本发明涉及生物化学分子生物学领域，具体为具体核酸扩增检测技术，尤其涉及一种用于核酸实时恒温扩增的试剂、扩增体系及其扩增方法和应用。
背景技术：
自1985年聚合酶链式反应(polymerasechianreaction，简称pcr)技术的诞生，极大的促进了核酸检测技术发展。随着酶工艺的成熟，荧光染料出现荧光定量pcr技术在核酸检测领域逐步占主导地位。荧光pcr技术检测核酸时，需要经过反复(约40次)变温过程“95度”～“55～60度”才能实现指数扩增，其扩增量为2n次方。除荧光pcr技术外，有很多恒温扩增技术如nasba、tma、lamp等。
nasba(nuleicandsequercebasedamplipicain，核酸序列依赖性扩增)和tma(transcriptionmediatedamplification，转录介导的扩增技术)技术原理相似，最适合单链rna的扩增，利用rna聚合酶和逆转录酶，由于rna聚合酶的转录单次循环可以产生100～1000拷贝的rna；因此可实现在短时间(15～30分钟)内可将模板扩增约1010倍。
nasba首先在1990年由guatelli提出；1991年，comptonj对此进行了详细的描述。该技术基于禽源成髓细胞瘤逆转录酶(avrienmyeloblastosisvirusreversetranscripts，amv-rt)、rnaseh和t7rna聚合酶，在3种酶的共同作用下，以单链rna为模板进行核苷酸序列的扩增。在两种特殊的引物，dntp(脱氧核糖核苷酸)，ntp(核糖核苷酸)和缓冲液，引物i3'-末端与靶序列互补，5'-端含t7rna多聚酶的启动子，这一引物是用于合成cdna的。rnaseh特异性的切割与单链dna结合的rna，暴露cdna链；这时引物ii的碱基序列与cdna的5'-末端互补在逆转录酶的作用下延伸产生双链dna，它含有t7rna聚合酶的识别序列，并且作为循环相的模板进行rna的指数扩增。
tma技术是由genprobe公司研发的恒温扩增技术，原理与nasba一致，采用逆转录酶moloneymurineleukemiavirus-rt(mmlv-rt)代替amv-rt。tma利用rna聚合酶和逆转录酶(mmlv)在约42度等温反应条件下来扩增核糖体rna的系统。nasba和tma技术，已经广泛应用临床，但这两项技术适合检测单链的rna或dna，限制了应用。lamp技术虽然可以检测dna和rna，但是假阳性和扩增不可控性高，引物结构非常复杂，需要多对引物进行扩增，导致特异性大大降低。
中国专利cn200810111479.0采用t7rna聚合酶和mmlv逆转录酶使用分子信标(molecularbeacon)或takaracycleave探针作为信号系统对靶rna进行实时扩增。中国专利cn200410025890.8则应用mmlv逆转录的5'～3'外切酶活性，在扩增过程实现对taqman探针的水解，从而实现实时荧光检测。但目前并未有任何文献报道采用带逆转录功能的dna聚合酶而不是逆转录酶amv或mmlv的实时荧光恒温扩增技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种新的荧光的恒温扩增技术，实现可控的rna和dna恒温扩增。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是一种用于核酸恒温扩增的试剂，其包括rna聚合酶、带逆转录活性dna聚合酶和rnaseh；其中，所述带逆转录活性dna聚合酶具备5'～3'dna聚合活性和逆转录活性以及5'～3'外切酶活性。
为了进一步优化上述试剂，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，所述带逆转录活性dna聚合酶选自tthdna聚合酶、astaqdna聚合酶、z05dna聚合酶；优选地，所述带逆转录活性dna聚合酶为astaqdna聚合酶或z05dna聚合酶聚合酶；更优选地，所述带逆转录活性dna聚合酶为astaqdna聚合酶。
进一步地，所述rna聚合酶选自t7rna聚合酶、sp6rna聚合酶和t3rna聚合酶；优选地，所述rna聚合酶为t7rna聚合酶。
进一步地，上述用于核酸恒温扩增的试剂还包括引物和荧光探针；其中，所述引物包括带rna启动子识别序列的引物(简称启动子引物，引物i)和第二cdna合成引物(简称引物ii)，所述荧光探针选自taqman探针、molecularbeacon探针；优选地，所述荧光探针为taqman探针。
本发明的第二个目的是提供一种核酸实时恒温扩增体系，其包括任一上述的用于核酸恒温扩增的试剂以及反应液体系。
