本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒。
背景技术：
地中海贫血(简称地贫)是全世界的高发遗传病之一，是由于人体α，β-珠蛋白基因突变或者缺失而导致α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫，α-地贫相关基因为hba2和hba1，β-地贫相关基因为hbb。地贫集中在热带和亚热带地区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和香港等地受累人口超过2亿。目前地贫尚无根治的方法，只能使用输血治疗或脊髓移植，其价格昂贵且彻底治愈几率不高，因此产前筛查和诊断对预防该种出生缺陷疾病具有重大意义。
目前临床报道产前检测地贫基因突变的方法有几种：传统的羊膜穿刺、腹绒毛活检等，这些有创伤性的操作可能导致胎儿损伤、流产或宫内感染等。1997年，卢煜明发现孕妇外周血浆中存在来自于胎儿的游离dna，这一发现为通过孕妇外周血无创产前诊断和检测胚胎基因型提供了新的可能。已有报道利用孕妇血浆游离dna与质谱、数字pcr、cold-pcr等技术对地贫已成功进行无创检测。但这些方法是基于单一位点的pcr技术，由于血浆dna含量低及高度片段化的特点，很可能会带来pcr的假阴性。除此以外，这些方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定母源突变的存在情况。
随着高通量测序技术的应用，孕妇血浆dna无创产前检测胚胎染色体异常(如21、18、13染色体非整倍体变异)以及部分大的拷贝数变异已经成功应用于临床产前筛查和诊断。进一步地，通过高通量测序技术实现检测胎儿的家系中(指胎儿的父亲和母亲)基因型和单倍体型后，对孕妇血浆游离dna的目标区域高通量测序，通过rhdo和sprt等生物信息学方法实现对胎儿是否携带地贫相关基因变异的检测。高通量测序技术具有准确度高、通量大、样本需求量少、可以产生大量数据的特点。
技术实现要素：
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高精确度的无创产前胎儿地中海贫血致病基因的检测方法，该方法不仅能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，还可以进一步确定母源突变的是否存在。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
作为本发明的第一个方面，本发明提供一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：(1)筛选snp位点，所述snp位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离dna地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离dna和父-母-已出生同胞(指胎儿的姐姐或哥哥)三人的全血基因组dna并构建相应的dna文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)所述游离dna和全血基因组dna文库测序；(4)构建所述地贫基因上snp位点的单倍体基因型，结合所述游离dna和全血基因组dna文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿所述snp位点相应的基因型。
应当说明的是，该方法基于多重pcr和目标区域捕获技术，能对α&β-地中海贫血进行无创产前检测，即针对α-地贫的设计区域(chr16:60022-2233661)：下游(10kb)+hba基因+上游(10kb)，以及针对β-地贫血设计区域(chr11:3236690-7177304)：下游(10kb)+hbb基因+上游(10kb)，利用dbsnp数据库筛选出snp位点195个α-地贫snp位点和275个β-地贫snp位点，根据筛选的snp位点分别设计地贫引物与探针，通过多重pcr技术对父-母-已育小孩基因组dna进行文库构建，在通过目标区域捕获技术对母亲游离dna进行文库构建；将所有构建好的文库进行高通量测序，将得到的测序数据与参考序列人类基因组hg19作比对，通过扩增基因组dna地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，利用gatk(3.4版本)得到父-母-已育小孩三人核心家系基因组dna的snp位点，以测序深度大于30×(倍)，测序碱基质量值大于q20为筛选条件，筛选多态位点；再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的snp基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上；通过与捕获游离dna地贫基因的探针位点信息进行序列比对，得到母亲外周血游离dna各snp位点等位碱基的频率，通过父源和母源生物信息学分析胎儿遗传的父母单倍体型，从而确定胎儿基因型。
