为20-100ul，最多不超过200ul，很难满足血液、尿液检验所要求的大体积和均一种类的要求，因此对眼部标本采用常规血液检测方法进行检测，假阴性比例非常高，常常延误治疗。目前尚未见到适合于微量标本，特别是适合取自眼部各种形态的微量标本的病毒检测技术。

基于此，发明人摸索了适合微量组织样本的dna提取方法，从提取试剂如蛋白酶k、裂解液、洗脱缓冲液的体积、时间、温度，用量方面进行了摸，提出一种简便易于操作的提取微量组织dna的方法，该方法适合提取眼部多种临床标本的dna模版，所得模板用于本发明的pcr检测，能够高灵敏地检测出眼部微量组织中的hsv病毒感染情况。

比如10ul泪液中的dna，其足够作为4个pcr反应的模版，并且成功地通过泪液检测了解到眼部的病毒感染情况。该方法该dna提取方法，不仅仅适用于眼部多种微量标本，对于难以获得的其它生物标本，比如取自婴儿的组织样本，微小生物的组织样本，都非常适合，对患者无创或者创伤最小化。

本发明另一个主要的贡献在于，还提供一种用于检测病毒感染，特别是hsv感染的试剂盒，以及提供了检测hsv的pcr扩增试剂，引物探针组，结合上述dna提取方法，进行检测。实验数据显示，无论是当时采集的临床眼部微量样品，还是采集24-48小时以上从其它城市医院或医院送来的多种眼部微量样品，都能够稳定、灵敏地检测hsv感染情况，方法具有良好的稳定性和可靠性。

鉴于眼部样本的微量、珍贵，为了减少检测过程中由于人为操作失误、试剂污染、失效等原因引起的结果误判以及样本浪费。本发明的试剂盒优选实施例中，为每个检测反应设置了多个对照模版，其中：

阳性对照模版:试剂盒中阳性对照品，是已知病毒dna；作用是质控检测体系，试剂及设备的有效性，防止假阴性结果

阳性对照模版:阳性眼部体液；用于提示眼部标本检测体系的有效性，从而排除假阴性。

空白对照模版：超纯水；用于提示反应试剂中是否存在污染，从而同时结果是否存在提示假阳性。

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；用于显示眼部标本正常存在的噪音，并提示是否有污染导致的假阳性。

弱阳性对照模版：由于眼部标本体积微小，阳性弱，因此要做弱阳性对照，来判定检测的灵敏度。

本发明的再一个主要的贡献在于，提供一种检测微量组织样本中hsv感染的pcr方法，在pcr体系和程序上作出了调整，能够准确检测到微量样本中的hsv感染情况。

附图说明

图1.hsv病毒性角膜炎患者的眼球，

其中可见中央区混浊及水肿消退。采用本发明的方法对眼部标本进行病毒检测确诊后，对眼内局部及全身抗病毒药联合1％醋酸泼尼松龙一个月后改用0.1％艾氟治疗两个月。

图2.是图1所示眼球确诊后经治疗，中央区混浊及水肿消退，视恢复至0.8。

图3.其中一例待测样本的hsv感染pcr检测结果示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例示例性说明本发明的技术方案，但不作为对本发明专利权范围的限制。

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

对照核酸提取试剂盒：购自达安基因股份有限公司。

对照血清hsv检测试剂盒：购自达安基因股份有限公司。

实施例1.眼部微量液体待测标本dna提取方法

材料：

待测标本：采集自收治患者，泪液、房水2、玻璃体。

(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理10分钟以上；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

如果样本量＞140μl，重复步骤(3)；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna模版，最终能获得50-100μldna模版。

(8)取1ul样品，通过dna含量检测仪器nanodrop2000检测od260、od280，计算得到dna浓度为30-70ng/μl)

对照：采用核酸提取试剂盒购自上海之江生物科技有限公司。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取以及pcr扩增。

