本发明属保健饮品领域，尤其涉及黑玉米醋及提取黑玉米花青素的方法。
背景技术：
黑玉米（blackcorn）又称黑糯米，是玉米的一种特殊类型其籽粒角质层不同程度地沉淀黑色素，外观乌黑发亮。黑玉米含蛋白质（约13-15%）、氨基酸、脂肪（约5%）、水溶性黑色素、矿物质、总黄酮及粗纤维等，营养含量明显高于其他谷类作物。黑玉米具有补血、抗疲劳、抗癌、抗氧化等作用，有预防心脏病、防止动脉硬化、降低胆固醇、预防和治疗高血压等功效。
花青素（anthocyanidin）是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属类黄酮化合物，其易溶于水或醇类有机溶剂。花青素类色素具有类黄酮的典型结构，以c6-c3-c6为基本骨架，根据花青素核上羟基和甲氧基数量和位置的不同分为不同的花青素。花青素类色素存在于高等植物的各种器官中，有红橙紫蓝黑等颜色。植物中常见的有六种，其中矢车菊素是自然界最广泛存在的花青素。花青素是纯天然的抗衰老的营养补充剂，研究表明它的抗氧化性能比ve高出五十倍，比vc高出二十倍。它不但能防止皮肤皱纹的提早生成，还可维持正常的细胞连结、血管的稳定、增强微细血管循环、提高微血管和静脉血液的流动，进而促进伤口的迅速愈合。花青素能够防止紫外线侵害皮肤，其中所含的胶原蛋白和硬性蛋白对皮肤的整个结构起重要作用。花青素还可消除眼疲劳；延缓脑神经衰老；对由糖尿病引起的毛细血管病有治疗作用；增强心肺功能；预防老年痴呆等有辅助作用。目前食品工业上所用的花青素多为合成色素，几乎都有不同程度的毒性，长期使用会危害人的健康，因此天然花青素就越来越引起了科研领域的关注。
食醋中的主要抗氧化物质有：多酚类物质、维生素类、黄酮类物质等。食醋中的抗氧化物质种类和总量会对抗氧化能力大小有重要的影响。食醋的色泽、稳定性、营养保健功能都受到多酚类物质含量的影响；黄酮类物质广泛的存在于果蔬类、种子、茶类中，是一种生理活性特别强，营养功能显著的活性物质，食醋中也含有一定量的黄酮类物质，通常情况黄酮类物质与鼠李糖或葡萄糖结合成苷，部分可以与鞣质类物质呈结合态或呈游离状态。食醋可以抑制体内胆固醇和甘油三酯的升高，调节血糖和预防糖尿病，预防高血压，美容抗衰老，促进钙吸收。
技术实现要素：
本发明的目的是为解决黑玉米脱粒后花青素损失大及花青素易降解的问题而提供一种高花青素含量的黑玉米醋及提取黑玉米花青素方法。
高花青素含量的黑玉米醋，它是由下述方法制备的：
1）黑玉米果穗去除苞叶，粉碎得玉米籽粒和玉米轴芯混合物，加水，接种活化酵母，调节ph，发酵；在糖含量重量百分比达到2~6%，酒精度达到5~9%时，过滤，得发酵液；
2）发酵液接种活化醋酸菌，混合，封口，发酵，得黑玉米醋；
步骤1）所述的糖含量达到3~5%时，酒精度达到6~8%时过滤；
步骤2）所述的发酵在溶液ph＜3时终止发酵。
提取黑玉米花青素方法，它包括：
1）大孔树脂的预处理
大孔树脂乙醇浸泡后，滤去乙醇，用蒸馏水反复冲洗至没有醇味；再用2-5%hcl溶液浸泡，蒸馏水洗至ph=7.0；3-5%nacl溶液浸泡24h，再用蒸馏水洗至ph=7.0并浸泡在蒸馏水中，保存备用；
2）将上述的黑玉米醋过预处理过的大孔树脂；收集黑玉米醋；
3）用乙醇作为解吸剂，洗脱，旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥；
步骤1所述的乙醇浸泡为95%乙醇浸泡24h，再用乙醇冲洗；
所述的hcl溶液为5%hcl溶液，浸泡24h，5%nacl溶液浸泡24h；
所述的大孔树脂为xda-6型大孔树脂。
