基于重组酶扩增和G-四连体的层出镰刀菌目视检测方法与流程

本发明属于光学生物传感技术领域，具体涉及一种基于重组酶扩增和g-四连体的层出镰刀菌目视检测方法。

背景技术：

由层出镰刀菌导致的植物腐烂病是危害较为严重的维管束病害。该病寄主十分广泛，能侵染番茄、茄子、青椒、白瓜、甜瓜、草诗、秋葵、白菜、萝卜、蜂斗菜、土当归、刺老芽、黄豆、菊、蔷薇、油菜等。

传统的病害检测方法有聚合酶链式反应和血清学方法。这两种技术已成为诸多生物学、医学实验室、检测机构和生物医药公司的常规实验方法。但它们需要核酸扩增仪，酶标仪等作为辅助工具，因此反应始终受到电力、成本、时间以及空间等因素的制约，从而限制了该技术在实验室之外的应用。

目前常用的等温扩增dna的成熟方法有环介导基因恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)和重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)。lamp扩增方法的特点是需使用4～6个引物，在特定dna聚合酶作用下，65℃的恒温条件下进行dna扩增反应。其缺点之一是其引物较复杂，必须用特殊的软件设计。其二，lamp方法得到的扩增产物是一系列大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

重组酶聚合扩增法(rpa)系统能在较低温度下就能实现dna扩增，并可在15～30min内完成反应。所以rpa扩增技术就不需要使用核酸扩增仪，因而也不受样品槽孔多少和空间的限制，从而实现实时高通量检测。另外，rpa能够以未纯化模板进行扩增，这在现场检测中具有很大的优势。

对于重组酶检测病原体比如动物病毒、疟原虫、支原体、植物真菌、植物病毒，检验人体的，检验食物的牛奶的等等，都有很多报道，但多数方法是重组酶扩增后通过侧流检测。这种检测方法虽然简单快速，但是不能精确定量。制备侧流试纸需要花费财力物力，并且试纸是一次性的，不适合大规模检测。据报道，重组酶扩增可放入手掌并握拳，通过体温加热，反应完成后加入sybrgreenⅰ，以紫外手电检测。这种方法简单方便，但是每次只能检测两三个样品，且sybrgreenⅰ没有特异性，能够和任意双链dna结合，因此会受到引物二聚体及其他非特异性扩增的影响。

目视检测方法因其操作简单且直观越来越受到重视。金胶法是一种常用的目视检测方法。但是一定直径的纳米金胶并不容易制备。在检测中金胶容易受到基因组dna和蛋白的作用而发生聚集，从而影响结果。作为替代方法，基于g-四连体的比色法已经用来检测多种核酸、蛋白等。在hemin存在下，g-四连体dnazyme能够催化h2o2与abts(2,2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸))的反应，生成的产物具有特征的绿色并在λ＝422nm处有特征吸收。g-四连体能够重新组装成具有催化活性的g-四连体dnazyme。

因此，针对层出镰刀菌建立一种检测成本低、检测精确度高的检测方法很有必要。

技术实现要素：

针对以上存在的技术问题，本发明提供一种基于重组酶扩增和g-四连体dnazyme的层出镰刀菌目视检测方法，以不对称rpa获得ssdna，在nh4⁺和hemin存在下获得g-四连体dnazyme，加入abts和h2o2，观察到实验结果。

本发明的技术方案为：一种基于重组酶扩增和g-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，包括以下步骤：

(1)以naoh溶液裂解待测样品细胞壁结构，得到待测样品的基因组dna粗体液；

(2)根据目的基因设计用于进行rpa反应的特异性引物1和引物2；

(3)构建包括步骤(1)中提取分离的所述基因组dna，步骤(2)中所述引物1和引物2的rpa扩增反应体系，进行不对称rpa反应，反应得到带有g-四连体序列的单链dna和双链dna扩增产物；

(4)加入hemin、nh4⁺进行孵育，单链dna3′-末端折叠成具有g-四连体结构的dnazyme；

(5)最后向含有所述具有g-四连体结构的dnazyme的溶液中加入一定浓度的abts和h2o2，直接观察颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性。

