本发明涉及实时荧光定量pcr技术领域，具体是一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒。
背景技术：
1992年，higuchi提出实时定量pcr设想。1996年，美国appliedbiosystems公司实现实时定量pcr技术商品化。实时荧光定量pcr技术具有巨大的优势：它实现了pcr从定性到定量的飞跃；自动化的实时荧光定量pcr仪操作简便，使基因检验易于标准化；采用闭管检测，不需要诸如琼脂糖凝胶电泳等pcr后处理，避免了交叉污染。实时荧光定量pcr技术应用广泛，包括病原体的定量监测及药效评价、基因单核苷酸变异(snv)分析、肿瘤基因检测和诊断等，至今仍然是临床基因检验的主流技术，在生物学和医学基础研究、疾病诊断、新药开发、农业、食品、环保等各个领域都被广泛应用。
实时荧光定量pcr技术从原理上主要分为染料法、引物法和探针法三种。
(1)染料法：染料法利用荧光染料与核酸双链的结合来对核酸进行定量，简便易行，不需要探针。能与核酸双链相结合的嵌入型荧光染料主要有sybrgreeni、syto9、bebo、boxto等，它们与核酸双链结合后发出的荧光强度，比游离状态或者与核酸单链结合时强，所以可用于检测定量核酸。
(2)探针法：探针法的理论基础是荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，fret)。当荧光供体分子的发射波长与受体分子的激发波长相重叠时，供体的荧光强度减弱，受体的荧光强度增强，这种现象就是fret。探针法克服了染料法的不足之处，能够区分特异性扩增产物和非特异性扩增产物。荧光探针种类繁多，主要可以分为3类。
(2.1)水解探针。水解探针主要是taqman探针，此外还有taqmanmgb探针、单标记探针等衍生形式。taqman探针的5’端标记报告基团(r)，3’端标记淬灭基团(q)。报告基团种类繁多，常见的有6-羧基荧光素(6-fam)、六氯荧光素(hex)及其衍生物vic、四氯荧光素(tet)、花青素3(cy3)、花青素5(cy5)等等。淬灭基团可以是四甲基罗丹明(tamra)、mgb、黑洞淬灭剂(bhq1、bhq2、bhq3)等等。当探针未与模板结合处于游离状态时，探针结构完整，由于探针的设计长度比较短，r与q接近，二者之间发生荧光共振能量转移，r所发射的荧光被q淬灭。在pcr过程中，由于taqdna聚合酶具有5’->3’外切酶活性，位于上下游引物之间的探针在引物延伸过程中被切断，导致r和q溶解于缓冲液中，相互远离，fret无法完成，r的荧光恢复。taqmanmgb探针与标准taqman探针的差别有两点：第一，其淬灭基团由发光的tamra升级成不发光的nfq(无荧光淬灭基团)，降低了本底，提高了信噪比，从而提高了核酸检测的灵敏度。第二，淬灭基团与探针之间连接有dna小沟结合物mgb，当探针与靶核酸结合时，mgb与dna双链相结合，形成局部三链，从而提升了探针的tm值，增加了探针杂交的特异性。单标记探针只在探针的5’端标记有由带有荧光素的铋螯合物构成的发射基团。铋螯合物游离时发出的荧光比连接有单链寡核苷酸时强。在pcr过程中，铋螯合物被taqdna聚合酶的5’->3’外切酶活性切断而游离出来，发出较强的荧光信号，从而实现对靶核酸的定量分析。
(2.2)发夹探针。主要是分子信标(molecularbeacon)、蝎形探针(scorpion)、sunrise、amplisensor等。分子信标是一种发夹型的茎-环结构，其中环的序列与靶核酸互补，茎的序列与靶核酸无关，而是自身互补形成局部双链。分子信标的5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。当分子信标处于游离状态时，发夹结构的形成导致标记在两个末端的r和q相互靠近，r被淬灭；当分子信标与靶序列结合时，茎杆区被拉开，破坏了fret，r不被淬灭，可检测到荧光。常用的报告-淬灭分子对有：6-fam-dabcyl、tet-dabcyl、tamra-dabcyl、texasred-dabycl等。蝎形探针是分子信标的应用比较广泛的一种衍生形式。它是在分子信标的3’端通过连接臂(扩增阻滞分子，比如六乙二醇heg)连接一段引物，扩增出包含发夹结构的pcr产物。该产物在退火时形成分子内杂交，发夹结构被破坏，报告基团和淬灭基团之间不能发生fret，报告基团发出荧光。