本发明提供了高花青素含量的黑玉米醋及提取黑玉米花青素方法，黑玉米醋，它是由下述方法制备的：黑玉米果穗去除苞叶，粉碎得玉米籽粒和玉米轴芯混合物，加水，接种活化酵母，调节ph，发酵；在糖含量重量百分比达到2~6%，酒精度达到5~9%时，过滤，得发酵液；发酵液接种活化醋酸菌，混合，封口，发酵，得黑玉米醋；黑玉米果穗直接粉碎，玉米籽粒和玉米轴芯混合物直接发酵，解决了黑玉米脱粒后花青素损失大的问题，得到的黑玉米醋花青素含量，花青素在酸性的环境下稳定，解决了花青素贮存及生产过程中易降解的问题，采大预处理过大孔树脂吸附花青素，黑玉米醋与花青素分离，用乙醇洗脱花青素获得食品级的花青素和黑玉米醋。经检测无毒负作用。整个过程减少了花青素的损失，提高了花青素的产量。
附图说明
图1黑玉米醋最适宜上柱量；
图2洗脱剂体积分数对洗脱性能的影响；
图3洗脱速度对洗脱性能的影响。
具体实施方式
实施例1黑玉米果穗前处理
将成熟期黑玉米果穗（黑玉米籽粒和黑玉米穗轴一起）和苞叶一同采收，收割后去除黑玉米苞叶、杂质，筛选去掉霉坏玉米粒，其余的玉米粒不脱粒；用除尘机除去黑玉米果穗表面灰尘，淋洗黑玉米果穗的表面，干燥；将黑玉米果穗通过机械粉碎机粉碎，过筛，得到60目黑玉米籽粒与玉米穗轴（轴芯）混合物，即黑玉米粉；黑玉米粉越细越好，有利于淀粉水解酶与黑玉米粉充分接触。
实施例2黑玉米发酵工艺优化
1、酵母的活化
称取一定量的酿酒用活性干酵母（ady），用2-5%葡萄糖溶液在37℃恒温水浴中溶解后，移至30℃恒温箱中活化60-90min，活化过程中每隔10min搅拌1次；即可以做酒母使用。
2、生料发酵
按实施例1对黑玉米果穗进行前处理，得到黑玉米粉；称取过筛的黑玉米粉，按黑玉米粉和水重量比1：3比例均匀混和，加入适量活化后的酵母，调节ph，塞上发酵栓，入发酵罐发酵；以初始ph值4.0、4.5、5.0、酵母菌接种量分别为1.0g/l、2.0g/l、4.0g/l，发酵温度22℃、26℃、30℃3个因素进行l9(33)正交试验；定时取样，测定发酵过程中酒精度、糖度、酸度；酒精度的测定采用比重计法；糖度测定采用斐林试剂法；酸度的测定采用酸碱滴定法；以酒精度为评价标准，确定酒精发酵的最佳条件，结果见表1。
根据表1极差分析结果可知，影响黑玉米发酵酒精度的因素依次为c＞b＞a，即发酵温度＞接种量＞初始ph值；以酒精度为指标的最佳发酵条件组合为a2b2c2，即发酵温度26℃、接种量2.0g/l、初始ph4.5；温度是影响酵母菌代谢的重要因素，温度过高或过低，对酵母菌的繁殖和产酒速率有较大影响，故发酵温度对发酵起决定性作用；酵母添加量决定发酵速度，添加量大使菌体细胞会过早衰老并自溶，最终生成的酒精度低，添加量少导致发酵慢，生成的酒精度也低，故接种量对发酵具有较大影响；ph为弱酸性时有助于发酵，但对发酵影响较小。
实施例3黑玉米醋的制备
1.黑玉米酒精发酵
将10kg干燥的黑玉米果穗通过机械粉碎机粉碎，过筛，得到60目玉米粉；称取一定量的活性干酵母（ady），用2-5%葡萄糖溶液在37℃恒温水浴中溶解后，移至30℃恒温箱中活化60-90min，活化过程中每隔10min搅拌1次；称取过筛的玉米粉，按1：3比例与蒸馏水均匀混和，按2.0g/l加入活化后的酵母，调节初始ph4.5，塞上发酵栓，入发酵罐发酵，发酵温度26℃；定时取样，测定发酵过程中酒精度、糖度；酒精度的测定采用比重计法；糖度测定采用斐林试剂法；在没有气泡时，糖含量达到3.0%，酒精度达到7%时，黑玉米的酒精发酵过程完成，得到黑玉米酒精发酵液。
2.醋酸菌株活化及扩大培养
