一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法及突变菌株和突变体与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法及突变菌株和突变体。
背景技术：
丙烯基苯型精油单分是通过物理的方法从植物精油中提取的某一种丙烯基苯化合物，这类化合物的共同特征是具有丙烯基侧链，并且在苯环上具有甲氧基取代基团，常被作为合成带有苯环结构的名贵香料和药物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化学合成香料在香料生产上存有：香料化合物中残留的化学物质给人体健康带来危害、化学合成会带来环境的污染、化学合成反应立体选择性差而导致产物为外消旋体等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技术越来越受到人们的关注。反式茴香脑加氧酶(tao)，由han等人最先在恶臭假单胞菌pseudomonasputidajyr-1中发现，该酶能氧化反式茴香脑合成对茴香醛，同时也能氧化异丁香酚、异黄樟素和对甲氧基异丁香酚，但催化效率不高，e.colibl21(de3)(pet-tao)在含0.5mmol·l-1的葡萄糖和1mmol·l-1的不同底物溶液中,反应6h，能分别合成0.63mmol·l-1对茴香醛和香草醛、0.38mmol·l-1的洋茉莉醛和藜芦醛。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法，其包括，以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错pcr，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库；将所述反式茴香脑加氧酶反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度。作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法的一种优选方案：所述易错pcr，包括设计易错pcr引物，所述易错pcr引物为：taof：ttccaggggcccctgggatccggatccatggaggacatcatgctaod：gtcacgatgcggccgctcgagctcgagtcagttagtcctcaagtcg作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法的一种优选方案：所述获得反式茴香脑加氧酶突变体文库，包括以重组质粒pgex-6p-1-tao为模板，rtaq聚合酶进行易错pcr获得随机突变，pcr体系中添加浓度为7～10mmol·l-1的mg2+以及30～250μmol·l-1的mn2+，pcr产物连接至线性质粒pgex-6p-1，再将连接产物导入感受态细胞e.colibl21(de3)中，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库。作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法的一种优选方案：所述进行显色反应，包括，将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶突变体文库涂布平板，挑取单菌落接种于含有100mg·l-1的氨苄青霉素的lb培养基中，诱导培养，离心获得菌体，加入100～200μl的缓冲液混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·l-1的反式茴香脑加氧酶反应底物，28～37℃催化反应20～120min，取反应上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂于10～40℃反应5～40min，再加入0.5～3mol·l-1的naoh以及0～80％的乙醇溶液，10～40℃溶解沉淀，用酶标仪测定吸光度od470。作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶反应底物，包括4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯。作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法的一种优选方案：所述重组质粒pgex-6p-1-tao，是将来源于恶臭假单胞菌pseudomonasputidajyr-1的反式茴香脑加氧酶基因连接到质粒pgex-6p-1。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供高通量筛选方法得到的反式茴香脑加氧酶突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶突变体为e.colibl21(de3)-3g2，其氨基酸特征序列如seqidno1所示。作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的一种优选方案，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶突变体为e.colibl21(de3)-3g2，其有三个碱基发生突变，分别为211g变为t、330a变为g以及746g变t；相比于反式茴香脑加氧酶野生型的氨基酸序列，其有两个氨基酸发生变化，分别为71val变为leu，249gly变为cys。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种反式茴香脑加氧酶突变菌株，其中：所述反式茴香脑加氧酶突变菌株包含所述反式茴香脑加氧酶突变体，所述反式茴香脑加氧酶突变菌株为lsq-3，所述lsq-3全细胞催化4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯和反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯合成的洋茉莉醛和对茴香醛的催化效率显著提高。