七管道芯片检测肠道致病菌沙门氏菌的方法及应用与流程

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种七管道芯片检测肠道致病菌沙门氏菌的方法及应用。

背景技术：

沙门氏菌属于革兰氏阴性菌，是一种肠道致病菌，目前已发现一千种。感染沙门氏菌容易引起伤寒，感染性腹泻，肠热症，肠胃炎等疾病。世界卫生组织(who)已将沙门氏菌列为严重危害和中等危害的食源性致病菌。因此，对沙门氏菌的简单快捷的检测，能够有效抑制公共疾病的突发。

目前，常用于沙门氏菌检测的方法有，微生物培养法、免疫检测方法和聚合酶链式反应(pcr)。然而，这些方法不仅操作繁琐，受到检测人员专业和经验的限制，而且花费昂贵。等温核酸扩增不需要变温操作，因此不需要昂贵的温度循环仪，操作简单，近年来受到学术界和企业界的高度关注，各种类型的等温核酸扩增也相应的被开发。其中，重组酶聚合酶等温扩增以其反应温度低，反应速度快，灵敏度高，特异性好等特点而备受重视。微流控技术的发展，使得核酸体系能够以较少的体积去实现检测，同时也为同一指标多个样品的同时检测提供了解决方案。

技术实现要素：

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种涉及一种基于七管道芯片的肠道致病菌沙门氏菌的等温重组酶聚合酶扩增检测方法及应用。

在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“rpa”是指：重组酶聚合酶等温扩增技术((recombinasepolymeraseamplification)。

术语“fam”是指：羧基荧光素。

术语“buffer”是指：缓冲液。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种七管道芯片检测肠道致病菌沙门氏菌的的方法，所述方法采用用于检测肠道致病菌沙门氏菌的特异的重组酶聚合酶引物、探针及七管道芯片进行检测；

其中,所述重组酶聚合酶引物和探针为：

正向引物的序列为seqidno.1，

反向引物的序列为seqidno.2，

探针的序列为seqidno.3。

根据本发明第一方面的方法，其中，所述七管道芯片通过以下方法制备：

(1)芯片模板的制作：利用微加工方法制作芯片模板；

(2)芯片浇筑，排气泡，固化：将二甲基硅氧烷与固化剂按比例混合均匀，倒入芯片模板中，利用真空排除气泡，于烘箱中实现高温固化；

(3)芯片打孔与封合：利用注射器针头对芯片打孔形成进样口与出样口，经过等离子体处理后，与玻片进行永久封合。

优选地，所述步骤(2)中，所述固化剂选自以下一种或多种：二月二丁基肉桂酸锡，聚(二甲基-甲基氢硅氧烷)，优选为聚(二甲基-甲基氢硅氧烷)；所述二甲基硅氧烷与固化剂的比例为9:1～11:1,优选为10:1；所述高温固化温度为75～85℃,优选为80℃；所述高温固化时间为25～35min，优选为30min。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒采用根据第一方面所述的方法进行检测，优选地，所述试剂盒为实时等温重组酶聚合酶扩增检测试剂盒。

根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述试剂盒中所述正向引物的浓度为100～100nm，优选为300～500nm，最优选为420nm；所述反向引物的浓度为100～100nm，优选为300～500nm，最优选为420nm；所述探针的浓度为10～200nm，优选为100～150nm，最优选为120nm。

根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括细菌dna提取试剂和检测试剂；

优选地，所述检测试剂包括mgac溶液，蒸馏水，buffer，重组酶、聚合酶和单链结合蛋白的冻干酶粉末，阴性对照和阳性对照。再优选地，所述阴性对照为蒸馏水，所述阳性对照为含有沙门氏菌全基因组dna的提取液。

进一步优选地，所述mgac溶液浓度为40～140mm，最优选为140mm。

根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括便携式的荧光设备。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的检测方法或按照第二方面所述的试剂盒在制备用于检测沙门氏菌的产品中的应用。

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于七管道芯片的肠道致病菌沙门氏菌的等温重组酶聚合酶扩增检测方法，以实现对沙门氏菌的快速、安全、特异、灵敏的检测。

重组酶聚合酶等温扩增技术((recombinasepolymeraseamplification，rpa)是全球最新的等温扩增技术，被称为可以取代pcr的核酸检测技术。重组酶与引物构成的混合物用于寻找模板上的同源序列，同源序列确定后，在结合蛋白的作用下，引物结合到对应的模板上，在聚合酶的作用下，从引物3’端启动dna的扩增，在37～42℃的恒定的温度下10分钟内就可产生目的片段，在20～40分钟内可实现数十亿基因的拷贝。结合微流控芯片，可以实现单一指标的多样品的同时检测。在实时rpa体系中需要加入exo探针，通过简单的荧光读出设备，就可以实现对荧光结果的判断。但在实际应用中发现，如果没有有效的引物和探针组合，就会在检测结果中出现假阳性或者检测灵敏度低下的问题。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种用于检测肠道致病性沙门氏菌的重组酶聚合酶等温扩增的引物对和探针，其中引物对的序列如下：