选用巴氏醋酸杆菌，用浸过的酒精脱脂棉擦净装有醋酸菌的安醅管，用酒精灯加热安醅管顶端，向顶端滴少许无菌水，使其开裂，用镊子敲开安醅管的顶端。用无菌管吸取基础培养基滴入安赔管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浮状，将菌体悬浮液移植于斜面培养基上，30℃温度下培养，然后再扩大培养；取250ml三角瓶1只，加入100ml液体基础培养基，121℃高压灭菌20min；加入3ml无水乙醇，冷却后用接种环从醋酸菌斜面培养基上取2环醋酸菌接入试管中，四层纱布封口，置于恒温振荡培养箱中，在30℃条件下培养48h，转速为120r/min。
3.黑玉米醋发酵
黑玉米酒精发酵结束后，将发酵液滤去残渣；接种上述的活化后醋酸菌，接种量为总体积的6%，混合，搅拌溶液，盖8层纱布封口；30℃下发酵，每天搅拌容器内液体1次；测定发酵液的ph值、酸度，直到ph＜3的状态下，检测酸度不再增加，闻气味没有或者几乎没有酒味，醋酸发酵结束；所述的酸度检测方法参照gb/t12456-2008《食品中总酸的测定》；为防止醋酸的过氧化反应（是指醋酸菌在乙醇底物基本耗尽的情况下，继续氧化醋酸生成二氧化碳和水的反应），加入2%食盐结束发酵，密封，放置一段时间，以作后熟或者陈酿，即得到黑玉米醋。
4.黑玉米醋品质评定
黑玉米醋的色泽、滋味香气、口感是决定其感官品质的重要指标；本实施例以上述3个指标作为评定对象，以黑玉米醋感官质量评定标准（表2）进行感官评价，按照标准分别对黑玉米醋饮料的各项指标进行等级评定，并记录评分结果；菌落总数测定：中华人民共和国国家标准gb4789.2-2016；大肠菌群计数：中华人民共和国国家标准gb4789.3-2016；沙门氏菌检验：中华人民共和国国家标准gb4789.4-2016；金黄色葡萄球菌检验：中华人民共和国国家标准gb4789.10-2016。
黑玉米醋评定结果如下：
（1）感官指标：淡琥珀色、澄清透明、无杂质、无沉淀、具有糯玉米清香，酸甜适口，风味协调；
（2）理化指标：总酸≥5.6g/l，可溶性固形物≥9×10-2g/ml；
（3）微生物指标：菌落总数≤100cfu/ml，大肠菌群≤3mpn/ml，致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌未检出。
实施例4黑玉米醋中花青素的提取
一、大孔树脂的预处理
由于xda-6型大孔树脂可以用于提取花青素，因此本实施例以xda-6型大孔树脂为例，进行花青素的提取；将大孔树脂用95%乙醇浸泡24h初步除杂；除杂后用大量乙醇冲洗，去除有毒物质；滤去乙醇，用蒸馏水反复冲洗至没有醇味；然后用5%hcl溶液浸泡24h，再用蒸馏水洗至ph=7.0；接着5%nacl溶液浸泡24h，再用蒸馏水洗至ph=7.0并浸泡在蒸馏水中，保存备用；
大孔树脂经检测，重金属（以pb计，干基）、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、氯苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯（单位mg/kg）均未检出，证明已经除去绝大部分有毒、有害物质，比较安全，可用于后续实验。
二、黑玉米醋中花青素提取工艺
1、最适宜上柱量的确定
取xda-6树脂42.0g，湿法装柱（柱规格15×400mm，树脂床体积40ml，用水测定）。以黑玉米醋作为上柱液，通过树脂柱进行动态吸附试验；采用2.0ml/min流速上样，每10ml收集一次流出液，并分别测定每管流出液花青素浓度。以流出液体积为横坐标，花青素浓度为纵坐标绘制吸附曲线，根据泄漏点出现快慢确定最适宜的上柱量。结果如图1所示，当流出液的花青素浓度达到上样溶液花青素浓度的10%时视为饱和吸附，此时上样体积约为90-100ml。因此选择最适宜的上样体积为2-3bv。
2、洗脱剂体积分数的确定