本发明的有益效果：本发明利用本实验室构建的重组质粒pgex-6p-1-tao为模板，通过易错pcr的方式构建突变库，并建立以2,4-二硝基苯肼为显色剂，酶标仪测定od470为基础的高通量筛选方式，筛选合成洋茉莉醛重组菌株的突变菌株，该方式具有高效、精准、快速的优势。获得的突变体lsq-3对于合成洋茉莉醛、对茴香醛以及香兰素的催化效率均有提高，体现了良好的应用价值。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本发明定向进化高通量筛方法的流程图。图2为本发明lsq-3全细胞催化丙烯基苯型精油单分合成芳香醛产物的gc-ms图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1：高通量筛选方法的建立：(1)不同碱溶液对显色的影响分别测定1mol·l-1的naoh-50％乙醇溶液以及koh-50％乙醇溶对显色的影响，记录od470以及稳定性(1h内od470的最大差值的绝对值与当前使用值得比值)，如表1所示。表1不同碱溶液对显色的影响碱液naohkohod4702.861.814稳定性0.0160.055结果表明采用naoh-50％乙醇溶液的od470响应较高、稳定性较好。(2)不同碱浓度对显色的影响分别测定0.5～3.0mol·l-1的naoh对显色的影响，记录od470以及稳定性，如表2所示。表2不同碱浓度对显色的影响结果表明naoh浓度在1.5-2.0mol·l-1时，od470稳定。(3)不同有机溶剂对显色的影响分别测定乙醇以及甲醇作为有机溶剂对显色的影响，记录od470以及稳定性，如表3所示。表3不同有机溶剂对显色的影响有机溶剂乙醇甲醇od4702.4630.33稳定性0.0130.048结果表明选择乙醇，od470响应较高、稳定性较好。(4)不同浓度的乙醇对显色的影响分别测定浓度为0％～80％的乙醇溶解naoh后对现场的影响，记录od470以及稳定性，如表4所示。表4不同浓度的乙醇对显色的影响结果表明乙醇浓度大于50％时，od470响应值和稳定性较好。本发明反应完成后利用酶标仪，在范围为300～700nm(增量为10nm)的波长下进行扫描，得出反应液最大吸收波长为470nm。该方式能够作为高通量筛选方式使用。实施例2：以合成产物洋茉莉醛为例，取50μl洋茉莉醛标准液(浓度为0～1000mg·l-1)，加入50～300μl的2,4-二硝基苯肼显色剂，10～40℃反应5～40min，加入0.5～3mol·l-1的naoh-(0～80％)乙醇溶液，10～40℃反应5～60min，将其取出，利用酶标仪测定其吸光值od470，以洋茉莉醛浓度为横坐标，od470值为纵坐标，绘制标准曲线，获得计算公式为y＝0.00496x+0.09445，r2为0.9995，洋茉莉醛检测浓度范围为0～700mg·l-1。该方式能够作为高通量筛选方式使用。实施例3：tao突变库的建立：(1)易错pcr建立tao突变库根据pseudomonasputidajyr-1中反式茴香脑加氧酶基因合成tao，并连接至pgex-6p-1上，获得重组质粒pgex-6p-1-tao，并以此为模板，设计易错pcr引物taof、taod，设定mg2+浓度、mn2+浓度分别为7～10mmol·l-1以及30～250μmol·l-1，利用普通rtaq聚合酶进行易错pcr。引物如下：taof：ttccaggggcccctgggatccggatccatggaggacatcatgctaod：gtcacgatgcggccgctcgagctcgagtcagttagtcctcaagtcgpcr程序设置如下：用核酸凝胶电泳检测pcr产物，纯化回收pcr产物后，再采用一步克隆试剂盒连接至线性载体pgex-6p-1上，并转化至e.colibl21(de3)超级感受态中，涂布培养，挑取单菌落进行菌落pcr验证，测序得出该突变库中平均氨基酸突变量1～6个。实施例4：突变库的筛选：(1)突变库的初筛将获得的单菌落划线于48小格平板，将其至于37℃恒温培养箱过夜培养，4℃保藏。采用牙签挑取保存的菌体分别接种于100～1000μl的96深孔板中，37℃过夜培养后，以1～10％的接种量将其转接至含100～1000μl的lb的96深孔板培中，37℃，110rpm培养2～5h，添加终浓度为0.05～1.0mmol·l-1的iptg诱导剂，20～25℃，诱导6～12h。培养结束后利用孔板离心机离心收集菌体。在菌体中加入100～200μl的缓冲液(ph7～8.5)，利用振荡器重悬混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·l-1的4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯，总反应体系为300μl，28～37℃催化反应10～120min，结束反应后离心，取反应上清液50μl，按照实施例1中方法测定显色后的od470，即，将50μl上清液与50～300μl的2,4-二硝基苯肼显色剂10～40℃反应5～40min，加入800μl的0.5～3mol·l-1的naoh-(0～80％)乙醇溶液，10～40℃反应5～60min，酶标仪测定od470，与对照组比较，选取其中吸光值高的53株菌株进行复筛。2,4-二硝基苯肼显色剂的配置方法为：将0.5g的2,4-二硝基苯肼粉末完全溶解于0.03l浓硫酸中，向其中缓缓加入0.3l的95％乙醇溶液，混合后利用容量瓶定容至1.0l，储存于棕色试剂瓶中密封，置于阴凉处保存。(2)突变库的复筛将复筛菌株利用30ml/250ml的lb培养基，添加终浓度为0.4mmol·l-1的iptg于20℃诱导6h，收集菌体。在pbs缓冲液中添加浓度为0.1～3g·l-1的4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯的底物，湿重为1％～3％的湿菌体，于28～37℃催化反应10～120min，利用两倍体积的甲醇终止反应，处理反应液后，利用高效液相色谱测定洋茉莉醛的浓度，计算转化速率，获得突变菌株e.colibl21(de3)-3g2(命名简称为lsq-3)，该突变株是将反式茴香脑加氧酶的第71位的缬氨酸替换成亮氨酸(v71l)，第249位甘氨酸替换为半胱氨酸(g249c)。