一种多孔碳材料的应用的制作方法

本发明涉及一种多孔碳材料在生物样品中吸附抗生素的应用。
背景技术：
抗生素是某些如细菌、放线菌、真菌等微生物的代谢产物或合成的类似物，小剂量时对各种病原微生物有强力的杀灭或抑制作用。抗生素除用于医疗，还应用于生物科学研究、农业、畜牧业、水产及畜禽养殖和食品工业等方面。临床上多数抗生素用于治疗细菌感染性疾病。抗生素的过度使用，不仅会产生超级细菌，同时也会影响血液中微生物的检测。血培养为血流感染患者提供重要的诊治信息，对提高血流感染的治愈率有重要的意义。但在血培养过程中，由于事先应用了各种广谱抗菌药物，使得血液中的细菌受到抗菌药物的抑制作用而难以生长，导致培养的假阴性。故为了提高全自动血培养仪的阳性检出率，必须除掉血液中抗生素的干扰。头孢类抗生素为临床常用抗生素中的一种。因此，研究头孢类抗生素的去除问题，对于解决血培养中阳性检出率低的问题很有意义。去除抗生素的途径有很多，如氧化法，生物处理法，吸附法等。(1)氧化法主要是利用羟基自由基作为强氧化剂来氧化或矿化有机物。hou等在ultrasound-assistedheterogeneousfenton-likedegradationoftetracyclineoveramagnetitecatalyst一文中采用h2o2氧化技术，在1小时内实现了四环素93.6％的去除率。michael等在fatta-kassinos.solarfentonandsolartio2catalytictreatmentofofloxacininsecondarytreatedeffluents:evaluationofoperationalandkineticparameters.一文中利用tio2作氧化剂去除氧氟沙星，去除率达60％。氧化法虽然可将抗生素药物氧化降解为无毒物，但是在生物样品培养中，由于氧化剂对细菌的杀伤作用，故不能在生物样品培养中使用。(2)生物处理法主要包括活性污泥处理法、膜生物反应处理法。lib,zhangt等在massflowsandremovalofantibioticsintwomunicipalwastewatertreatmentplants.chemosphere一文中提出利用污泥中的细菌对抗生素的分解,达到取出的目的。但由于引入细菌，此法不能用于生物样品培养中。(3)吸附法是利用一些多孔的固体吸附材料，使溶液相中的一种或一类物质吸附到固相表面，从而实现对污染物的有效分离的方法。吸附法所用的吸附材料主要有:吸附树脂、离子交换树脂、无定形碳、伯胺化合物。us4,145,304和us5,314,229两篇专利中所述的吸附树脂和离子交换树脂的组合只对青霉素类(青霉素g，氨苄青霉素，甲氧西林)、氨基糖苷类(阿米卡星，庆大霉素)、大环内酯类(红霉素)和多烯类(两性霉素)等抗生素有好的吸附效果，并未给其他类别抗生素尤其是头孢类抗生素的吸附效果。美国专利5,162,229和美国专利8,911,962中所述的无定形炭对β-内酰胺类抗生素中的碳青霉烯类及头孢类抗生素吸附效果不佳。美国专利8,603,770和美国专利8,420,346中所述的伯胺化合物对β-内酰胺类抗生素(如碳青霉烯类)有吸附效果，并未给其他类别抗生素尤其是头孢类抗生素的吸附效果。综上所述，至今还没有很好的去除头孢类抗生素的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种多孔碳材料的应用，特别是头孢类抗生素吸附应用以提高生物样品培养中细菌的阳性检出率，简化操作，提高效率，降低能耗，减少投资与污染。本发明一种多孔碳材料的应用，所述多孔碳材料吸附生物样品中的头孢类抗生素；所述多孔碳材料具有囊泡状大孔结构；所述囊泡状大孔的孔壁上具有大孔、微孔和/或介孔。所述囊泡状大孔优选的孔径为2-5μm。所述微孔优选孔径为0.4-1nm。所述多孔碳材料的微观形貌结构如图1所示，其具有囊泡状大孔结构。所述囊泡状大孔的直径不大于5μm。所述囊泡状大孔的孔壁上具有大孔、微孔和/或介孔。囊泡状大孔孔壁上的大孔孔径不大于500nm。发明人通过研究发现，通过采用本发明特定形貌与孔径分布的多孔碳材料即所具有的囊泡状大孔结构与多级孔结构及其孔径分布使其对头孢类抗生素的吸附效果明显。图2为所述多孔碳材料的eds。通过eds元素分析，除了碳元素以外，还有氧、硅、钠、钙、镁等元素。从表1为多孔碳材料的元素分析表中可得，碳元素占到了88.47％，氧元素占10.37％，其它可能有少量的硅、钠、钙、镁元素。其中，少量的钠元素可能来自氢氧化钠活化剂，其余元素可能来自稻壳基体。表1.多孔碳材料的元素分析表元素co其他质量百分比88.4710.371.16图3为所述多孔碳材料的bet图。从图中可以看出，该多孔碳材料的比表面积sm＝1192m2/g。采用生物质制备所述多孔碳材料。所述生物质包括稻壳。所述多孔碳材料的制备包括以下步骤：(1)碳化：将稻壳于100～500℃下保温碳化后，研磨，过80目筛；(2)活化热处理：将碳化后的稻壳与氢氧化钠混合，于600～900℃，在氮气或惰性气氛的保护下保温冷却后，洗涤；烘干研磨，过200目筛。将稻壳置于坩埚中，于马弗炉中进行碳化。稻壳碳化温度优选为300～500℃。稻壳碳化时间至少1小时。将碳化稻壳与氢氧化钠于坩埚内混合，于马弗炉中保温。保温时间优选为2～4h。所述碳化稻壳和氢氧化钠的质量比不高于10：1。所述生物样品包括血液，血浆，血清和唾液中的一种。所述头孢类抗生素包括：头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮钠舒巴坦钠中的一种或几种。所述多孔碳材料与培养基混合，吸附头孢类抗生素，于121℃灭菌；在无菌的条件下将生物样品加入所述培养基中，恒温培养。发明人将所述的自制备多孔碳材料和培养基依次放入培养瓶混合。并在121℃下进行高温灭菌。然后冷却至室温。以无菌操作将生物样品加入到上述冷却的培养瓶中，进行恒温培养。用中国专利文献公开的公开号为cn101403724a的压电全自动血培养仪进行全自动在线检测。若仪器报阳，表明抗生素已被此种多孔碳材料吸附到抑菌浓度以下，结果用positive表示；若仪器报阴，结果用negative表示。检测结果如表2，结果表明发明所述的多孔碳材料能快速有效的吸附和/或中和生物样品中的抗生素，尤其是头孢类抗生素，提高临床微生物的阳性检出率。表2含抗生素的血培养检出情况本发明的有益效果如下：本发明提供的多孔碳材料的应用相对于现有技术来说，不会杀灭生物样品中的细菌，也不会引入外来细菌，操作简便，效率高，能耗低，投资费用低，不产生二次污染，不会带来毒性更大或更难降解的污染物。所述多孔碳材料可选择性高效的吸附头孢类抗生素，可显著提高生物样品培养中细菌的阳性检出率。附图说明图1.多孔碳材料的sem形貌结构图图2.