优选地，所述步骤(2)和(3)中涉及dna提取试剂，dna纯化试剂，dna文库构建试剂，dna高通量测序试剂；dna提取体系中提取游离dna的血浆量不少于2ml，dna纯化试剂为agencourtampurexp-核酸纯化试剂盒。dna文库构建试剂中基因组dna模板不少于25ng，捕获血浆游离dna文库模板不少于100ng；高通量测序体系选用iontorrentproton测序平台进行测序。
优选地，所述父源遗传分析中，筛选父亲杂合母亲纯合的基因型位点和父亲和母亲均为纯合且基因型不同的位点，在上述两类位点中，再筛选出孕妇血浆在上述位点中为杂合的位点，进行父源遗传分析。
优选地，所述母源遗传分析中，在父源遗传情况分析基础上，筛选出父亲纯合母亲杂合的基因型位点，根据单倍型相对剂量(relativehaplotypedosage，rhdo)分析结合序贯概率比试验(sequentialprobabilityratiotest，sprt)进行母源遗传分析。
优选地，所述snp位点的筛选条件为：在中国人千人基因组南方人和北方人数据库中同时maf>＝20％，snp位点上下100bp序列是特异区域，在基因组上没有同源性，并且45％<gc<70％，连续3个碱基不同。
更优选地，所述snp位点信息见表15。
优选地，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建、父源遗传情况和母源遗传情况分析均使用ncbi数据库的hg19基因作为参考序列。
优选地，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建包括以下步骤：
1)构建父-母-已育小孩外周血基因组dna的文库：
包括目的基因(即hba、hbb)的多重pcr扩增；引物的部分消化；扩增产物的接头连接；连接产物的纯化；最后的文库片段pcr扩增及纯化；2)将上述构建的文库进行高通量测序，将人类基因组hg19作为参考序列，通过与扩增基因组dna地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，利用gatk(3.4版本)得到父-母-已育小孩三人核心家系基因组dna的snp位点，以测序深度大于30×，测序碱基质量值q大于20为筛选条件，筛选多态位点，再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的snp基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上。
其中，碱基质量值，简称q值，是碱基读取错误率p的取整映射结果；目前，q值与p值的对应关系有两种计算方式：标准sanger变体计算方式以及早期solexa管道(如illuminagenomeanalyzer软件)计算方式。以标准sanger变体方式为例，q值被称为phredqualityscore，它与p值之间的对应关系用以下公式计算得到：测序错误率与q值的简明对应方式如下：q13的碱基错误率为5％，q20的碱基错误率为1％，q30的碱基错误率为0.1％，q40的碱基错误率为0.01％；地贫扩增引物池，包括了扩增hba基因和其上下游2mb染色体区域的1354对引物和扩增hbb基因和其上下游2mb染色体区域的361对引物；应当说明的是，1354对引物和361对引物扩增出的目的片段都覆盖了相应的snp位点(snp位点信息参见表15)，为了获得足够的测序深度(30×)，所以设计了一共1715对引物，当为了获得更大的测序深度时，可以设计更多对引物，只要引物扩增出的目的片段覆盖表15的snp位点即可；本领域普通技术人员在得知表15的snp位点信息后，能够根据ncbi数据库中的hba和hbb核苷酸序列以及引物设计网站或引物设计软件设计出所需的引物对(其中包括所述的1715对引物)。
优选地，所述步骤(4)中，父源遗传情况分析包括如下步骤：
1)构建母体外周血游离dna的文库：
包括游离dna的末端补平；接头连接；连接产物的扩增及纯化；纯化后产物的浓缩和探针捕获杂交；捕获后产物的富集；最后的富集产物pcr扩增及纯化；
