本发明涉及脆性X综合征基因检测
技术领域：
，尤其是一种用于脆性X综合征致病基因检测的校准品及其应用。
背景技术：
：脆性X综合征是仅次于先天愚型的最常见的遗传性智力障碍类型，发病率为1/2500～1/5000，在我国智力低下患者中发病率约为6.3％。该病发病存在明显的性别差异，男性发病率较高，据统计，男性发病率为1:4000，女性发病率为1:8000～1:6000。其主要特征为中度至重度智力低下，且随着年龄增加病情有加重的趋势，其他临床表现为特殊面容，如长脸或招风耳，青春期以后出现大睾丸，许多患者还表现为冲动、多动、焦虑、恐惧社交、语言呆板等孤独症行为。FXS严重危害儿童生长发育，早发现、早治疗、早干预能显著改善患儿预后，且可为家系遗传提供产前遗传咨询，避免家族中再次出现同样的患者，对家庭幸福美满、社会人口素质提高有重大意义，具有不可估量的社会效益和经济效益。脆性X综合征是X染色体DNA过度甲基化或完全改变所致的X连锁不完全显性遗传病。FXS的致病基因为脆性X智力低下1号基因(FMR1)，绝大部分FXS是由于FMR1的(CGG)n重复序列过度扩展导致基因甲基化而造成的，只有极少数病例是由FMR1基因点突变或者是完全缺失而造成。正常人的CGG重复数为6～44，最常见的是29次和30次，重复数为55～200的成为“前突变”，重复数超过200的为“全突变”，而重复数为45～54的为“灰色区域”，介于“前突变”和“正常”之间，没有临床表现。现有的脆性X综合征检测方法采用PCR、MLPA、SouthernBlot等技术。但这些还具有一定的缺陷，如操作难度高、检测耗时长、成本高等。除此之外，对FMR1基因CGG重复数的分辨度仍然不够。基于PCR技术扩增的FMR1基因目的片段，毛细管电泳检测扩增片段比传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率更高，能够分辨3～8bp以上的不同长度PCR片段，但不同批次运行也会带来一定的误差。技术实现要素：基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于脆性X综合征致病基因检测的校准品，采用该标准品能避免现有技术中脆性X综合征致病基因检测的低分辨度问题，使脆性X综合征的检测方法更为完善和准确。为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本发明提供了一种用于脆性X综合征致病基因检测的校准品，所述校准品中含有至少6个CGG序列重复数不同的FMR1基因片段。优选地，所述校准品中含有6个CGG序列重复数不同的FMR1基因片段。优选地，所述6个不同的FMR1基因片段的CGG序列重复数分别为23、31、46、53、77、117，由此，所述6个CGG序列重复数覆盖了FMR1基因中正常型(CGG序列重复数6～54)以及CGG序列重复数≤117的前突变型(55～200)，同时校准品还可以检测出FMR1基因的CGG序列重复数117～200前突变型和>200的全突变型(CGG序列重复数>200)。优选地，所述重复数23的FMR1基因片段长度为297.80～298.99bp，重复数31的FMR1基因片段长度为321.73～322.91bp，重复数46的FMR1基因片段长度为365.23～366.37bp，重复数53的FMR1基因片段长度为388.42～389.61bp，重复数77的FMR1基因片段长度为458.33～461.86bp，重复数117的FMR1基因片段长度为574.36～575.52bp。优选地，根据所述校准品建立标准曲线，所述标准曲线的相关系数R2为0.9997～0.9999；应当说明的是，R2的值越接近1说明标准曲线的参考价值越高。优选地，所述校准品由4种FMR1基因片段的CGG序列重复数不同的脆性X综合征细胞系的基因组DNA等量(即质量)混合而成，其中，所述细胞系分别为细胞系GM06905(其中CGG的重复数为23和77)、细胞系GM20232(其中CGG的重复数为46)、细胞系GM20233(其中CGG的重复数为117)、细胞系GM20236(其中CGG的重复数为31和53)。在第二个方面，本发明提供了上述的校准品在制备脆性X综合征FMR1基因CGG重复数的检测试剂盒中的应用。优选地，检测时的PCR扩增反应体系及条件如下：1)反应体系：10μL的2×GCBufferⅠ，0.4μL的dNTPs(10mmol/L)，5.2μL的PCR增强剂，10μmol/L的上下游引物各0.3μL，DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，模板量为80ng，最后用ddH2O补足至20μL；2)反应条件：98℃预变性10min后，进行33个循环：97℃变性35s，62℃退火35s，68℃延伸4min，然后68℃终延伸10min。在第三个方面，本发明提供了一种脆性X综合征FMR1基因CGG重复数的检测试剂盒，所述试剂盒中含有上述的校准品。应当说明的是，所述试剂盒中还可以含有用于扩增所述校准品的上游引物(如SEQIDNO.1所示)和下游引物(如SEQIDNO.2所示)，以及PCR增强剂(其中含有甜菜碱和DMSO)。