检测结果：

可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得dna纯度显著低于本发明方法所得提取物。特别是对照方法所得提取物的od280值明显高于本发明方法所得提取物的od280值。说明本发明提供的dna提取方法能够有效地将dna与其它细胞成分及蛋白分离，针对微量样本的特殊性，该步骤的改进是pcr检测方法灵敏度、特异性高的保障。

实施例2.眼部微量固体待测标本dna提取方法

材料：

待测标本：采集自收治患者，角膜内皮、翼状胬肉、结膜分泌物、眼部肿物，采集量约为1×1mm；

步骤：

(1)将采集的待测标本放入容器中，加入10-30μl蛋白酶k、100-300μl裂解缓冲液al，于56℃处理6-12小时；

(2)加入与裂解缓冲液等体积的无水乙醇，震荡混匀10-20s,瞬时离心；

(3)将步骤(2)所得的液体放于离心柱中，放入2ml收集管，6000-9000rpm离心0.5-2min；

(4)加入300-600μl洗脱缓冲液1,6000-9000rpm，0.5-2min，弃滤液及收集管，换新的收集管；

(5)加入300-600μl洗脱缓冲液2,10000-15000rpm，离心1-5min，弃滤液及收集管；

(6)换新的1.5ml液离心管，空离10000-15000rpm，离心0.5-2min,弃滤液及离心管；

(7)换一新的1.5ml离心管，加入50-100μl洗脱缓冲液3，室温放置0.5-2min，离心6000-9000rpm，0.5-2min得到待测微量生物样本的dna80μl。

(8)取1ul样品，通过dna含量检测仪器nanodrop2000检测od260、od280。

对照：采用核酸提取试剂盒购自达安基因股份有限公司。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取。

检测结果：

可以看出，采用常规试剂盒提取眼部微量样本，所得dna纯度比本发明方法所提得提取物的低。对照方法提取结膜囊分泌物，眼部肿物所得的提取物的od280值得明显高于本发明，即提取物中蛋白质或氨基酸含量较高，用作扩增模版，容易影响扩增的灵敏度。而本发明的方法对于取自眼部的各种组织微量样本，都能够获得高纯度模版。

实施例3.用于通过眼部微量样本检测眼部hsv感染的试剂盒

dna提取试剂组：

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

用于pcr扩增的特异性引物和探针

primer-f：ccataaactgggagtagcggt

primer-r：gtggtcttcaaggagaacatc

探针：cgccccgtacaagttcaagg

实施例4.用于通过眼部微量样本检测眼部hsv感染的试剂盒

1.dna提取试剂组：

裂解缓冲液：含10％sds的tris饱和酚,

洗脱缓冲液1：饱和酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；

洗脱缓冲液2：无水乙醇,

洗脱缓冲液3：ph8.0,含1mmol/ledta的10mmol/ltris-hcl溶液。

2.用于pcr扩增的特异性引物和探针：

primer-f：ccataaactgggagtagcggt；

primer-r：gtggtcttcaaggagaacatc。

探针：cgccccgtacaagttcaagg

3.pcr扩增对照模版：

阳性对照模版:已知hsv病毒dna片段(对照试剂盒自带)对检测体系和仪器的质量控制，保证结果的准确性，避免假阴性结果；

阳性对照模版:阳性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

实施例5.标本中hsv病毒的检测方法的建立

标本为临床诊断为血液中感染hsv的患者血清，共5例。

步骤1.采用实施例1中的方法制备样本dna模板：

步骤2.引物探针：

primer-f：ccataaactgggagtagcggt

primer-r：gtggtcttcaaggagaacatc

探针：cgccccgtacaagttcaagg

步骤3:反应体系配制

并设置5个对照反应管，反应体系同上，模板分别为：

阳性对照模版:已知hsv病毒dna片段(对照试剂盒自带)