正向引物：5’-taccgggcataccatccagagaaaatcgggccgc-3’(seqidno:1)

反向引物：5’-attggcgatagcctggcggtgggttttgttgt-3’(seqidno:2)

探针的序列信息如下：

5’-ctctattgtcaccgtggttcagtttatcgttattaccaaaggttca-3’

其中对第30个t上进行羧基荧光素fam标记，第34个t上进行淬灭基团bhq修饰，31～33位的tat用四氢呋喃代替，在3’端进行磷酸基团-p修饰。(seqidno:3)

本发明还提供了上述引物对和探针在检测肠道致病菌沙门氏菌试剂盒中的应用。

进一步地，上述试剂盒为实时等温聚合酶重组酶扩增检测试剂盒。

更进一步地，上述试剂盒还包括细菌dna提取试剂和检测试剂。所述检测试剂包括mgac，蒸馏水，buffer，重组酶、聚合酶和单链结合蛋白的冻干酶粉末，阴性对照和阳性对照。

再进一步地，所述阴性对照为蒸馏水，阳性对照为含有沙门氏菌全基因组dna的提取液。

根据本发明的一个实施例，配制50μl的等温重组酶聚合酶扩增反应体系，其中正向引物和反向引物的浓度为420nm，exo探针的浓度为120nm,mgac的浓度为14mm。

本发明的还提供了一种快速检测沙门氏菌的实时等温重组酶聚合酶扩增方法，该方法包括以提取的沙门氏菌全基因组dna为模板，利用上述的引物和探针进行快速扩增和荧光检测。对比阴性对照，如果荧光强度有明显增强，则证明所测样品中含有沙门氏菌的步骤。

进一步地，在上述步骤中，向50μl的反应体系中加入10μm的正向引物2.1μl，10μm的反向引物2.1μl，10μm的探针0.6μl，buffer29.5μl，蒸馏水12.2μl，混合均匀后转移到含有重组酶、聚合酶和单链聚合酶的ep管中，最后1μl的模板和2.5μl的浓度为280mm的mgac加入ep管中。

七管道芯片以高聚物为材料，通过微加工方法制备。七管道芯片包含七个有序排列的微米通道，能够实现多重信号的区分以及防止多个体系之间的交叉污染。

本发明还提供上述七管道芯片的制备方法，具体实施步骤如下：

1)芯片模板的制作：利用微加工方法制作芯片模板；

2)芯片浇筑，排气泡，固化：将二甲基硅氧烷与固化剂按比例混合均匀，倒入芯片模板中，利用真空排除气泡，于烘箱中实现高温固化；

3)芯片打孔与封合：利用注射器针头对芯片打孔形成进样口与出样口，经过等离子体处理后，与玻片进行永久封合。

使用本发明中的七管道芯片基本操作如下：

1)样品的注入：将反应体系用移液枪注射入微流控管道中；

2)恒温扩增：用透明胶带或者未固化的聚二甲基硅氧烷封住进样口和出样口，防止气溶胶污染，在烘箱中恒温39℃反应20-30min；

3)结果判断：可通过实时荧光pcr仪(realplex-4)读取ep管中的荧光结果或者荧光(共聚焦)显微镜(z760)进行芯片上荧光结果的拍摄。

本发明的检测方法可以具有但不限于以下有益效果：

1、实时rpa的重要检测试剂都是以冻干粉的形式保存，避免了冷藏运输；

2、实时rpa的反应温度低，反应时间短，一般能在20-30分钟内完成检测；

3、引物和探针耐受5～9个碱基的突变，便携式的荧光设备能够实现荧光结果的读出；

4、七管道芯片的结构模式具有无限的可扩展性，在空间上可实现任意的排列。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明正向引物、反向引物和探针的设计。

图2示出了本发明的沙门氏菌rpa引物优化结果示意图；其中，图2a中，a,b,c,d的引物浓度为1μm，其中a,b的mgac浓度为140mm，a为阴性对照；c,d的mgac浓度为280mm，c为阴性对照；e,f,g,h的引物浓度为5μm，其中e,f的mgac浓度为140mm，e为阴性对照；g,h的mgac浓度为280mm,g为阴性对照。图2b中，a’,b’,c’,d’,e’,f’的引物浓度为10μm，其中a’,b’的mgac浓度为40mm，a’为阴性对照；c’,d’的mgac浓度为70mm,c’为阴性对照；e’,f’的mgac浓度为140mm；e’为阴性对照。