综上所述，本发明的有益效果为：采用本发明的脆性X综合征致病基因检测校准品，应用荧光PCR-毛细管电泳法对FMR1基因CGG重复数进行检测，利用校准品及检测的结果构建标准曲线，从而计算出同批次检测样本的CGG重复数，该方法显著提高了脆性X综合征致病基因检测的分辨度，使脆性X综合征的检测方法更为完善和准确。附图说明图1为校准品GeneMapper软件分析峰图；图2为校准品的标准曲线图；图3为样本1GeneMapper软件分析峰图；图4为样本2GeneMapper软件分析峰图；图5为样本3GeneMapper软件分析峰图；图6为样本4GeneMapper软件分析峰图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1脆性X综合征致病FMR1基因检测校准品的制备1、原料从CoriellInstituteforMedicalResearch购买4种脆性X综合征细胞系(GM06905重复数23/77、GM20232重复数46、GM20233重复数117、GM20236重复数31/53)作为脆性X综合征基因检测校准品制备的原料。对上述细胞系按照说明书进行培养。2、基因组DNA提取对培养后的细胞采用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取，使用Qubit3.0测定DNA的浓度。3、校准品的制备根据步骤2测得的浓度，每种细胞系的基因组DNA各取10μg进行混合，得到所需的校准品。实施例2脆性X综合征基因检测校准品的检测1、使用实施例1制得的校准品，按照以下体系和条件进行PCR反应：PCR反应体系：在200μL的薄壁PCR管中配制20μL的PCR反应体系，PCR扩增体系如下：其中，涉及的引物如下表1所示：表1引物序列上游引物F序列FAM-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA(SEQIDNO.1)下游引物R序列AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC(SEQIDNO.2)PCR增强剂的组成：甜菜碱(5mol/L)4μL、DMSO1.2μL。PCR反应程序：先98℃预变性10min后，进行33个循环：97℃变性35s，62℃退火35s，68℃延伸4min，然后68℃终延伸10min。2、毛细管电泳检测PCR扩增产物反应结束后，采用ABI3500Dx毛细管基因分析仪进行检测。取1μLPCR扩增产物，加8.5μLHi-DiTMFormamide和0.5μLGeneScan1200sizestandard，混匀后98℃变性5min，立即放冰上2min，上机检测。3、校准品检测结果分析使用GeneMapper软件对检测结果进行分析。如图1所示，从结果可以看出，6个目的片段分别为298.59bp，322.47bp，365.88bp，389.12bp，459.02bp，574.94bp。根据已知标准品的重复数和检测结果建立标准曲线，如图2所示，公式为y＝0.3398x－78.662，其中y代表重复数，x代表检测得到的片段长度(bp)，相关系数R2＝0.9999。实施例3校准品在检测脆性X综合征相关基因FMR1中的应用1、样本收集：收集已知脆性X综合征患者外周血样本4例，采用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取。2、按照实施例2的检测方法对校准品和4例样本进行检测，标准曲线公式y＝0.3396x－78.742(R2＝0.9999)，检测峰图如图3～6所示，结果如下表2所示，型别与原有型别相符。表2样本的CGG重复数实施例4校准品应用的稳定性检测1、对以上实施例3的4例样本按照实施例2的方法进行10次重复检测，每次检测同时检测校准品，检测结果如下表3所示。4个样本检测10次的CGG重复数误差均不超过1，检测结果稳定。表3多次检测4个样本的CGG重复数实施例5校准品的稳定性评估对实施例4检测的校准品中6个不同CGG重复数FMR1基因片段的长度进行分析，结果如下表4所示，重复数23的基因片段长度为297.80～298.99bp，重复数31的基因片段长度为321.73～322.91bp，重复数46的基因片段长度为365.23～366.37bp，重复数53的基因片段长度为388.42～389.61bp，重复数77的基因片段长度为458.33～461.86bp，重复数117的基因片段长度为574.36～575.52bp，每个片段不同次数得到的片段差异在1～3bp之间，较稳定。表4校准品中FMR1基因片段的长度综上所述，利用本发明的校准品能够稳定地检出样本的脆性X综合征相关基因FMR1的CGG重复数。该校准品包含6个不同CGG重复数的片段，经荧光PCR-毛细管电泳检测得到6个不同的片段长度，以片段长度为横坐标，以重复数为纵坐标构建标准曲线，就可以得到同批次不同检测样本的CGG重复数，显著提高了脆性X综合征相关致病基因检测的分辨度，使脆性X综合征的检测方法更为完善和准确。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页1 2 3