(2.3)杂交探针。有三种形式。1、探针-探针(fret探针)。由两条相邻的探针构成，荧光供体标记在一条探针上，长波长的荧光受体标记在另一条探针上。pcr退火时，两条探针都与靶序列特异性结合，结合后两条探针相隔1-5个碱基，供体与受体之间发生fret，供体荧光强度减弱，受体荧光强度增强，检测受体的荧光信号。2、引物-探针。由一条单标记引物和一条单标记探针构成。距离引物3’端3-6个碱基的t碱基标记供体基团；探针的3’端标记受体基团。探针可与荧光引物扩增出的产物链杂交。杂交时，供体基团和受体基团在相反的链上相距4-6个碱基，发生fret，受体荧光信号增强。3、g淬灭探针。g淬灭探针只用一条单标记的探针。供体基团可以标记在探针的3’或5’端，所标记的供体基团与靶dna上的g重合，靶dna上邻近的g会增强淬灭效果。在杂交时可以观察到荧光的增强或减弱。
(3)引物法：引物法的引物兼起探针的作用，随着引物延伸，通过fret产生荧光信号。引物法可进行多重pcr扩增，主要有amplifluor引物和lux引物两种。
amplifluor引物类似蝎形探针，由引物序列和分子内可形成发夹结构的探针连接组成。游离的探针能够保持荧光信号正常淬灭。在pcr循环过程中，互补链的延伸取代并打开发夹结构，使报告基团和淬灭基团分开，产生荧光信号。
lux(lightuponextension)引物为标记单一荧光基团的寡核苷酸链，不含淬灭基团。某些荧光染料能被邻近的鸟苷酸残基或dna的二级结构所自然淬灭。lux引物需要通过专业的设计软件d-luxdesigner设计，以形成发夹结构，使得荧光基团靠近鸟苷酸残基。当引物掺入到双链pcr产物上时，发夹结构打开，荧光基团不能被淬灭，从而产生信号。
但是上述的实时荧光定量pcr技术仍然存在着各自的缺点，因此，本发明提供了一种基于荧光供体基团(d)和受体基团(a)双标记的引物对之间共振能量转移(fret)机制的荧光核酸检测方法和试剂盒，命名为primobetm，用于核酸实时荧光定量(real-timequantification)，属于实时荧光定量pcr技术领域。本发明包括：1)primobetm的设计方法；2)用primobetm对靶核酸进行实时荧光定量的方法，和3)用primobetm进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒。
基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，也叫forsterresonanceenergytransfer，fret)的原理，primobetm能够实现受体(a)荧光信号强度与pcr产物分子数同步增长的目的。当引物没有与模板退火的时候，primobetm的上游和下游引物在pcr反应体系中处于游离状态，d与a之间距离远，不发生fret，仪器检测到a起始水平的荧光信号；经过退火，上、下游引物分别与靶核酸的3’端和5’端发生序列特异性的分子杂交；经过延伸，上、下游引物分别成为新生成的双链扩增子的一部分，d与a距离接近，发生fret，a发射的荧光信号增强。由于每个模板dna单链分子只能特异性地结合一条primobetm引物，受体所发射信号的强弱与扩增子的分子数成正比，所以primobetm可用于靶核酸的定量检测。在同一反应管中，还可以加入多组用不同荧光标记的primobetm，实现对多个靶基因进行多重定量和管家基因内参校正。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于fret的荧光核酸检测方法，所述试剂盒含有：一组或多组分别标记有荧光供体基团和荧光受体基团的、可用于核酸实时荧光定量的primobetm；含有耐热dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液的pcr反应母液(mastermix)；去离子水；已知浓度的标准品；阴性质控样本；阳性质控样本；