2)将上述构建的文库进行高通量测序，将人类基因组hg19作为参考序列，通过捕获游离dna地贫基因的探针位点信息进行序列比对，得到母亲外周血游离dna各snp位点等位碱基的频率，其中，挑选基因型为父亲杂合(mn，m和n代表碱基a,t,c,g)母亲纯合(mm)的位点和父亲和母亲均为纯合且基因型不同的位点(父亲mm，母亲nn)，在上述两类位点中，再筛选出孕妇血浆基因型为mn的位点，以此确定胎儿是否遗传了父源致病单倍体型。
优选地，所述步骤(4)中，母源遗传情况分析包括如下步骤：在父源遗传情况分析基础上，挑选出基因型为父亲纯合(mm)母亲杂合(mn)的位点，根据rhdo-sprt确定胎儿是否遗传了母源的致病单倍体型，从而推断胎儿是否遗传了有害的突变型以及是否致病。
优选地，所述sprt曲线根据以下公式计算：
所述upperboundary与lowerbundary分别指的是上界和下界；在此检测方法中，把单倍体型1定义为上界，把单倍体型2定义为下界；根据sprt的算法，计算筛选出的snp位点累积的深度和累积的变异频率；如果筛选出的snp位点都在上下界之间，那么，则不能分辨出胎儿遗传了母亲的哪一条单倍体型；如果累积的snp位点中有一个或一个以上超过了上界，则可以判断胎儿遗传了母亲的单倍体型1；如果累积的snp位点中有一个或一个以上超过了下界，则可以判断胎儿遗传了母亲的单倍体型2；
n是用于此分类的所有snp位点的统计数；q0是胎儿遗传了母亲单倍体2的情况下，统计出reads来自于单倍体型1的比例；q1是胎儿遗传了母亲单倍体1的情况下，统计出reads来自于单倍体型1的比例。
作为本发明的第二个方面，本发明提供一种检测胎儿地中海贫血致病基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述扩增基因组地贫基因的引物池和用于捕获孕妇血浆中游离dna地贫基因的探针。
作为本发明的第三个方面，本发明还提供上述的试剂盒在制备诊断胎儿地中海贫血疾病的试剂盒中的应用。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、本发明通过目标区域捕获结合高通量测序技术，实现对地贫无创产前检测；
2、本发明的方法所需的样本量少，仅需要5ml的外周血即可实现对样本的基因型准确检测；
3、本发明的方法具有无创性，通过孕妇外周血即可实现对胎儿基因型的准确检测；
4、本发明的方法在对父源突变检测的基础上，可以实现对胎儿母源基因突变的检测。
附图说明
图1为家系1通过生物信息学分析得到的rhdo-sprt图；
图2为家系2通过生物信息学分析得到的rhdo-sprt图；
图3为家系3通过生物信息学分析得到的rhdo-sprt图；
图4为家系4通过生物信息学分析得到的rhdo-sprt图；
图5为家系5通过生物信息学分析得到的rhdo-sprt图。
具体实施方式
本发明提供一种无创产前胎儿α/β型地贫基因突变检测方法，具体包括地贫引物与探针设计，单倍型构建，父源遗传情况分析和母源遗传情况分析，其能够准确、高效地检测胎儿地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测结果一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
样本说明：以下实施例所用的5个家系均收集自中山大学第三附属医院，分别编号为家系1-5，基因型如表1所示，其中包括了α-地贫的常见缺失型别--sea/αα杂合和-α3.7/αα杂合及--sea/-α3.7复合杂合和常见的突变型别αqsα/αα和αcsα/αα，还包括了β-地贫的常见突变型别β0/βn(ivs-2-654)、β0/βn((cd41-42(_cttt))和β+/βn((-28(a>g))，还包括了野生型αα/αα&βn/βn。
表15个地贫家系基因型
实施例1单倍型(即单倍体基因型)的构建
(一)地贫引物与探针设计
针对α-地贫的设计区域(chr16:60022-2233661)：下游(10kb)+hba基因+上游(10kb)，以及针对β-地贫血设计区域(chr11:3236690-7177304)：下游(10kb)+hbb基因+上游(10kp)，再利用dbsnp数据库筛选出snp位点195个α-地贫snp位点和275个β-地贫snp位点。其中snp位点筛选条件：snp位点在千人基因组中国人南方人和北方人数据库中同时maf>＝20％；snp位点上下100bp序列是特异区域，在基因组上没有同源性；并且45％<gc<70％snp位点没有连续3个相同碱基的情况。根据上述筛选的snp位点，通过ampliseqdesigner网站(https://www.ampliseq.com/login/login.action)设计扩增引物对，通过安捷伦suredesign网站(https://earray.chem.agilent.com/suredesign
