谷子酶活性的测定方法与流程

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种谷子酶活性的测定方法。

背景技术

测定稻谷酶活性的方法很多，如在开花后的多个时间段内分别采取稻穗样品，然后液氮冷冻和低温保存；或者在稻穗中上部采取籽粒同样液氮冷冻和低温保存，然后再进行酶活性测定。在上述测量酶活性方法中，均需要将玉米、水稻等作物外壳麸皮剥掉，在剥离过程中，速冻样品会融化，对酶活性会造成影响，最终会导致测量误差。而且，在水稻和玉米等禾本科作物测定酶活性时主要参照nakamura(1989)等方法，此方法操作难度大，受外界影响因素过多，测定结果误差较大。

对于上述影响测定结果的各种问题，还未有相对详细可行且科学的解决方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种谷子酶活性的测定方法，主要解决测定方法不准确的问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种谷子酶活性的测定方法，包括如下步骤：

将谷子开花期第12天设为取样第1天，依次在取样第3天、第5天、第10天、第15天、第20天、第25天及第30天分别采集幼穗作为待测样品；

利用液氮研磨所述待测样品，称取预设重量的待测样品，利用试剂盒提纯待测酶；

利用紫外分光光度计测定所述待测酶的酶活性，得到所述谷子的酶活性数据。

作为优选，所述酶为颗粒型淀粉合成酶、淀粉分支酶及可溶性淀粉合成酶。

作为优选，所述采集幼穗具体方式为：利用剪刀剪取谷穗的穗中部穗码作为待测样品，先将所述待测样品置于液氮罐中保存2小时后再转入-80℃冰箱中保存。

作为优选，所述谷子为粳性品种赤谷4号和糯性品种公谷68号。

作为优选，所述待测样品的预设重量为0.1g。

作为优选，所述试剂盒为苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒sss-2a-y、gbss-2a-y或sbe-2-y。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对谷子取样时间进行了优化：将谷子花期第12天左右作为取样的第1天，取样时间点为12d、15d、18d、22d、27d、32d、37d、42d，取样时间点分别不均匀，前期取样密集，更有利于观测酶的动态变化；本发明对谷子样本的预处理方式进行了优化：调整了样品质量，用量只需0.1g，带壳研磨称量，保证了样品酶活性，样品不会因为吸湿对质量产生影响；本发明挑选了苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒进行酶纯化，该试剂盒对实验条件要求较低，操作简单，反应灵敏且准确度高；本发明通过对测量方法中各步骤进行优化后，获得的各酶活性数据准确，为作物生长提供了可靠的理论依据。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的颗粒结合型淀粉合成酶(gbssⅰ)活性动态变化图；

图2是本发明实施例1提供的可溶性淀粉合成酶(sss)活性动态变化图；

图3是本发明实施例1提供的淀粉分支酶(sbe)活性动态变化图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例

以粳性品种赤谷4号(编号1.1)和糯性品种公谷68(编号2.1)为材料，在谷子开花期第12d开始取样，取样时间点依次设定为第1d、第3d、第5d、第10d、第15d、第20d、第25d、第30d；每个小区选取2株生育期大致相同的植株，挂牌编号。每次取幼穗样品3个冻存管，其中2个管做酶活性测试，另外1管液氮冻存，用于转录组测序；取样前冻存管按取样时间严格编号备用；

取样时用剪刀小心剪取穗中部穗码5个(防止谷穗断落，影响植株正常生长)，放入相应编号的冻存管内，迅速移入液氮罐2小时后转入-80℃冰箱中保存，防止离体穗码样品的酶活性迅速降解，造成试验误差；

利用紫外分光光度计，分别测定灌浆期不同时间点颗粒结合型淀粉合成酶(gbssⅰ)、可溶性淀粉合成酶(sss)和淀粉分支酶(sbe)的活性；将冻存管中的试验样品取出，利用液氮研磨样品，快速准确称量w＝0.1g，按照试剂盒中的操作说明，使用相应试剂盒的提取试剂，对样品中相应的酶进行提纯，冰浴保存；

(1)颗粒型淀粉合成酶(gbssⅰ)活性测定：在340nm波长下读出第一个数据值a1，两分钟后记录第二个数据值a2，△a＝a2-a1，经过计算：gbss活性＝522x△a÷w，每g组织每分钟催化产生1mol的nadph(还原型辅酶ii，学名还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)定义为一个酶活单位；

(2)淀粉分支酶(sbe)活性测定：在660nm波长下测定记录a对照管和a测定管的数据，经过计算，sbe的酶活＝，以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每g组织在反应体系中每降低1％的碘蓝值为一个酶活单位；

(3)可溶性淀粉合成酶(sss)活性测定：在340nm波长下读出第一个数据值a1，两分钟后记录第二个数据值a2，△a＝a2-a1，经过计算：sss活性＝522x△a÷w，每g组织每分钟催化产生1mol的nadph定义为一个酶活单位；