进一步地，所述基因组dna的提取分离方法为：将所述待测样品加入0.5mnaoh、10mmedta和10倍体积比的缓冲液进行研磨，再利用10mmtris-cl、ph8.0的缓冲液稀释10倍，所得到的上清液为基因组dna粗提液。

进一步地，所述引物1的基因序列如seqidno.1所示5′-cccaatcccaatcccaatccctcgattcgagggccggccaccagaggatgtg-3′,引物2的基因序列如seqidno.2所示，5′-caacacgaatcgcttcctgacgaagacagaag-3′。

进一步地，步骤(3)中所述rpa扩增反应体系包括：1μl基因组dna，25μl2x反应缓冲液，9μldntp(10mm)，5μl10x碱性e-mix，2.4μl引物1(10μm)，2.4μl引物2(10μm)，2.5μl20x核心反应mix，2.5μl醋酸镁(280mm)，46.5μl水。

更进一步地，所述rpa扩增反应体系的反应条件为：反应温度的温度梯度为42℃-34℃或37℃-34℃，反应时间为5-30min，然后加热至85℃保持5min。

更进一步地，所述rpa扩增反应体系的反应时间优选为20min。

进一步地，所述g-四连体结构的dnazyme的反应条件为：加入终浓度为0.6μm的hemin和含有nh4⁺的缓冲溶液，所述含有nh4⁺的缓冲溶液内包括50mmtris-hcl,150mmnh4cl，ph7.9，孵育时间为60min。

进一步地，步骤(6)中所述abts的终浓度为2mm，所述h2o2的终浓度为2mm。

本发明的工作原理为：提取待测样品的基因组dna，以引物1、引物2为模板，通过不对称rpa扩增目标序列，rpa扩增产物为双链dna(dsdna)和单链dna(ssdna)的混合物，单链dna(ssdna)的3-端带有g-四联体，在nh4⁺和hemin的存在下共同孵育，单链dna3′-末端折叠成具有g-四连体结构的dnazyme，并且该g-四连体结构中的过氧化物酶模拟dna酶被激活，当添加abts^2-和h2o2时，得到的溶液变成绿色。对于不带有层出镰刀菌的基因组dna，不对称rpa没有扩增对象，也不能获得dsdna或ssdna，进而也不会有颜色变化。

本发明的有益效果为：

(1)利用rpa的不对称反应，获得了含g-四连体序列的ssdna。如果无目标dna，则无法进行rpa扩增获得ssdna，没有g-四连体的存在则无颜色变化。引物对目标序列的特异性强，保证了生物传感器的灵敏度和选择性。

(2)非常简单、快速和廉价。rpa反应完成后，加入nh4⁺、hemin、abts^2-和h2o2，ssdna中的g-四连体dnazyme被激活，反应溶液变绿色。此外，该方法中只使用了两个寡核苷酸，它们都是无标记的。

(3)rpa反应可在泡沫盒子里加入热水进行反应，不需要使用加热仪器，说明了该方法在现场试验中具有可行性。

附图说明

图1是本发明的反应原理流程图；

图2是本发明实施例2中紫外-可见吸收法和目视检查法的对比结果；

图3是本发明实施例3中不同温度吸光度的对比结果图；

图4是本发明实施例4中不同rpa反应时间对色度信号的影响结果图；

图5是本发明不同阳离子对吸光度的影响结果对比图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

一种基于重组酶扩增和g-四连体的层出镰刀菌目视检测方法，包括以下步骤：

(1)取感染层出镰刀菌的番茄叶作为待测样品，加入0.5mnaoh、10mmedta，研磨2min后将浆料转移至试管，以10mmtris-cl、1mmedtaph8.0的缓冲液稀释10倍，得到粗提液。以该液体含有的层出镰刀菌基因组dna为rpa反应模板。

(2)根据目的基因设计用于进行rpa反应且长度不同的特异性引物1和引物2；引物1的基因序列如seqidno.1(5′-cccaatcccaatcccaatccctcgattcgagggccggccaccagaggatgtg-3′)所示，引物2的基因序列如seqidno.2(5′-caacacgaatcgcttcctgacgaagacagaag-3′)所示。