多孔碳材料的eds图图3为多孔碳材料的bet图图4为实施例2的空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图5为实施例2的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图6为实施例3的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图7为实施例3的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图8为实施例4的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图9为实施例4的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图10为实施例5的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图11为实施例5的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图12为实施例6的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图13为实施例6的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图14为实施例7的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图15为实施例7的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图16为实施例8的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图17为实施例8的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图18为实施例9的空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图19为实施例9的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图20为实施例10的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图21为实施例10的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图22为实施例11的空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图23为实施例11的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图24为实施例12的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图25为实施例12的多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线。图26为木片制备的多孔碳材料的sem形貌结构图。图27为为椰壳制备的多孔碳材料的sem形貌结构图。具体实施方式用所述的多孔碳材料吸附血液中的抗生素方法步骤如下：步骤(1)将所述的自制备多孔碳材料和培养基依次放入培养瓶混合，并在121℃下进行高温灭菌。步骤(2)以无菌操作将生物样品加入到步骤(1)中冷却的培养瓶，进行恒温培养。步骤(3)用中国专利文献公开的公开号为cn101403724a的压电全自动血培养仪进行全自动在线检测。若仪器报阳，表明抗生素已被此种多孔碳材料吸附到抑菌浓度以下，结果用positive表示；若仪器报阴，结果用negative表示。实施例1多孔碳材料对抗生素的吸附本发明中，还包括用自制备的多孔碳材料吸附抗生素，尤其是头孢类抗生素的方法。具体如下：40ml体系包括3.0g上述制备的多孔碳材料，10mg的头孢曲松钠或4.8mg头孢他啶或6.56mg头孢吡肟或7.12mg头孢哌酮钠-舒巴坦钠和40ml的去离子水。静置24h后，分别取上清液，并过滤到5ml离心管中，做好标记，并用紫外可见分光光度计依次去检测得到的溶液。再分别与1μg/ml的头孢曲松钠、4μg/ml头孢他啶、8μg/ml头孢吡肟、4μg/ml头孢哌酮钠-舒巴坦钠溶液的紫外曲线比较。结果如表3所示。表3：多孔碳材料对水中抗生素吸附效果的影响从表2中可知：经过24h的处理，用分光光度法检测吸附后溶液中的头孢曲松钠、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮钠-舒巴坦钠均未检出。实施例2制备的多孔碳材料，用于全自动血培养仪的检测。所用的全自动血培养系统为压电全自动血培养仪(参考公开号为cn101403724a的中国专利文献公开)。全自动血培养仪配套血培养瓶的制备：①无多孔碳材料瓶(空白对照瓶，即未添加所述的多孔碳材料)培养瓶中加入38ml培养基(牛肉膏2g/l；酵母浸膏1g/l；葡萄糖11g/l；18aa氨基酸16ml/l，抗凝剂(多聚茴香脑磺酸钠)0.25g/l，ph7.2，去离子水)；②多孔碳材料瓶培养瓶中加入38ml培养基(牛肉膏2g/l；酵母浸膏1g/l；葡萄糖11g/l；18aa氨基酸16ml/l，抗凝剂(多聚茴香脑磺酸钠)0.25g/l，ph7.2，去离子水)及多孔碳材料。所有培养瓶均需盖上瓶塞经121℃高温灭菌锅灭菌30分钟冷却后使用。模拟血样的制备：往上述制备好的培养瓶中加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的菌液(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌，根据抗生素的不同选择对应菌液)，血药浓度抗生素(见具体实施例)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。模拟血样的检测：将装有待测样本的培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养。打开电脑上相应软件，培养瓶内溶液的电导变化会被实时在线监测并会自动记录相应的相对频移(△f)—时间(t)曲线。检测结果见具体实施例，响应曲线见附图说明书。往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的金黄色葡萄球菌，抗生素为头孢类的头孢他啶(培养瓶内浓度为120μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图4和图5。图4为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阴性；图5为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阳性。实施例3往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的金黄色葡萄球菌，抗生素为头孢类的头孢吡肟(培养瓶内浓度为164μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图6和图7。