图3示出了本发明的沙门氏菌rpa灵敏度优化结果示意图。

图4示出了本发明的沙门氏菌rpa特异性评价结果示意图。

图5示出了本发明的沙门氏菌实时rpa荧光结果示意图。

图6示出了本发明的七管道中沙门氏菌实时rpa的荧光示意图。

图7示出了本发明的七管道芯片。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

twistamp^tmdnaamplificationkit,购自英国twistdx公司；

细菌dna全基因组提取试剂盒、dna纯化回收试剂盒均够自天根生化科技(北京)有限公司；

低分子量的琼脂糖购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；

gelred^tm核酸染料购自美国biotium公司；

dnaladderh2购自于上海生工；

二甲基硅氧烷及其固化剂均购自于美国陶氏化学；

沙门氏菌(atcc14028)、大肠杆菌(atcc1175)和假单铜绿杆菌(atcc27853)均购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心；

其它试剂不说明均购自与西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

仪器：

nanodrop^tmnd-2000c分光光度计，购自于美国赛默飞世尔科技公司；

单光子荧光共聚焦显微镜(z760)，购自于德国蔡司公司；

实时荧光定量pcr仪，购自于德国eppendorf公司；

便携式金属浴，购自于杭州米欧；

细胞培养箱，购自于美国赛默飞世尔科技公司；

琼脂糖凝胶成像系统genosens1800，购自于上海勤翔科学仪器有限公司。

实施例1

本实施例用于说明沙门氏菌的rpa方法的特异性和灵敏性。

1.沙门氏菌引物及探针设计

根据沙门氏菌分泌性蛋白的编码基因inva基因进行引物设计，通过ncbi查找公开的的inva基因序列(nc_003198.1)。根据保守性区域，进行同源性分析后选取如图1所示片段(133bp)设计引物和探针：

正向引物：5’-taccgggcataccatccagagaaaatcgggccgc-3’(34bp)

反向引物：5’-attggcgatagcctggcggtgggttttgttgt-3’(32bp)

探针的序列信息如下：

5’-ctctattgtcaccgtggttcagtttatcgttattaccaaaggttca-3’

其中对第30个t上进行羧基荧光素fam标记，第34个t上进行淬灭基团bhq修饰，31～33位的tat用四氢呋喃代替，在3’端进行磷酸基团-p修饰。(该修饰均由上海生工生物工程股份有限公司完成。)

所有引物和探针均由上海生工合成。

2.rpa反应体系及条件

1)rpa反应体系配制

50μl的反应体系中加入的正向引物2.4μl，反向引物2.4μl，buffer29.5μl，蒸馏水12.2μl，混合均匀后转移到含有重组酶、聚合酶和单链聚合酶的ep管中，振荡离心，最后1μl的模板和2.5μl的mgac加入ep管中，盖上盖子离心，反复振荡10次，离心。放置于便携式金属浴39℃，孵育4分钟，反复振荡10次，离心后，放置于金属浴中继续孵育。

2)琼脂糖凝胶电泳读出

称量2％的琼脂糖于30ml的1×tbe缓冲液中，添加3μl的gelred^tm试剂，制备琼脂糖凝胶。将9μl的扩增产物与1μl的由溴酚蓝和甘油组成的loadingbuffer(50％(v/v)甘油,0.05％(w/v)溴酚蓝)混合，置于琼脂糖凝胶中。在110v的电压下，跑胶25分钟。利用琼脂糖凝胶成像系统genosens1800进行成像，参照dnaladderh2条带大小，读出扩增片段的大小。

3)引物浓度筛选

选取引物浓度1μm，5μm，10μm为筛选浓度，模板量为试剂盒提取的1μl的沙门氏菌的全基因组dna。

结果显示，当引物浓度为1μm，mgac的浓度为140mm，280mm时，目标基因片段无法扩增出来(图2a)。当引物浓度为5μm，mgac的浓度为140mm，280mm时，目标基因片段需要60分钟才能实现扩增(图2a)。当引物浓度为10μm，mgac的浓度为40mm，70mm，140mm时，目标片段可以在40分钟内实现扩增读出(图2b)。

4)灵敏度优化

选取引物浓度为10μm，mgac的浓度为40mm，70mm和140mm。设置不同浓度的沙门氏菌dna模板，dna浓度梯度为100pg/μl,10pg/μl,1pg/μl,100fg/μl和10fg/μl，体积为1μl。