所述primobetm为一组或多组分别标记有荧光供体基团和荧光受体基团的、可用于核酸实时荧光定量的寡核苷酸对；每组用于核酸实时荧光定量的primobetm由2条引物组成；primobetm其中一条引物的任何位置标记荧光受体基团(accepter，a)；primobetm另一条引物的任何位置标记荧光供体基团(donor，d)；在同一个反应体系中，可以加入针对不同靶核酸的多组primobetm，实现多重基因定量。
作为本发明进一步的方案：所述primobetm采用供体发射波长与受体吸收波长存在重叠的成对的荧光供体基团与受体基团。
一种基于fret的荧光核酸检测试剂盒应用于核酸实时荧光定量。
一种基于fret的荧光核酸检测方法，具体检验步骤如下：
(1)采用试剂盒进行检测，混合待测模板dna、primobetm、pcr反应母液(mastermix)，用去离子水找补体积；
(2)对于基因实时定量检验，设置未知样本的重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照；
(3)启动仪器和软件，设置pcr反应参数和荧光信号采集点；
(4)进行pcr循环扩增和信号采集；
(5)对检测结果进行分析，获得核酸实时基因定量信息；
(6)每个批次检测都需要用阴性质控样本和阳性质控样本作为质量控制；对于基因定量检验，每个批次检测都需要用标准品或标准品梯度，生成标准曲线。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中pcr反应参数应用两步法pcr或者三步法pcr。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中荧光供体基团和受体基团标记的primobetm，采用供体发射波长与受体吸收波长存在重叠的成对的荧光供体基团与受体基团。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的设计成功率提高，反应体系中所加入的两条寡核苷酸既是引物，也是探针，是一种双功能分子，既简化了反应体系，又提高了实验设计的成功率；本发明数据精密，荧光信号强度与pcr反应产物的分子数成正比；本发明可多重定量，在同一反应体系中，可以加入多组primobetm，进行多重基因定量；与染料法相比，本发明通过优化引物设计，消除引物二聚体，primobetm可以区分不同的靶核酸；本发明操作简便，完成整个检验流程只需半天时间，速度快；本发明应用广泛，primobetm是一种基础性质的通用方案，既可用于核酸实时荧光定量，也可用于其他各类靶核酸检测。
附图说明
图1为运用primobetm进行核酸实时荧光定量的原理图。
图2为实施例2中实时荧光定量扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种基于fret的荧光核酸检测方法，所述试剂盒含有：一组或多组分别标记有荧光供体基团和荧光受体基团的、可用于核酸实时荧光定量的primobetm；含有耐热dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液的pcr反应母液(mastermix)；去离子水；已知浓度的标准品；阴性质控样本；阳性质控样本；
所述primobetm为一组或多组分别标记有荧光供体基团和荧光受体基团的、可用于核酸实时荧光定量的寡核苷酸对；每组用于核酸实时荧光定量的primobetm由2条引物组成；primobetm其中一条引物的任何位置标记荧光受体基团(accepter，a)；primobetm另一条引物的任何位置标记荧光供体基团(donor，d)；在同一个反应体系中，可以加入针对不同靶核酸的多组primobetm，实现多重基因定量。
一种基于fret的荧光核酸检测试剂盒应用于核酸实时荧光定量。
一种基于fret的荧光核酸检测方法，具体检验步骤如下：
(1)采用试剂盒进行检测，混合待测模板dna、primobetm、pcr反应母液(mastermix)，用去离子水找补体积；
(2)对于基因实时定量检验，设置未知样本的重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照；