图6为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阴性；图7为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阳性。实施例4往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的金黄色葡萄球菌，抗生素为头孢类的头孢曲松钠(培养瓶内浓度为250μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图8和图9。图8为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阴性；图9为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(金黄色葡萄球菌)的检测结果呈阳性。实施例5往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的大肠杆菌，抗生素为头孢类的头孢曲松钠(培养瓶内浓度为250μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图10和图11。图10为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阴性；图11为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阳性。实施例6往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的大肠杆菌，抗生素为头孢类的头孢他啶(培养瓶内浓度为120μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图12和图13。图12为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阴性；图13为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阳性。实施例7往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的大肠杆菌，抗生素为头孢类的头孢吡肟(培养瓶内浓度为164μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图14和图15。图14为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阴性；图15为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阳性。实施例8往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的大肠杆菌，抗生素为头孢类的头孢哌酮钠和舒巴坦钠(培养瓶内浓度为53μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图16和图17。图16为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阴性；图17为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阳性。实施例9往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的大肠杆菌，抗生素为头孢类的头孢哌酮钠和舒巴坦钠(培养瓶内浓度为178μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图18和图19。图18为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阴性；图19为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(大肠杆菌)的检测结果呈阳性。实施例10往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的铜绿假单胞菌，抗生素为头孢类的头孢吡肟(培养瓶内浓度为164μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图20和图21。图20为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阴性；图21为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阳性。实施例11往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的铜绿假单胞菌，抗生素为头孢类的头孢他啶(培养瓶内浓度为120μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图22和图23。图22为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阴性；图23为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阳性。实施例12往上述制备好的培养瓶中依次加入1ml无菌绵羊血，1.0ml*104cfu/ml的铜绿假单胞菌，抗生素为头孢类的头孢曲松钠(培养瓶内浓度为250μg/ml)，盖上瓶塞振荡摇匀。加多孔碳材料的作为实验组，未加多孔碳材料的作为空白对照组。每组做8个平行。将培养瓶放入压电全自动血培养仪(公开号为cn101403724a)的检测槽中，37℃恒温培养，120小时内不报阳则不再进行检测。检测结果见图24和图25。图24为空白对照瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示空白对照瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阴性；图25为多孔碳材料瓶的相对频移(△f)—时间(t)曲线，显示多孔碳材料瓶中的微生物(铜绿假单胞菌)的检测结果呈阳性。对比例1以木片为原料制备多孔碳材料，具体步骤如下：由火炬松获得的木片，按木片与koh的质量比1：4，浸渍活化96小时。然后将木片过滤，风干并在850℃下在n2气氛中热解3小时以活化浸渍的koh。使用研钵和研杵将材料研磨成细粉末，然后在600℃下在氩气中进行另外的热解步骤2小时以清洁样品并除去杂质。最后，在300℃下空气活化6小时，得到碳材料微观形貌如图26所示，只具有一级孔洞。按实验例1所述的方法测试，通过实验发现该活性碳对头孢类抗生素的吸附效果不佳。对比例2以椰壳为原料制备多孔碳材料，具体步骤如下：将椰壳在水蒸气与二氧化碳的气氛下于800-1000℃碳化，得到碳材料。由椰壳制备的碳材料微观形貌如图27所示，只具有一级孔洞，不具备本发明的活性炭所具有的特殊结构。按实验例1所述的方法测试，通过实验发现对头孢类抗生素的吸附效果不佳。当前第1页12