/index.htm？sessiontimeout＝true)设计捕获探针并从该网站订购，设计的地贫引物和探针只需覆盖到筛选的snp位点即可，引物序列和探针并非唯一。在表2中，列举了20对引物序列(10对hba引物和10对hbb引物)和其对应的snp位点作为示例。snp位点详细信息见表15。
表2筛选的snp位点和设计的对应的引物序列的示例
(二)检测步骤：
样本1-1,1-2,1-3；2-1,2-2，2-3；3-1,3-2,3-3；4-1,4-2,4-3；5-1,5-2,5-3用来单倍型的构建。具体实验步骤如下：
(1)dna提取
按照dneasyblood&tissuekit(50)(厂家：qiagen，货号：69504)试剂盒说明书对200μl的外周血进行基因组dna提取。dna溶液可置于(-20+5)℃保存。
(2)基因组文库构建
取25nggdna，按照ionampliseqtmlibrarykit2.0-96lv(厂家：lifetechnologies，货号:4480441)试剂盒说明书进行文库构建。文库溶液可置于(-20+5)℃保存。
(3)将文库稀释至50pm，将3个文库等量混合，从3个文库混合液中取2μl按照ionpgmtmhiqtmot2reagents200(厂家：lifetechnologies，货号：a26428)和ionpgmtmhiqtmot2solutions200(厂家：lifetechnologies，货号：a26429)的试剂盒说明书进行模板制备和模板富集。
(4)按照ionpgmtmhiqtmsequencing200reagents(厂家：lifetechnologies，货号：a26431)、ionpgmtmhiqtmsequencing200solutions(厂家：lifetechnologies，货号：a26430)和ionpgmtmsequencingnucleotides(厂家：lifetechnologies，货号：a26432)的试剂盒说明书进行上机测序。
(三)单倍型的构建
测序得到平均5mreads的数据量，将人类基因组hg19作为参考序列，通过扩增基因组dna地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，分析目标区域的平均测序深度值，测序深度值(sequencingdepth)≥500，进行下一步分析。利用gatk(3.4版本)将父-母-已育小孩同一染色体上均有信息的位点筛选出来，再以测序深度大于30×，测序碱基质量值大于q20为筛选条件，筛选多态位点。碱基质量值，简称q值，是碱基读取错误率p的取整映射结果。目前，q值与p值的对应关系有两种计算方式：标准sanger变体计算方式以及早期solexa管道(如illuminagenomeanalyzer软件)计算方式。以标准sanger变体方式为例，q值被称为phredqualityscore，它与p值之间的对应关系用以下公式计算得到：测序错误率与q值的简明对应方式如下：q13的碱基错误率为5％，q20的碱基错误率为1％，q30的碱基错误率为0.1％，q40的碱基错误率为0.01％。再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的snp基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上。
实施例2父源遗传情况分析
(一)检测步骤：
样本1-4，2-4，3-4，4-4和5-4用来父源和母源的遗传分析。具体实验步骤如下：
(1)dna提取
按照qiaampcirculatingnucleicacidkit(厂家：qiagen，货号：55114)试剂盒说明书对2ml血浆进行游离dna提取。dna溶液可置于(-20+5)℃保存。
(2)文库构建
按照ionplusfragmentlibrarykit(厂家：lifetechnologies，货号：4471252)和sureselecttargetenrichmentkit(厂家：安捷伦，货号：51906514)试剂盒说明书对dna进行文库构建。文库溶液可置于(-20+5)℃保存。
(3)将文库稀释至50pm，从1个文库稀释液中取2μl按照ionpgmtmhiqtmot2reagents200(厂家：lifetechnologies，货号：a26428)和ionpgmtmhiqtmot2solutions200(厂家：lifetechnologies，货号：a26429)的试剂盒说明书进行模板制备和模板富集。