为了进一步优化上述扩增体系，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，所述反应液体系包括：tricine、醋酸钾、醋酸镁、脱氧核糖核酸(dntps)、核糖核酸(ntps)、dtt、亚精胺、bsa；其中，所述反应液体系的ph值7.8～8.3。
进一步地，所述反应液体系中各组分的终浓度：tricine10mm～30mm；醋酸钾50mm～100mm；醋酸镁3～10mm；dntps0.1～1mm；ntps0.5～1.5mm；dtt3～10mm；亚精胺1mm～3mm；bsa20～40ng。
进一步地，所述引物终浓度为：带rna启动子识别序列的引物0.2～1mm、第二cdna合成引物0.2～1mm；所述探针的终浓度为0.2～0.5mm。
进一步地，在50μl的所述反应液体系中，rna聚合酶的量为50～200u，带逆转录活性dna聚合酶的量为0.5～2u，rnaseh的量为0.1～1u，rnasea抑制剂的量为10～30u。
进一步地，上述扩增体系中，rna聚合酶为t7rna聚合酶，带逆转录活性dna聚合酶为z05taqdna聚合酶或astaqdna聚合酶，探针为taqman探针。
本发明的第三个目的是提供一种任一如上所述核酸实时恒温扩增体系的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、带rna启动子识别序列的引物，在带逆转录活性dna聚合酶的作用下，以rna为模板合成dna链；rnaseh特异性识别并切割与dna结合的rna，暴露单链dna；
步骤二、第二cdna合成引物与单链dna结合，在dna聚合酶作用下延伸，形成带rna启动子识别序列的双链dna；
步骤三、rna聚合酶特异性识别启动子序列，并转录rna，每次转录100～1000copies；
步骤四、带rna启动子识别序列的引物与新转录的rna集合，并在dna聚合酶的作用下延伸，rnaseh识别并切割与dna结合的rna，暴露单链dna，第二cdna合成引物与单链dna结合，在dna聚合酶作用下延伸，整个过程循环重复。
本发明的第四个目的是提供一种任一如上所述核酸实时恒温扩增体系的试剂盒。
进一步地，该试剂盒还包括rna提取试剂盒；具体地，rna提取试剂盒为qiaampviralrnaminikit。
本发明的第五个目的是提供一种任一如上所述核酸实时恒温扩增体系在核酸定量检测中的应用。
进一步地，该应用为一种核酸实时恒温扩增的定量检测方法，其包括如下步骤：待扩增靶标rna提取；在反应液体系中加入引物、探针和astaqdna聚合酶，65度2分钟；50度5分钟后加入t7rna聚合酶；4)50度反应，检测荧光。
更进一步地，上述步骤的具体操作如下：
步骤1)待扩增靶标rna提取；
步骤2)在反应液体系中加入引物、探针、带逆转录活性dna聚合酶、rnaseh和rnasea抑制剂，并将步骤1)提取的rna模板加入，65℃反应2分钟；
步骤3)将反应温度降至50℃，50℃5分钟后加入t7rna聚合酶反应，每隔一预定时间进行荧光检测，并根据检测结果进行分析。
在上述检测方法中，各成分的浓度为如上所述的扩增体系中的浓度。
进一步地，上述应用为丙型肝炎病毒的核酸定量检测方法。
进一步地，在丙型肝炎病毒的核酸定量检测方法中，采用的引物和探针具体如下：
f：gagtagigttgggtigcgaa(seqidno：1)
r：aatttaatacgactcactataggga-gtgcacggtitacgagacctc(seqidno：2)
p：fam-tgcctgatagggtgcttgcgagtgc-bhq1(seqidno：3)
其中下划线标记的是t7rnapolymerase启动子序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明使用rna聚合酶、带逆转录活性dna聚合酶和rnaseh可实现可控的rna和dna恒温扩增，并把该恒温扩增和taqman、molecularbeacon等双标荧光探针技术结合，带逆转录功能的dna聚合酶在逆转录和扩增过程中都能实现对taqman探针水解，因此，本发明可在对靶rna的扩增过程中进行实时荧光检测，并且整个过程在同一反应体系中完成，其可实现核酸的定量检测，具有较好地敏感性和特异性，适于临床推广和应用。
附图说明
图1是本发明核酸实时恒温扩增体系的扩增原理图；
图2是本发明一实施例中采用核酸实时恒温扩增体系进行丙型肝炎病毒核酸定量检测的扩增图谱。
具体实施方式