阳性对照模版:阳性眼部液体样本；

弱阳性对照模版：阳性眼部体液的稀释液，其临界值设置在△t＝38-40。

空白对照模版：超纯水；

阴性对照模版：阴性眼部液体样本；

步骤4.pcr程序：

37℃2min

94℃2min

循环上述两个温度和时间,循环30-40次

93℃15sec,60℃检测荧光

对照方法：

同样的5例血清试剂：

对照提取方法：采用核酸提取试剂盒购自达安基因股份有限公b。作为对照试剂，根据其说明书操作dna提取。

对照检测方法：以医院常用的血清hsv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因股份有限公司，步骤为试剂盒内附实验步骤。

检测结果如下表：

表格中，随着血清标本量递减至10微升，本发明的方法对于液体标本的最低检测限为10ul；可见本发明的检测方法检测准确性4/5＝0.80,即80％。

对照试剂盒仅仅能检测2ml血清标本量，随着样本量递减，无法获得有意义的检测结果。

同样也进行了“对照提取方法+本发明pcr方法”：结果与“对照提取方法+对照检测方法”的结果一致，说明现有常规方法提取大量样本所得模板液可以进行有效检测，但是当样本量无法达到毫升级别时，提取所得模板液不能进行有效检测。

实施例6临床眼部标本检测验证

dna来自临床收治患者眼部标本，提取方法见实施例1.

实验方法同实施例5。

对照方法：医院常用的血清hsv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因股份有限公司，步骤为试剂盒内附的实验操作步骤。

检测结果如下：

图3示意了其中一例阳性样本的检测结果：阳性检测样本与弱阳性对照相近。

实施例7眼部病毒感染和血液中病毒感染有较大差异

样本：来自1名临床收治患者不同阶段的房水和血液

检测方法：本发明方法：dna来自临床收治患者的眼部标本和血液，提取方法见实施例1。

对照方法：采用医院常用的血清hsv检测试剂盒作为对照方法，购自达安基因股份有限公司，步骤为试剂盒内附实验步骤。

样本检测结果

第一阶段治疗前：眼部和静脉血均检出hsv阳性；

第二阶段：是根据常规治疗方法，对患者给予全身抗hsv病毒药－1％醋酸泼尼松龙一个月后改用0.1％艾氟治疗两个月之后对眼部标本和静脉血检测，结果显示经治疗后血液中hsv转阴，但是全身抗病毒治疗对眼部hsv感染无效。

第三阶段：在眼内局部给予抗病毒药物一次或几次后，对眼部标本和静脉血检测，眼部hsv感染转阴。

以上数据显示，眼部感染情况和血液感染并不同步。如果按照目前医院常用检测方法仅仅检测血液感染，根据检测结果对全身整用抗病毒药，对于眼部感染并不管用。因此，准确检出眼部感染是有效治疗的关键。

而采用常规方法和试剂盒检测眼部标本，检测不到眼部hsv感染，也就无法对其眼部进行对应的治疗。

检测后治疗

采样本发明检测方法检测呈hsv感染阳性的患者，对其给予针对hsv的个体化治疗方案，如给予感染部位局部更昔洛韦、阿昔洛韦等抗病毒药物注射，并于给药后定期采集眼部标本进行病毒检测，检测用药后病毒dna情况，根据检测结果进行用药周期、浓度的调整，直至检测结果转阴，如图1-2所示：

图1.hsv病毒性角膜炎患者的眼球，其中可见中央区混浊及水肿消退。采用本发明的方法对眼部标本进行病毒检测确诊后，对眼内局部及全身抗病毒药联合1％醋酸泼尼松龙一个月后改用0.1％艾氟治疗两个月。

图2.是图1所示眼球确诊后经治疗，中央区混浊及水肿消退，视恢复至0.8.

说明本发明的方法能够超越常规技术，准确检测眼部微量样本中的低浓度病毒感染，从而为后续治疗方案提供准确依据。

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<110>北京大学第三医院

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