(4)按照ionpgmtmhiqtmsequencing200reagents(厂家：lifetechnologies，货号：a26431)、ionpgmtmhiqtmsequencing200solutions(厂家：lifetechnologies，货号：a26430)和ionpgmtmsequencingnucleotides(厂家：lifetechnologies，货号：a26432)的试剂盒说明书进行上机测序。
(二)数据分析
测序得到平均10mreads的数据量，将人类基因组hg19作为参考序列，通过捕获游离dna地贫基因的探针位点信息进行序列比对，分析目标区域的平均测序深度值，测序深度值(sequencingdepth)≥500，进行下一步分析。利用gatk(3.4版本)软件将筛选出孕妇血浆的变异位点。其中，挑选基因型为父亲杂合(mn，m和n代表碱基a,t,c,g)母亲纯合(mm)的位点和父亲和母亲均为纯合且基因型不同的位点(父亲mm，母亲nn)，在上述两类位点中，再筛选出孕妇血浆基因型为mn的位点，以此确定是否遗传了父源致病单倍体型。
实施例3母源遗传情况分析
在父源遗传情况分析基础上，进行母源遗传情况分析。挑选出基因型为父亲纯合(mm)母亲杂合的位点(mn)，根据rhdo-sprt确定是否遗传了母源的致病单倍体型，其中，sprt曲线根据以下公式计算：
其中，
upperboundary与lowerbundary分别指的是上界和下界。发明人在此检测方法中把单倍体型1定义为上界，把单倍体型2定义为下界。用sprt的算法，计算筛选出的位点对应深度的总和变异频率的总和。如果筛选出的位点都在上下界之间，那么，则不能分辨出胎儿遗传了母亲的哪一条单倍体型；如果累积的位点中有一个或一个以上超过了上界，则可以判断胎儿遗传了母亲的单倍体型1；如果累积的位点中有一个或一个以上超过了下界，则可以判断胎儿遗传了母亲的单倍体型2。
其中，n是用于此分类的所有位点的统计数；q0是胎儿遗传了母亲单倍体2的情况下，统计出reads来自于单倍体型1的比例；q1是胎儿遗传了母亲单倍体1的情况下，统计出reads来自于单倍体型1的比例。
实施例45个地贫家系检测结果
(1)地贫检测结果
通过实施例2的方法对家系1-5进行检测，家系1-5的单倍型构建结果如表3-7所示。根据孟德尔遗传定律，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上(例如：父亲基因型为mn，母亲基因型为mn，已育小孩基因型为nn(m为致病位点，n为正常位点。m和n代表碱基a,t,c,g)，已育小孩分别遗传了父亲的单倍型1和母亲的单倍型1，则父亲致病位点m在单倍型2上，母亲致病位点m在单倍型2上)。家系1-5的父亲和母亲致病位点关联到单倍型上的结果如表8所示。
表3家系1的单倍型构建结果
表4家系2的单倍型构建结果
表5家系3的单倍型构建结果
表6家系4的单倍型构建结果
表7家系5的单倍型构建结果
表8家系1-5的父亲和母亲致病位点与单倍型的关联结果
通过实施例2和3的方法对家系1-5进行检测，表9-13分别为家系1-5的胎儿父源遗传情况列表。从表9-13可以看出家系1-5的胎儿遗传了父亲单倍体型1；图1-图5分别为家系1-5的rhdo-sprt图。从图1-图5可以看出家系1-5的胎儿遗传了母亲的单倍体型1。综上所述，家系1-5胎儿的地贫检测结果如表14所示。
表9家系1的胎儿父源遗传情况
表10家系2的胎儿父源遗传情况
表11家系3的胎儿父源遗传情况
表12家系4的胎儿父源遗传情况
表13家系5的胎儿父源遗传情况
表14家系1-5胎儿无创地贫检测结果
结果显示，本发明的检测方法对α&β-地贫的临床样本的检测结果(表14)与原始羊水检测型别一致，表明本发明的方法能够准确、高效地实现对α&β-地贫无创产前检测检测，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
表15snp位点信息(其中起始位置相对终止位置减1)
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<110>广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120>检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒
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