(3)启动仪器和软件，设置pcr反应参数和荧光信号采集点；
(4)进行pcr循环扩增和信号采集；
(5)对检测结果进行分析，获得核酸实时基因定量信息。
(6)每个批次检测都需要用阴性质控样本和阳性质控样本作为质量控制；对于基因定量检验，每个批次检测都需要用标准品或标准品梯度，生成标准曲线。
优选的，步骤(3)中pcr反应参数应用两步法pcr或者三步法pcr。
优选的，步骤(1)中荧光供体基团和受体基团标记的primobetm，采用供体发射波长与受体吸收波长存在重叠的成对的荧光供体基团与受体基团。
实施例2
1.以检测人类sry基因为例，设计并合成一组荧光标记的primobetm引物，其序列如下：
上游引物sryf：5’-cgatcagaggcgcaagatggct(fam)c-3’。
下游引物sryr：5’-tctctgagtttcgcattctgggattctct(lc-red640)a-3’。
2.模板及primobetm稀释：
1)未知待测样本的基因组dna置于冰上融化，振荡混匀，稀释至终浓度为5-50ng/μl。
2)sryf和sryr分别用te缓冲液稀释至终浓度均为2.5μm。
3.配制pcr反应体系
1)使用thermofisher出品的96孔光学反应板进行实时荧光定量pcr实验。在规划用于未知样本检测的反应孔中，依次加入如下组分。
2)未知样本重复检测3次，用于检验方法的重复性。
3)以ntc为阴性对照，重复检测2次。ntc即无模板对照(notemplatecontrol)，其反应体系中不含模板dna，但是含有所有其他成分，用于产品的质量控制，监控污染情况。
4)用光学膜把96孔反应板的每个反应孔都密封好，短暂震荡混匀，用板式离心机瞬时离心，把反应液收集到各个反应孔的孔底。
4.实施pcr扩增
将密封且混匀的96孔反应板置于适当型号的实时荧光定量pcr仪中，在软件里设置好各反应参数，按如下程序进行实时荧光定量pcr扩增并采集荧光信号：
检测并记录样品的扩增曲线与阈值。
数据分析：实时荧光定量扩增曲线如附图2所示。横坐标为pcr循环次数，本实施例的pcr一共进行了40个循环；纵坐标为经过校准的荧光信号强度。图中3根s形曲线为阳性样本，2根大致水平的扩增曲线为阴性样本，检验结果符合预期。
本发明的工作原理是：图1primobetm核酸实时荧光定量原理示意图。primobetm由2条引物组成：其中一条引物标记有荧光供体基团(d)，另一条标记有荧光受体基团(a)。经过pcr扩增后，供体基团与受体基团被整合进扩增子，二者距离接近，发生fret，供体发射光能量转移到受体，受体发射荧光信号增强。受体发射信号的强弱与扩增子分子数成正比，所以primobetm可用于靶核酸实时荧光定量。在同一管反应体系中，也可以加入多组用不同颜色的受体荧光基团标记的primobetm，实现对多个靶基因进行多重定量和内参校正。
本发明提供的靶荧光核酸检测方法具有以下优势：1)方案简明，特异性强。与探针法相比，primobetm的两条引物同时起到探针作用，简化了反应体系，提高了实验设计的成功率；与染料法相比，primobetm保持了探针检验的特异性。2)定量精密。荧光信号强度与pcr反应的扩增子分子数成正比。3)应用广泛。primobetm是一种通用性的、基础性的定量pcr技术方案设计，既可用于实时荧光定量，也可用于其他各类靶基因鉴定，在生物学和医学基础研究、农业、疾病诊断、新药开发、食品、环保等领域都具有广阔的应用前景。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110>阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120>一种基于fret的荧光核酸检测方法和试剂盒
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>62
<212>dna
<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
atntnvrsncgatcagaggcgcaagatggctctctctgagtttcgcattctgggattctc60
ta62