结果显示，当引物浓度为10μm，mgac的浓度为40mm时，dna检测的灵敏度为100fg/μl(图3a)。当引物浓度为10μm，mgac的浓度为70mm时，dna的检测灵敏度为10fg/μl(图3b)。当引物浓度为10μm，mgac的浓度为140mm时，阴性对照总是会出现假阳性的结果，其原因主要是当mgac的浓度高时，引物二聚体会被当成模板被扩增出来(图4b)。

5)检测特异性

利用细菌dna提取试剂盒提取大肠杆菌，假单铜绿杆菌的dna为特异性检测的样本，通过重组酶聚合酶等温扩增进行检测，其结果如图4a。

从图4a的琼脂糖凝胶中可知，只有沙门氏菌的特异片段出现了目标条带，大肠杆菌、假单铜绿杆菌的全基因组dna和阴性对照都没有出现目标条带。

实施例2

本实施例用于说明沙门氏菌实时rpa反应体系灵敏性。

根据twistamptmdnaamplificationkit的说明书，50μl的反应体系中加入10μm的正向引物2.1μl，10μm的反向引物2.1μl，10μm的探针0.6μl，buffer29.5μl，蒸馏水12.2μl，混合均匀后转移到含有重组酶、聚合酶和单链聚合酶的ep管中，最后1μl的模板和2.5μl的浓度为280mm的mgac加入ep管中，盖上盖子离心，反复振荡10次，离心。放置于实时荧光pcr仪中进行39℃等温扩增，孵育30分钟。

设置沙门氏菌的模板梯度为100pg/μl,10pg/μl,1pg/μl,100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl和0.1fg/μl。阴性对照选取二次无菌蒸馏水。

从图5中可知，当模板浓度为0.1fg/μl时，出现了明显的实时荧光扩增曲线，同样其它浓度的模板也出现了实时荧光扩增曲线，而阴性对照的曲线则相对比较平稳，因此沙门氏菌的实时rpa反应体系的检测灵敏度为0.1fg/μl。

实施例3

本实施例用于说明七管道中的沙门氏菌的rpa检测。

七管道的芯片中微通道的具体尺寸为(宽:500μm，高:500μm，长：2cm)。

实时rpa体系，50μl的反应体系中加入10μm的正向引物2.1μl，10μm的反向引物2.1μl，10μm的探针0.6μl，buffer29.5μl，蒸馏水12.2μl，混合均匀后转移到含有重组酶、聚合酶和单链聚合酶的ep管中，最后1μl的模板和2.5μl的浓度为280mm的mgac加入ep管中，盖上盖子离心，反复振荡10次，离心。

设置沙门氏菌的模板梯度为,10pg/μl,1pg/μl,100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl和0.1fg/μl。阴性对照选取二次无菌蒸馏水。

将上述体系，通过移液枪移取5μl注入微通道，利用透明胶带或者未固化的聚二甲基硅氧烷封住进样口和出样口，防止气溶胶污染，在烘箱中恒温39℃反应30min。取出七管道芯片置于荧光共聚焦显微镜上，进行荧光照片拍摄。

如图6所示，七管道中沙门氏菌的检测灵敏度为0.1fg/μl。本专利虽未进行单一指标的多样本检测，但七管道芯片的设计为多样本检测提供了技术可能。

实施例4

本实施例用于说明本发明七管道芯片的制备方法。

1)芯片模板的制作：利用微加工方法制作芯片模板；

2)芯片浇筑，排气泡，固化：将二甲基硅氧烷与固化剂聚(二甲基-甲基氢硅氧烷)和催化剂pt金属的混合液按比例10：1混合均匀，倒入芯片模板中，利用真空排除气泡，于80℃烘箱中高温固化25min；

3)芯片打孔与封合：利用注射器针头对芯片打孔形成进样口与出样口，经过等离子体处理后，与玻片进行永久封合。(如图7)

使用本发明中的七管道芯片基本操作如下：

1)样品的注入：将反应体系用移液枪注射入微流控管道中；

2)恒温扩增：用透明胶带或者未固化的聚二甲基硅氧烷封住进样口和出样口，防止气溶胶污染，在烘箱中恒温39℃反应20-30min；

3)结果判断：可通过实时荧光pcr仪(realplex-4)读取ep管中的荧光结果或者荧光(共聚焦)显微镜(z760)进行芯片上荧光结果的拍摄。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

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<110>国家纳米科学中心

<120>七管道芯片检测肠道致病菌沙门氏菌的方法及应用

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