结果分析：

颗粒结合型淀粉合成酶(gbss)活性的动态变化如图1所示：

(1)赤谷4号(编号1.1)和公谷68(编号2.1)在第1天(开花期约第12天)gbssⅰ活性最低，约分别为210和310个酶活单位；

(2)赤谷4号和公谷68在第5天(开花期约第17天)左右gbssⅰ活性最高(见图1)，但粳性品种赤谷4号高于糯性品种公谷68，约分别为660和570酶活单位；

(3)第5天到第30天两个品种gbssⅰ活性均呈现下降趋势；

(4)公谷68在第25天(开花期约第37天)gbssⅰ活性出现第二个峰值，且与第5、第10天大约相同为570个酶活单位；

(5)公谷68在第30和第1天gbssⅰ活性最低，均为310个酶活单位。

可溶性淀粉合成酶(sss)活性的动态变化如图2所示：

(1)赤谷4号和公谷68从测定开始的第1天到第10天，可溶性淀粉合成酶(sss)活性逐渐增大，两个品种均在第10天达到最高为700个酶活单位；第10以后逐渐下降，直到第30天最低(见图2)；

(2)从第1到第18天左右公谷68的sss活性高于赤谷4号，此后一直到第30天却低于赤谷4号；说明该酶在灌浆前期和中期对支链淀粉合成的作用较大，表现出糯谷子活性高；

(3)赤谷4号第1天和公谷68第25天、30天的sss活性最低，均为250个酶活单位。

淀粉分支酶(seb)活性的动态变化如图3所示：

(1)赤谷4号和公谷68的淀粉分支酶(sbe)均在3天左右达到最高值(见图3)，但公谷68大于赤谷4号，分别为720和690个酶活单位；

(2)第3天到第20天赤谷4号和公谷68淀粉分支酶(sbe)活性一直处于较高水平，且第20天赤谷4号大于公谷68，别约为690和600个酶活单位；

(3)第20天到30天sbe酶活性开始明显降低，第30天赤谷4号sbe酶活性最低为350个酶活单位，与第1天公谷68相等。

本发明实施例根据谷子的特性，对取样时间进行了优化：谷子花期第12天左右作为取样的第1天，取样时间点为12d、15d、18d、22d、27d、32d、37d、42d。每个小区选取2株生育期大致相同的植株，挂牌编号。本发明的取样时间点分布不均匀，前期取样密集，更有助于观测酶的动态变化。

本发明人发现现有技术在测量酶活性时需要剥掉外壳麸皮，在剥离过程中，速冻样品会融化，对酶的活性造成影响；本发明实施例在前期预实验的时候充分考虑到这一点，做了多次试验，适当调整了样品的质量，用量为0.1g，带壳在超净工作台下进行低温研磨、称量，保证样品酶活性，样品不会因为吸湿对质量产生影响。

本发明人发现现有技术的水稻和玉米等禾本科作物测定酶活性主要参照nakamura(1989)等方法，此方法操作难度大，受外界影响因素过多；因此，本发明选用了苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，对实验条件的要求大幅降低，操作简单，反应灵敏，准确度高。

通过本发明的上述测定方法并结合附图可知：采用本发明方法测定粳谷与糯谷的颗粒结合型淀粉合成酶(gbssⅰ)活性在取样的第五天达到最大值，粳谷高于糯谷；可溶性淀粉合成酶(sss)活性的动态变化从测定开始的第12天到第22天，活性逐渐增大，两个品种均在第22天达到最高，第22以后逐渐下降；淀粉分支酶(seb)活性的动态变化粳谷和糯谷的淀粉分支酶(sbe)均在15天左右达到最高值，糯谷高于粳谷，从第15天到32天sbe一直处于较高水平，32天以后开始下降。

将本发明测定结果与现有已知测定结果进行对比：《麦类作物学报》2008,28(5):792-798公开了“面条品质不同的小麦品种籽粒淀粉特性及淀粉合成的差异”花后,小麦淀粉合成相关酶活性迅速升高,大约20-25d达到高峰,然后迅速下降,与直链淀粉积累速率一致；gbssⅰ酶活性到达高峰的时间稍晚,在花后25d左右；sss和sbe活性在花后20-25d达到顶点；4种淀粉合成酶中,只有gbssⅰ在品种间差异较大。

《玉米学报》中公开了“高直链淀粉玉米和普通玉米子粒发育过程中与淀粉合成相关酶活性的比较”两种类型子粒的sbe活性均随着子粒的发育而逐渐减弱,高直链淀粉玉米的sbe活性始终低于普通玉米,高直链淀粉玉米gbssⅰ活性均高于普通玉米,授粉20d后高直链淀粉玉米的gbssⅰ活性急剧上升,授粉后30d的gbssⅰ活性比授粉后20d又增长了81.25％；而普通玉米的gbssⅰ活性仅增长了33.33％；两种类型的玉米子粒中sss活性的变化趋势一致，均呈单峰曲线变化，粉后20d达到峰值，此后逐渐下降。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。