本发明提供一种用于核酸恒温扩增的试剂，其包括rna聚合酶、带逆转录活性dna聚合酶和rnaseh；其中，所述带逆转录活性dna聚合酶具备5'～3'dna聚合活性和逆转录活性以及5'～3'外切酶活性；该试剂还包括引物和荧光探针，所述引物包括带rna启动子识别序列的引物和第二cdna合成引物，所述荧光探针选自taqman探针、molecularbeacon探针。本发明还涉及含有上述试剂的核酸恒温扩增体系及其扩增方法，以及含有该核酸恒温扩增体系的试剂盒及其应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明所述的核酸实时恒温扩增体系的扩增原理如图1所示，其具体如下：
(1)经试剂盒提取纯化的rna，加入扩增体系中；
(2)带t7rna聚合酶启动子序列的引物i，在带逆转录功能的dna聚合酶的作用下，以rna为模板合成dna链；rnaseh特异性识别并切割与dna结合的rna，暴露单链dna；
(3)第二cdna合成引物(简称引物ii)与单链dna结合，在dna聚合酶作用下延伸，形成双链dna带有t7rna聚合酶启动子序列；
(4)t7rna聚合酶特异性识别启动子序列，并转录rna，每次转录100～1000copies；
(5)引物i与新转录的rna集合，并在dna聚合酶的作用下延伸，rnaseh识别并切割与dna结合的rna，暴露单链dna，引物ii与单链dna结合，在dna聚合酶作用下延伸。整个过程循环重复，可以在短时间内达到几亿次扩增。
实施例1
本实施例为丙型肝炎病毒的核酸定量检测。
(1)试剂：丙型肝炎病毒核酸国家参考品(300012-201302)购自中国食品药品检定研究院；qiaampviralrnaminikit、t7rna聚合酶、astaqdna聚合酶、rnainhibitor和rnaseh都购自苏州斯奈普生物科技有限公司。
(2)引物和探针：
f：gagtagigttgggtigcgaa
r：aatttaatacgactcactataggga-gtgcacggtitacgagacctc
p：fam-tgcctgatagggtgcttgcgagtgc-bhq1
下划线标记的是t7rnapolymerase启动子序列。
(3)rna提取：详细的提取过程，请参照试剂盒说明书。简单介绍如下：取300ul血清，加入1200ulbufferavl，充分混匀15秒后，室温裂解15分钟。加入1200ul无水乙醇或丙三醇，充分混匀15秒。将混合液体800ul移入离心柱(qiaampminicolumn)8000rpm离心1分钟，重复上述操作，直到将所有的液体都过离心柱。加入500ul的aw1buffer清洗一次；加入500ul的aw2buffer，1200rpm离心3分钟后，去除液体后，1200rpm离心3分钟。加入30ul的avebuffer(60度)，8000rpm离心1分钟。
(4)反应液体系(50μl)：tricine20mm、醋酸钾100mm、醋酸镁3.5mm、0.5mm脱氧核糖核酸(dntps)、1.5mm核糖核酸(ntps)、3mmdtt、1mm亚精胺；1urnaseh、5urnasea抑制剂；40ngbsa；0.5mm引物和0.5mm探针；2uastaqdna聚合酶，ph值7.8～8.3。
(5)反应体系中加入20ulrna模板后，盖好盖子，65度2分钟。
(6)将反应温度降至50度，5分钟后加入100ut7rna聚合酶，盖好盖子，每隔1分钟采集荧光，其荧光检测的扩增图谱如图2所示。
(7)结果分析：
①敏感性：检测20iu/ml、50iu/ml和100iu/ml参考品各25次，按95％检出率为最低检测限，本范明所述的方法检测hcvrna，敏感性为20iu/ml，若采用磁珠提取大样本，敏感性还可以提升。
②特异性：检测阴性参考品n1～n10，结果均为阴性，符合率100％。
③线性：检测106﹑105﹑104﹑103﹑102iu/ml线性标准，r2＝0.98。
由上述实施例可知，本发明应用t7rna聚合酶、带逆转录功能的dna聚合酶、rnaseh的恒温荧光定量核酸扩增检测技术，其敏感性和线性比较好，可以进行临床推广。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>上海默礼生物医药科技有限公司
<120>一种用于核酸实时恒温扩增的试剂、扩增体系及其扩增方法和应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>上游引物(artificialsequence)
<400>1
gagtaggttgggtgcgaa18
<210>2
<211>45
<212>dna
<213>下游引物(artificialsequence)
<400>2
aatttaatacgactcactatagggagtgcacggttacgagacctc45
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>探针(artificialsequence)
<400>3
tgcctgatagggtgcttgcgagtgc25