(3)构建包括步骤(1)中获得的1μl基因组dna，步骤(2)中所述2.4μl引物1，2.4μl引物2，25μl2×buffer，9μldntp(10mm)，5μl10×e-mixbuffer，2.5μl20×buffer，2.5μl醋酸镁(280mm)，46.5μl水的rpa扩增反应体系。在37℃下开始反应，温度梯度为37-34℃，20min，然后放入85℃热水中孵育5min，灭活蛋白，得到含有单链和双链dna的混合物。

(4)加入终浓度为0.6μm的hemin和含有nh4⁺的缓冲溶液，所述含有nh4⁺的缓冲溶液内包括50mmtris-hcl,150mmnh4cl，ph7.9，孵育时间为60min，单链dna3′-末端折叠成具有g-四连体结构的dnazyme。

(5)最后向含有所述具有hemin/g-四连体结构的dnazyme的溶液中加入终浓度为2mm的abts和终浓度为2mmh2o2，直接观察颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性。

本实施例的工作原理为：提取待测样品的基因组dna，以引物1、引物2为模板，通过不对称rpa扩增目标序列，rpa扩增产物为双链dna和单链dna的混合物，单链dna的3-端带有g-四连体序列，在nh4⁺和hemin的存在下孵育1小时，单链dna3′-末端折叠成具有模拟过氧化物酶活性的g-四连体结构。当加入abts^2-和h2o2时，得到的溶液变成绿色。对于不带有层出镰刀菌的基因组dna，不会发生不对称rpa，也不能获得带有g-四连体序列的ssdna，进而也不会有颜色变化。

实施例2：

为验证不对称rpa-g-四连体法的可行性，采用紫外-可见吸收法(390～490nm)和目视检查法进行分析。样品a中加入hemin、h2o2和abts^2-，b不含有靶基因，c含有靶基因的策略。结果如图2所示，在a和b中都没有在420nm附近检测到光吸收信号；只有c的吸光度明显增加。并且在试管c中也出现了明显的绿色(插入图2的右上角)，其结果与紫外-可见吸收的结果一致。说明本发明的生物传感系统是可行的。

实施例3：

为了优化rpa的反应温度，进行了如下对比实验：

实验组a：rpa反应条件为当水温度为42℃时，不对称rpa反应开始，20min内反应结束于34℃；

实验组b：rpa反应条件为当水温度为37℃时，不对称rpa反应开始，20min内反应结束于34℃；

实验组c：rpa反应条件为恒定温度42℃，并保温20min至反应结束；

实验组d：rpa反应条件为恒定温度37℃，并保温20min至反应结束；

实验组e：rpa反应条件为恒定温度34℃，并保温20min至反应结束；

实验组f：作为空白对照组。

由图3可以看出，42℃-34℃梯度和37℃-34℃梯度的吸光度与42℃、37℃和34℃的恒温吸光度相近。表明rpa反应不需恒温即可在水中进行，即反应条件更加宽松温和。

实施例4：

为了测试rpa反应时间对吸光度的影响，以实施例1的条件进行测试，选取5min、10min、15min、20min、25min、30min反应时间进行测试，结果如图4所示，吸光度在5～30min内随反应时间增加而增加，当反应时间大于20min时，吸光度增度减慢，因此设定最佳反应时间应为20min。

实施例5：

为了提高检测的便捷性，在h2o2和abts²-的氧化还原反应中，对k⁺和nh4⁺进行了测定。其中，试验1和试验2在含有k⁺的缓冲液a中进行，试验3和试验4在含有nh4⁺的缓冲液b中进行。试验1和3是该方法的空白对照。结果如图5所示，含nh4⁺的溶液的吸光度明显高于k⁺，表明nh4⁺对整个检测更加有利。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>临沂大学

<120>基于重组酶扩增和g-四连体的层出镰刀菌目视检测方法

<130>无

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)..(52)

<223>引物1的基因序列

<400>1

cccaatcccaatcccaatccctcgattcgagggccggccaccagaggatgtg52

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>引物2的基因序列

<400>2

caacacgaatcgcttcctgacgaagacagaag32