突变体氨基酸序列见seqidno1。该突变体lsq-3在全细胞催化的过程中能催化4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯和反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯合成的洋茉莉醛和对茴香醛的催化效率提高。实施例5：突变菌株lsq-3催化四种丙烯基苯型精油单分合成芳香醛：将lsq-3利用lb培养基于37℃过夜培养后，转接至新鲜的lb培养基中培养，之后利用终浓度为0.05～1.0mmol·l-1的iptg，20～25℃诱导8～12h，离心收集菌体。取适量的菌体lsq-3于缓冲液反应体系中，分别以4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯、4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯以及反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯四种丙烯基苯类物质为底物，在28～37℃，90～180rpm的条件下的转化15min后，利用两倍体积的甲醇终止反应，利用高效液相色谱测定产物浓度，结果如表5所示。计算单位菌体单位时间内合成芳香醛的转化能力，与文献报道的野生型反式茴香脑加氧酶重组菌e.colibl21(de3)(pet-tao)的相比(r)，如表5。表5lsq-3与e.colibl21(de3)(pet-tao)催化结果比较a：现有技术数据，反应条件1mm底物，od600为2的菌体量反应时间6h；b：本发明反应条件：8mm底物，od600为1的菌体量，反应时间15min；r＝b*6*60*2/(a*15*8)(即b单位时间单位菌对底物的转化率/a单位时间单位菌体对底物的转化率)从表中可知突变体lsq-3全细胞合成洋茉莉醛和对茴香醛能力显著高于野生型的数值，催化效率提高倍数分别为79和42倍。本发明利用本实验室构建的重组质粒pgex-6p-1-tao为模板，通过易错pcr的方式构建突变库，并建立以2,4-二硝基苯肼为显色剂，酶标仪测定od470为基础的高通量筛选方式，其能筛选合成洋茉莉醛重组菌株的突变菌株，该方式具有高效、精准、快速的优势。获得的突变体lsq-3对于合成洋茉莉醛、对茴香醛以及香兰素的催化效率均有提高，体现了良好的应用价值。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。序列表<110>江南大学<120>一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法及突变菌株和突变体<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>348<212>prt<213>反式茴香脑加氧酶突变体(pseudomonasputida)<400>1metglyalailemetglyglythralaalaalavalseralaalaala151015glythrleuthrilealaalaglyileglyalaleualaproglyleu202530alaproalaglyilethralaleuserthrthrthrthrvalalaala354045provalmetalaleuvalthrthrleuglyileproalaprothrgly505560proproalaglyservalleumetglyvalthrthrglyleualaile65707580leuleuproglyleualathralaalathrleuglyhisprothrthr859095thrproglythrglyproalaalaproalametglyalaserleuala100105110hisvalalaalaglyhisalaalaleualaleualaserproglythr115120125proproalaalaalavalilethrthrthralathrileglyalaala130135140leuhisalaleualaleuservalglyleuproglyprothrleuala145150155160glyglyilealaserglyalathrthralaalailecysalaglypro165170175thrserglyalaglyleuvalthrglythrproglyserproglyala180185190metleuglythrileglyalathrglyalaglyprothrglyglyval195200205glyserglyalavalleuthrglyalaileileleuglyprovalala210215220alathrproproglyproleuglythrileglyalaglyleuthrleu225230235240serproglyleuprothrilealacysleumetglyserglyleupro245250255alaproilemetleuthrvalmetalaleuglyleuthrproglyleu260265270thrleuglyglyalavalproproalaproleuleuserthrprogly275280285leualaalaalaleuprovalalaproglyglyhisilealapropro290295300thralaglyvalleucysproproproglyalathrserglyproser305310315320ileproseralaalaserserglycysproprohisalaglyleuala325330335alaglyglyalaalaalaseralaleualathrala340345当前第1页12