将黑玉米醋采用2.0ml/min流速上样，上样体积为2-3bv，用体积分数分别为30%、50%、70%和90%的乙醇作为解吸剂在相同解吸流速下进行解吸，每1bv解吸液进行收集并分别测定花青素含量，绘制洗脱曲线，结果如表3所示。70%乙醇洗脱率达到最高；当乙醇浓度达到90%时，洗脱率没有明显变化，说明70%乙醇和90%乙醇对花青素的洗脱效果都较好。但比较洗脱物的纯度，70%乙醇高于90%乙醇。如图2所示，30%和50%的乙醇洗脱速度慢且有拖尾现象，而70%和90%乙醇对吸附液的洗脱速度较快；四种浓度的乙醇在5bv均可基本将花青素类物质全部洗脱下来。因此，70%乙醇洗洗脱速度快、洗脱率高、洗脱物纯度高，且峰形对称性良好，为最佳洗脱剂的体积分数。
3、洗脱流速的确定
将黑玉米醋采用2.0ml/min流速上样，上样体积为2-3bv，用相同体积分数的乙醇作为解吸剂分别在1ml/min、2ml/min、3ml/min解吸流速下进行解吸，每1bv解吸液进行收集并分别测定花青素含量，绘制洗脱曲线。结果如表4所示；在1、2、3ml/min流速下进行动态解吸，xda-6型大孔树脂对黑玉米花青素的洗脱率分别为93.12%、92.65%、81.97%，可知1ml/min和2ml/min对黑玉米花青素的洗脱效果均较好；2ml/min洗脱物纯度更高。如图3所示，以1ml/min流速洗脱，洗脱率高但曲线峰形不集中，拖尾严重且洗脱时间长；流速为2ml/min和3ml/min时峰形集中，对称性好，没有拖尾现象，但3ml/min流速的洗脱率较低，以2ml/min洗脱速度快且洗脱率最高。因此，确定洗脱流速为2ml/min。
按照2.0ml/min流速上样、上样体积为2-3bv、70%乙醇洗脱、洗脱流速为2ml/min的条件，将黑玉米醋中花青素提取出来，利用旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥除去水分，得到紫黑色粉末，即为黑玉米花青素；同时收集上柱时从树脂柱中流出的醋液，可作为食用的保健醋。
实施例5黑玉米花青素定性实验
一、样品的制备
准确称取提取的黑玉米花青素干粉0.5g（精确至0.001g），于250ml锥形瓶中，加入100ml，1%的盐酸-甲醇溶液，摇匀充分溶解，避光置于室温下保存12h，然后使用0.45μm滤纸过滤后，移入棕色瓶中，备用。准确量取上述溶液10ml，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，超声处理20min，冷至室温后用0.45μm针筒式滤膜过滤器过滤，供高效液相色谱（hplc）分析。
二、黑玉米提取物紫外-可见光谱分析
用移液管吸取花青素样品溶液0.2ml，移入10.00ml的容量瓶中，用1%盐酸-甲醇（v：v）溶液稀释，用uv-1700进行紫外-可见吸收光谱分析。通过紫外-可见光吸收光谱扫描，可以发现在紫外和可见光区各有1个较强的吸收峰，其波长分别为270和520nm。由于花青苷类化合物分别在265-275和465-560nm处有2个特征吸收蜂，由此可推断上述方法得到的黑玉米提取物中的色素为花青素类物质。
实施例6花青素安全性检测实验
1、试验对象：icr小鼠60只，20-23g，雌雄各30只，将小鼠随机分为3组，其中2组为实验组，1组为空白对照组。每组20只且体重等生命体征无异常，具有可比性。
2、试验方法：向蒸馏水中加入实施例4制备的黑玉米花青素，分别配制成浓度为50mg/ml的花青素混悬液，按照小鼠体重0.2ml/g灌胃给药方式，给实验组小鼠灌胃，空白组以蒸馏水灌胃。一日灌胃3次，连续观察7d。期间正常喂食，称重。
3、通过试验观察，小鼠灌服黑玉米花青素后生理特征正常，说明该方法制备的黑玉米花青素安全无毒，可用于工业化生产。